本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及利用與前列腺癌相關(guān)mRNA作為檢測(cè)前列腺癌的標(biāo)志物及其在試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：前列腺癌是常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。世界范圍內(nèi)，前列腺癌發(fā)病率在男性所有惡性腫瘤中位居第二，在美國(guó)前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌，成為第一位危害男性健康的腫瘤。亞洲前列腺癌的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐美國(guó)家，但近年來呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且增長(zhǎng)比歐美發(fā)達(dá)國(guó)家更加迅速。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50歲以后發(fā)病，95％發(fā)生于60歲以上的老年男性，發(fā)生率持續(xù)地隨著年齡增長(zhǎng)而增加。前列腺癌早期多無任何癥狀，即使有所不適，也不足以引起病人的重視，當(dāng)腫瘤增大壓迫尿道時(shí)，又往往與前列腺增生相混淆。在我國(guó)約80％的病人首先發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶才發(fā)現(xiàn)前列腺癌。此時(shí)，病變已達(dá)晚期，預(yù)后不良。前列腺癌的臨床診斷方式目前主要有血清前列腺特異性抗原(PSA)檢測(cè)、直腸指檢、直腸超聲波檢測(cè)、活組織病理檢查等。PSA(ProstateSpecificAntigen)為前列腺組織特異性抗原，由前列腺的解剖結(jié)構(gòu)可知PSA通過前列腺導(dǎo)管進(jìn)入血液和尿液中，一些病例或生理情況下PSA會(huì)進(jìn)入血液中去，如前列腺炎癥、尿潴留、前列腺感染、前列腺增生和前列腺癌等，因此通過檢測(cè)血清PSA水平來預(yù)測(cè)前列腺癌具有一定的假陽(yáng)性率。從1991年開始，檢測(cè)血清中PSA含量用于預(yù)測(cè)前列腺癌，含量高于4ng/mL認(rèn)為是前列腺癌陽(yáng)性，靈敏度79％，特異性20％-59％，平均靈敏度約33％，在濃度4-10ng/mL灰區(qū)部分，特異性是最低的，這時(shí)往往需要通過侵入性的穿刺活檢進(jìn)行確定，給患者帶來極大痛苦及精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。所以PSA并不能較好的作為診斷前列腺癌的標(biāo)志物。直腸指檢是最簡(jiǎn)單、最經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法，主要通過醫(yī)生的食指觸摸前列腺，用以發(fā)現(xiàn)很多無癥狀的前列腺癌患者，有可能獲得早期診斷及根治的機(jī)會(huì)。但以上的方法都存在局限性。例如直腸指檢的局限性主要在4個(gè)方面：(1)患者前列腺腫塊不大時(shí)，易漏診；(2)部分患者前列腺癌腫大不明顯，但已屬于晚期，不易根治；(3)患者直腸有疾患時(shí)不能使用此檢測(cè)；(4)醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)不足時(shí)有漏診或者誤診的可能。近年來的研究表明，mRNA與前列腺癌密切相關(guān)，它們可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，所以對(duì)腫瘤的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、個(gè)體化治療、轉(zhuǎn)移的檢測(cè)和預(yù)后等可能有相應(yīng)的作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了實(shí)現(xiàn)前列腺癌的早期診斷，個(gè)體化治療，本發(fā)明的目的在于提供一種新的前列腺癌mRNA，以及該mRNA的表達(dá)蛋白及其片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的另一目的是前列腺癌相關(guān)mRNA在檢測(cè)前列腺癌中的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種用于前列腺癌檢測(cè)的mRNA標(biāo)志物，所述標(biāo)志物為CCDC42B或該mRNA的表達(dá)蛋白及其片段、類似物和衍生物；所述的CCDC42B或該mRNA的表達(dá)蛋白及其片段、類似物和衍生物在前列腺癌生物學(xué)樣品中表達(dá)下調(diào)。優(yōu)選地，所述標(biāo)志物包括如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，該核苷酸序列為CCDC42B基因的一部分序列。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)個(gè)體患有前列腺癌可能性的試劑盒，所述的試劑盒含有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述試劑盒包括SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的定量檢測(cè)試劑；所述核苷酸序列定量檢測(cè)試劑包括SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的引物。優(yōu)選地，所述試劑盒包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括人正常的前列腺組織或細(xì)胞的總RNA或cDNA。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)前列腺癌相關(guān)mRNA表達(dá)水平是否下調(diào)的方法。(1)檢測(cè)待測(cè)樣品中前列腺癌相關(guān)mRNA的表達(dá)水平，其中所述前列腺癌相關(guān)mRNA是CCDC42B；(2)將待測(cè)細(xì)胞中前列腺癌相關(guān)mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照相比較，從而確定前列腺癌表達(dá)水平是否下調(diào)。優(yōu)選地，所述待測(cè)樣品為細(xì)胞組織樣本。優(yōu)選地，所述的細(xì)胞組織樣品包括前列腺癌組織和癌旁組織。優(yōu)選地，所述的癌旁組織為正常組織。優(yōu)選地，所述檢測(cè)是通過基因芯片檢測(cè)法、熒光定量PCR、蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)法、免疫方法或抗原-抗體檢測(cè)法進(jìn)行。優(yōu)選地，所述免疫方法為ELISA檢測(cè)和/或膠體金檢測(cè)。優(yōu)選地，所述ELISA法為使用ELISA檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括：包被CCDC42B單克隆抗體的固相載體，酶標(biāo)抗體，酶的底物，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照品，稀釋液，洗滌液，酶反應(yīng)終止液等。所述膠體金法為使用檢測(cè)試劑盒，所述的抗體可采用市售的CCDC42B單克隆抗體或多克隆抗體。更優(yōu)選地，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒是采用膠體金免疫層析技術(shù)或膠體金滲濾法。更優(yōu)選地，所述的膠體金檢測(cè)試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)(T)噴點(diǎn)有抗CCDC42B抗體、質(zhì)控區(qū)(C)噴點(diǎn)有免疫球蛋白IgG。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了一種與前列腺癌相關(guān)的CCDC42B，并進(jìn)一步證實(shí)該CCDC42B或該mRNA的表達(dá)蛋白及其片段、類似物和衍生物在前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào)。利用該mRNA檢測(cè)前列腺癌不僅能夠快速有效的做到早期診斷，而且為基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了治療靶點(diǎn)和重要依據(jù)。附圖說明圖1為前列腺癌組織及癌旁組織CCDC42B表達(dá)情況。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購(gòu)買得到。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(第三版)(科學(xué)出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)前列腺癌組織樣本及癌旁組織樣本的mRNA進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行基因篩選，挑選出候選mRNACCDC42B，現(xiàn)有研究中并沒有CCDC42B和前列腺癌相關(guān)的報(bào)道，進(jìn)一步，發(fā)明人進(jìn)行了分子生物學(xué)方法驗(yàn)證，證實(shí)了CCDC42B在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。本發(fā)明的CCDC42B是在本發(fā)明之前的已知mRNA，其基本信息如下：Genbank登錄號(hào)：NCBI參考序列:NM_001144872.1，來源于人類基因組。本發(fā)明還采用RT-PCR方法和基因芯片方法檢測(cè)上述mRNA在前列腺癌組織和癌旁正常組織的表達(dá)，并驗(yàn)證了該mRNA在前列腺癌中表達(dá)下調(diào)。本文使用的術(shù)語“表達(dá)下調(diào)”指對(duì)應(yīng)于所表達(dá)基因的序列，其中序列量的測(cè)量證明，與從正常個(gè)體或從通過前列腺癌分期確定與前列腺癌不同的已鑒定疾病狀態(tài)的個(gè)體中分離的生物學(xué)樣品中的同一基因相比，所述基因在從患前列腺癌或通過前列腺癌分期確定的前列腺癌已鑒定疾病狀態(tài)的個(gè)體中分離的生物學(xué)樣品中的表達(dá)水平降低。根據(jù)本發(fā)明，“表達(dá)下調(diào)”是指通過本發(fā)明方法雜交強(qiáng)度測(cè)量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表達(dá)降低，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更低。實(shí)施例1高通量測(cè)序篩選差異表達(dá)基因1、取樣取2012年10月到2015年12月期間在北京協(xié)和醫(yī)院泌尿外科手術(shù)中獲得組織標(biāo)本27例，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)，其中癌旁組織樣本8例、前列腺癌標(biāo)本19例，編號(hào)后置-80℃低溫冰箱保存。2、對(duì)組織樣本進(jìn)行總RNA提取采用Reagent(invitrogen，貨號(hào)15596-018)進(jìn)行樣本RNA提取，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本成粉末狀后：①加入Trizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時(shí)后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。3、RNA樣品的質(zhì)量分析RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進(jìn)而通過NanoDrop1000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品的提取情況，RNA-seq測(cè)序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。4、高通量測(cè)序測(cè)序平臺(tái)為Illumina公司的HiSeq2500高通量測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序，測(cè)序后我們運(yùn)用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差異基因表達(dá)分析時(shí)，根據(jù)得到的FPKM值，采用國(guó)際公認(rèn)算法EBSeq進(jìn)行差異篩選。其中，篩選時(shí)，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。為了更好的理解差異表達(dá)基因的功能，我們對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了GeneOntology和信號(hào)通路分析，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)分析，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)我們篩選了差異表達(dá)CCDC42B，該mRNA在前列腺癌組織樣本中表達(dá)下調(diào)。實(shí)施例2RT-PCR驗(yàn)證前列腺癌組織及癌旁組織CCDC42B表達(dá)情況1、材料34例前列腺癌組織樣本及8例癌旁組織樣取自北京協(xié)和醫(yī)院2012至2015年期間泌尿外科手術(shù)中前列腺癌樣本，對(duì)其進(jìn)行分組及編號(hào)。所有樣本均經(jīng)過病理學(xué)檢查證實(shí)。2、方法2.1對(duì)組織樣本進(jìn)行總RNA提取，同實(shí)施例1的提取方法。2.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號(hào)18080-044)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對(duì)lμg總RNA進(jìn)行逆反錄合成cDNA。采用25μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總RNA作為模板RNA。將獲得的cDNA樣品稀釋10倍后保存在-20℃冰箱備用。2.3Real-TimePCR2.3.1儀器及分析方法用ABI7500型熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)相對(duì)定量分析。2.3.2引物設(shè)計(jì)采用在線引物設(shè)計(jì)軟件，基因序列參照NCBI:NM_001144872.1(CCDC42B)，內(nèi)參選GAPDH，引物設(shè)計(jì)后由invitrogen公司合成。具體引物序列如下：表1引物序列2.3.3熒光定量PCR擴(kuò)增25μL反應(yīng)體系中按表2依次加入以下成分：表2RealTime反應(yīng)體系組分加入量2×mix10μL上游引物(10uM)0.5μL下游引物(10uM)0.5μL模板2μL加入滅菌蒸餾水至25μL用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，貨號(hào)4367659)分別對(duì)目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃5min，(95℃15sec，61℃45sec)×35個(gè)循環(huán)。同時(shí)在60-95℃進(jìn)行溶解曲線分析。反應(yīng)結(jié)束后，取5ul的PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖電泳，用快速膠回收試劑盒(invitrogen公司)將大小為307bp的片段進(jìn)行切膠回收并測(cè)序，結(jié)果用blast軟件進(jìn)行同源性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，極限平而無上揚(yáng)現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴(kuò)增效率較高；樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴(kuò)增；根據(jù)qRT-PCR的相對(duì)定量公式：2-ΔΔCt×100％，比較CCDC42B在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平。結(jié)果如圖1顯示：與癌旁組織相比，CCDC42B在前列腺癌患組織中的表達(dá)水平僅為癌旁組織中的48％，證明該mRNA表達(dá)下調(diào)；RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后，在ABI3730全自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)序，該307bp的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。用VectorNTIadvance10軟件(Invitrogen公司)將該序列與CCDC42B整個(gè)mRNA序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示，如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列為CCDC42B基因的一部分序列，符合率為100％。實(shí)施例3基因芯片驗(yàn)證前列腺癌組織及癌旁組織樣本CCDC42B表達(dá)情況1、材料的取得，同實(shí)施例2。2、總RNA的提取，同實(shí)施例1的方法。3、基因芯片驗(yàn)證總RNA經(jīng)線性化擴(kuò)增后，cy3-UTP標(biāo)記，熒光標(biāo)記后的cRNAs采用RNEASYMiniKit純化，用Amhion的RNAFragmentationReagents對(duì)標(biāo)記好的cRNAs進(jìn)行片段化處理。采用美國(guó)Agilent公司的人全基因表達(dá)譜芯片(4x44K基因)，在芯片雜交爐中65℃雜交17h，然后洗脫、染色，最后用AgilentDNAMicroarrayScanner掃描儀掃描。雜交后的芯片經(jīng)芯片掃描儀讀取數(shù)據(jù)點(diǎn)后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件，對(duì)于兩組比值的自然對(duì)數(shù)絕對(duì)值大于2.0或小于0.5的mRNA作為差異表達(dá)mRNA。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，P<0.05差異有顯著意義。結(jié)果顯示，與癌旁組織樣本相比，前列腺癌組織樣本中CCDC42B的mRNA水平僅為50％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)施例4前列腺癌檢測(cè)試劑盒基于實(shí)施例2得到的引物組，組裝本發(fā)明所述的用于前列腺癌的試劑盒，所述試劑盒包括特異擴(kuò)增如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的引物對(duì)如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示，和特異擴(kuò)增內(nèi)參基因(GAPDH)的引物對(duì)如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示；還包括SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，如PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs。所述PCR緩沖液的成分為25mMKCL，2.5mMMgCL2，200mM(NH4)2SO4。通過對(duì)引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，最終確定反應(yīng)體系如表3所示：表3PCR反應(yīng)體系組分加入量SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μL模板cDNA2.0μL加入滅菌蒸餾水至25μL最佳反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，(95℃變性15sec，61℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40個(gè)循環(huán)，72℃延伸15min。取待檢測(cè)病人白某某的少量前列腺細(xì)胞，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從前列腺細(xì)胞中提取RNA，使用試劑盒中試劑，按照最佳反應(yīng)體系與條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用試劑盒中正常癌旁組織cDNA作為Real-TimePCR定量檢測(cè)中的對(duì)照cDNA，檢測(cè)組織樣本如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列相對(duì)正常癌旁組織表達(dá)量變化。檢測(cè)結(jié)果，與正常癌旁組織相比，如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列在該檢測(cè)病人前列腺細(xì)胞表達(dá)水平僅為癌旁組織中的48％。經(jīng)臨床進(jìn)一步檢測(cè)，該例病人確定患有前列腺癌，臨床檢測(cè)結(jié)果與本發(fā)明制備的試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致。據(jù)此推斷，本前列腺癌的診斷試劑盒可以明確區(qū)分出前列腺癌患者，并以此為臨床提供診斷線索。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3