本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及LOC100130238作為檢測前列腺癌的分子標(biāo)記物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：前列腺癌是發(fā)生于男性前列腺組織中的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)已經(jīng)成為男性第二大類常見腫瘤，位于癌癥相關(guān)死亡率第六位。在歐美等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)，它是男性最常見的惡性腫瘤，其死亡率居各種癌癥的第二位；在亞洲，其發(fā)病率低于西方國家，但近年來呈迅速上升趨勢，且增長比歐美發(fā)達(dá)國家更加迅速。我國前列腺癌發(fā)病率也在逐年提高，已位于男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位，僅次于膀胱癌和腎癌。前列腺癌一般在50歲以后發(fā)病，95％發(fā)生于60歲以上的老年男性，發(fā)生率持續(xù)地隨著年齡增長而增加。前列腺癌早期多無任何癥狀，即使有所不適，也不足以引起病人的重視，當(dāng)腫瘤增大壓迫尿道時(shí)，又往往與前列腺增生相混淆。在我國約80％的病人首先發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶才發(fā)現(xiàn)前列腺癌。此時(shí)，病變已達(dá)晚期，預(yù)后不良。所以，前列腺癌的早期診斷對前列腺癌病人的治療有極為重大的意義。目前前列腺癌的臨床診斷方式目前主要有前列腺直腸指檢(DRE)、血清前列腺特異性抗原(PSA)檢測、直腸超聲波檢測、活組織病理檢查等。直腸指檢是前列腺癌診斷的經(jīng)典技術(shù)，主要通過醫(yī)生的食指觸摸前列腺，以判斷前列腺結(jié)節(jié)的大小和形狀，從而判斷是否患有前列腺癌。但直腸指檢的局限性也很強(qiáng)：(1)患者前列腺腫塊不大時(shí)，易漏診；(2)部分患者前列腺癌腫大不明顯，但已屬于晚期；(3)患者直腸有疾患時(shí)不能使用此檢測；(4)醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)不足時(shí)可能有漏診或者誤診的可能。前列腺超聲波檢測雖然操作簡單直觀、無損傷，但該方法容易與前列腺炎和前列腺肥大混同，已不再用于前列腺癌分期診斷?；罱M織病理檢查因其創(chuàng)傷性、復(fù)雜性不能作為初篩的手段，但它是前列腺癌確診的金標(biāo)準(zhǔn)，一般與其他方法技術(shù)連用。目前對前列腺癌的篩查診斷主要依靠血清PSA檢測和前列腺穿刺病理活檢相結(jié)合的方法。正常情況下血液中的PSA不高(不高于4ng/ml)，當(dāng)處于前列腺癌及其他前列腺疾病患病狀態(tài)時(shí)，PSA升高成為目前篩查前列腺癌最敏感的瘤標(biāo)，但PSA增高也常見與非前列腺癌疾病，如前列腺炎癥、前列腺增生等多重泌尿系統(tǒng)疾病有關(guān)，因此不易確診，甚至可能導(dǎo)致疾病的誤檢、誤診或者病情的延誤。此外，PSA增高確診前列腺癌時(shí)，往往患者已經(jīng)屬于中后期，達(dá)不到早期診斷的目的。而穿刺活檢的檢出率與活體穿刺的次數(shù)、位置都有較大關(guān)系，不是非常穩(wěn)定的診斷方案。因此，研究更有效的前列腺癌標(biāo)記物對提高前列腺癌的早期診斷及為患者制定合理的個(gè)體化治療方案，減少前列腺癌患者死亡率和改善生活質(zhì)量有重要的意義，如果能有一種檢測試劑盒，可以提高前列腺癌的檢出率和準(zhǔn)確率，對于前列腺癌的臨床治療有著重大的意義。LOC100130238屬于lncRNA(longnon-codingRNA，長鏈非編碼RNA)，是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200bp核苷酸的非編碼RNA，近年研究發(fā)現(xiàn)它是一類具有重要生物學(xué)功能的RNA，參與基因組印記、染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程，在細(xì)胞分化和發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、遺傳和表觀遺傳等生命活動(dòng)中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。近年來，越來越多的權(quán)威研究證實(shí)lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著抑制或促進(jìn)腫瘤的作用，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移能力等方面，均具有十分重要作用。目前己有較多l(xiāng)ncRNAs被證實(shí)在包括乳腺癌、前列腺、黑色素瘤、肝癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等在內(nèi)的人類多種腫瘤中存在差異表達(dá)并執(zhí)行重要的調(diào)控功能。早期有效檢測腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及提高抗癌藥物的療效對于癌癥的治療尤為重要，發(fā)明新型腫瘤標(biāo)志物作為診斷與治療的靶點(diǎn)一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)。近年來的研究表明，lncRNA與前列腺癌密切相關(guān)，它們可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，所以對腫瘤的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、個(gè)體化治療、轉(zhuǎn)移的檢測和預(yù)后等可能有相應(yīng)的作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了實(shí)現(xiàn)前列腺癌的早期發(fā)現(xiàn)，早期干預(yù)，本發(fā)明的目的在于提供一種與前列腺癌相關(guān)的新的分子標(biāo)記物。本發(fā)明的第二目的是提供一種治療前列腺癌的制劑。本發(fā)明的第三目的是提供所述的制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四目的是提供一種前列腺癌診斷試劑盒。本發(fā)明的第五目的是提供所述分子標(biāo)記物在前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療、監(jiān)測及預(yù)后中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種檢測前列腺癌的分子標(biāo)記物，所述分子標(biāo)記物為LOC100130238，其核苷酸序列為SEQIDNO:1所示。優(yōu)選的，所述分子標(biāo)記物L(fēng)OC100130238包含如SEQIDNO:2所示的特異核苷酸序列。本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)LOC100130238在前列腺癌生物學(xué)樣品中表達(dá)上調(diào)，顯示LOC100130238與前列腺癌的腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在著密切的相關(guān)性。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種治療前列腺癌的制劑，所述制劑中含有抑制LOC100130238表達(dá)的試劑。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了所述的制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述制劑制備的藥物包括LOC100130238的siRNA。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種前列腺癌診斷試劑盒，所述診斷試劑盒含有擴(kuò)增如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的引物對。優(yōu)選的，所述的前列腺癌診斷試劑盒，其特征在于包括定量PCR反應(yīng)體系：(1)特異擴(kuò)增如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列和對照GAPDH兩對引物；檢測如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的引物序列如下：上游引物序列：SEQIDNO:3下游引物序列：SEQIDNO:4對照GAPDH的引物序列如下：上游引物序列：SEQIDNO:5下游引物序列：SEQIDNO:6(2)SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，包括PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs等。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了該分子標(biāo)志物或診斷試劑盒在前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療、監(jiān)測及預(yù)后中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述應(yīng)用是通過檢測被試者組織樣本中LOC100130238的含量，并與正常水平LOC100130238的含量相比較，以進(jìn)行前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療、監(jiān)測及預(yù)后。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開了一種檢測前列腺癌的分子標(biāo)記物L(fēng)OC100130238，并進(jìn)一步證實(shí)LOC100130238在前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)。利用該分子標(biāo)記物檢測前列腺癌不僅能夠快速有效的做到早期檢測，而且為基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了治療靶點(diǎn)和重要依據(jù)。附圖說明圖1本發(fā)明中實(shí)施例2中前列腺癌組織樣本中LOC100130238表達(dá)上調(diào)；圖2本發(fā)明中實(shí)施例4中LOC100130238-siRNA顯著抑制前列腺癌細(xì)胞增殖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。本發(fā)明的發(fā)明人對10例前列腺癌組織樣本及對應(yīng)癌旁組織樣本進(jìn)行高通量測序，結(jié)合生物信息學(xué)方法進(jìn)行基因篩選，挑選出候選lncRNALOC100130238，現(xiàn)有研究中并沒有LOC100130238和前列腺癌相關(guān)的報(bào)道，進(jìn)一步，發(fā)明人進(jìn)行了分子生物學(xué)方法驗(yàn)證，證實(shí)了LOC100130238在前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，其相關(guān)制劑可用于治療前列腺癌。本發(fā)明的LOC100130238是在本發(fā)明之前的已知lncRNA，其基本信息如下：Genbank登錄號(hào)：GeneID:100130238，來源于人類基因組。本發(fā)明采用RT-PCR方法檢測上述lncRNA在前列腺癌患者和正常人群中的表達(dá)，并驗(yàn)證了該lncRNA在前列腺癌患者中表達(dá)上調(diào)。熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板的初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對定量。多種檢測系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實(shí)驗(yàn)的選擇性更強(qiáng)。自動(dòng)化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。CCK-8法是一種新型的檢測細(xì)胞增殖的方法。與MTT比色法不同的是它的檢測原理為活細(xì)胞線粒體脫氫酶轉(zhuǎn)化的黃色結(jié)晶為高度水溶性，不需要裂解細(xì)胞，可直接進(jìn)行比色。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，參比波長為600-650nm。該方法已廣泛用于細(xì)胞增殖測定、抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤藥敏感試驗(yàn)。它的特點(diǎn)是操作簡便，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑，檢測靈敏度高，對細(xì)胞毒性小，重復(fù)性優(yōu)于MTT法。本發(fā)明LOC100130238的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA作為模板，擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次擴(kuò)增，然后再將多次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。實(shí)施例1高通量測序篩選差異表達(dá)基因1、取樣選取10例新鮮前列腺癌組織及對應(yīng)癌旁組織，取樣來源于北京協(xié)和醫(yī)院2012年10月到2015年12月期間行根治性前列腺切除并雙側(cè)盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的前列腺癌病人，手術(shù)切除前列腺后在病理科醫(yī)生的指導(dǎo)下立即取前列腺癌及癌旁組織放入液氮，編號(hào)后置-80℃低溫冰箱保存。2、對組織樣本進(jìn)行總RNA提取采用Reagent(invitrogen，貨號(hào)15596-018)進(jìn)行樣本RNA提取，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織樣本放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本成粉末狀后：①入1mLTrizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時(shí)后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。3、RNA樣品的質(zhì)量分析RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進(jìn)而通過NanoDrop1000分光光度計(jì)檢測RNA樣品的提取情況，RNA-seq測序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。4、高通量測序測序平臺(tái)為Illumina公司的HiSeq2500高通量測序平臺(tái)，進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組深度測序，測序后我們運(yùn)用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差異基因表達(dá)分析時(shí)，根據(jù)得到的FPKM值，采用國際公認(rèn)算法EBSeq進(jìn)行差異篩選。其中，篩選時(shí)，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。為了更好的理解差異表達(dá)基因的功能，我們對差異表達(dá)基因進(jìn)行了GeneOntology和信號(hào)通路分析，并對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)我們篩選了差異表達(dá)LOC100130238，LOC100130238在前列腺癌樣本組織中表達(dá)上調(diào)。實(shí)施例2RT-PCR驗(yàn)證前列腺癌組織中LOC100130238表達(dá)情況1、材料選取10例前列腺癌患者，取樣來源于北京協(xié)和醫(yī)院2012年10月到2015年12月期間行根治性前列腺切除并雙側(cè)盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的前列腺癌病人，手術(shù)切除前列腺后在病理科醫(yī)生的指導(dǎo)下立即取前列腺癌及癌旁組織放入液氮，編號(hào)后置-80℃低溫冰箱保存。2、方法2.1對被試者組織樣本進(jìn)行總RNA提取，同實(shí)施例1的提取方法。2.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號(hào)18080-044)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lμg總RNA進(jìn)行逆反錄合成cDNA。采用25μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總RNA作為模板RNA。獲得的cDNA保存放-20℃冰箱備用。2.3、Real-TimePCR2.3.1儀器及分析方法用ABI7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)相對定量分析。2.3.2引物設(shè)計(jì)采用在線引物設(shè)計(jì)軟件，基因序列參照NCBI:NR_024563.1(LOC100130238)，內(nèi)參選GAPDH，引物設(shè)計(jì)后由invitrogen公司合成。具體引物序列如表1所示：表1引物序列操作過程如下：(一)反應(yīng)體系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，貨號(hào)4367659)進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃5min，(95℃15sec，61℃45sec，72℃35sec)×40個(gè)循環(huán)。表2RealTime反應(yīng)體系(二)引物篩選將各樣本cDNA混合后，以此為模板進(jìn)行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在60-95℃進(jìn)行融解曲線分析，根據(jù)擴(kuò)增效率高和溶解曲線單峰原則進(jìn)行引物篩選。(三)樣品RealTime-PCR檢測將各樣品cDNA10倍稀釋后取2μL作模板，分別對目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)在60-95℃進(jìn)行溶解曲線分析。(四)瓊脂糖電泳上述反應(yīng)結(jié)束后，取5μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖電泳，用快速膠回收試劑盒(invitrogen公司)將大小為287bp的片段進(jìn)行切膠回收并測序，結(jié)果用blast軟件進(jìn)行同源性分析。(五)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，極限平而無上揚(yáng)現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴(kuò)增效率較高；樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴(kuò)增；根據(jù)qRT-PCR的相對定量公式：2-ΔΔCt×100％，比較LOC100130238在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，其中LOC100130238在前列腺癌組織中的表達(dá)水平為對照組織的3.5倍，如圖1所示。以上結(jié)果驗(yàn)證了高通量轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)的整合分析LOC100130238在前列腺癌患者中表達(dá)上調(diào)的結(jié)果。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后，在ABI3730全自動(dòng)測序儀上測序，該287bp的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。用VectorNTIadvance10軟件(Invitrogen公司)將該序列與LOC100130238整個(gè)mRNA序列進(jìn)行比對，比對結(jié)果顯示，如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列為LOC100130238的一部分序列，符合率為100％。實(shí)施例3RNAi干擾LOC100130238表達(dá)一、材料(一)細(xì)胞來源市售前列腺癌PC-3細(xì)胞系(采購于上海博研生物科技有限公司)。(二)siRNA設(shè)計(jì)與合成依據(jù)在線設(shè)計(jì)軟件siDirectversion2.0(http://design.rnai.jp/)，根據(jù)基因序列參照NCBI:NR_024563.1(LOC100130238)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的siRNA，具體序列見表3。設(shè)計(jì)后送往合成公司合成。表3siRNA序列列表二、實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染1.細(xì)胞分組C組：空白對照組；C1組：轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體組；C2組：轉(zhuǎn)染非特異性的siRNA組；S1，S2，S3組：轉(zhuǎn)染特異性的siRNA組。2.轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000TransfectionReagent提供的步驟進(jìn)行。(1)將前列腺癌PC-3細(xì)胞系接種在6孔板上，這些用于初期接種的細(xì)胞數(shù)量，應(yīng)能在24小時(shí)內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70％；(2)準(zhǔn)備siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物:a.以250uLOpti-MEM稀釋5μL的LipofectamineTM2000，輕輕混勻，室溫下孵育5分鐘。b.實(shí)驗(yàn)各組分別取5uL20μM/LsiRNA加入250uLOpti-MEM中進(jìn)行稀釋，并輕輕搖動(dòng)將其混勻；c.孵育5分鐘后，將稀釋的siRNA和LipofectamineTM2000混合后在室溫下孵育20分鐘。(3)在培養(yǎng)板中的每個(gè)孔中均勻加入細(xì)胞、培養(yǎng)基及siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物。然后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板，使他們充分混合；(4)放置在37℃，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48小時(shí)，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染數(shù)量，檢測轉(zhuǎn)染效率；(5)轉(zhuǎn)染效率為熒光鏡與光鏡視野中的細(xì)胞數(shù)量的比值，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到90％以上，方可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。計(jì)算公式如下：轉(zhuǎn)染效率＝發(fā)熒光細(xì)胞的數(shù)量/相同視野下的細(xì)胞數(shù)量×100％3.應(yīng)用Real-timePCR方法檢測轉(zhuǎn)染前后LOC100130238表達(dá)的變化(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建：選取在50mLPC-3細(xì)胞1瓶，提取RNA，測定RNA濃度和純度，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將反應(yīng)生成的DNA模板十倍稀釋，得到相當(dāng)于104-101copies/μL的DNA模板，分別加入LOC100130238基因引物和內(nèi)參引物，配制25μL反應(yīng)體系，使用Real-timePCR擴(kuò)增儀，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。得到LOC100130238和內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)Real-timePCR方法檢測轉(zhuǎn)染前后LOC100130238基因表達(dá)的變化：提取各組細(xì)胞的RNA，測定RNA濃度和純度，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，每組DNA模板同時(shí)進(jìn)行LOC100130238和內(nèi)參的Real-timePCR反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。(3)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別3條LOC100130238的siRNA及對照siRNA轉(zhuǎn)染第一代前列腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示在大量前列腺癌細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)綠色熒光，證明前列腺癌細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)得到了siRNA的轉(zhuǎn)染，然后在熒光鏡和光鏡下觀察前列腺癌細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率的檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染率均達(dá)到90％以上。Real-timePCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染非特異性的siRNA組對前列腺癌PC-3細(xì)胞中LOC100130238表達(dá)無明顯抑制作用，和空白對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，轉(zhuǎn)染的3個(gè)LOC100130238siRNA組都對前列腺癌細(xì)胞中LOC100130238表達(dá)起到一定抑制作用抑制率為46％，其中LOC100130238-siRNA2和LOC100130238-siRNA3抑制效果最明顯，抑制率達(dá)55％和68％。實(shí)施例4CCK-8法檢測前列腺癌細(xì)胞的增殖情況細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染(以六孔板為例)，轉(zhuǎn)染方法同實(shí)施例3。二、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)1.細(xì)胞消化后重懸，接種于96孔板中，每孔加入約1×104細(xì)胞。2.按照實(shí)驗(yàn)分組：空白對照組、前列腺癌細(xì)胞加非特異性的siRNA組、前列腺癌細(xì)胞加LOC100130238-siRNA3組，每組6個(gè)重復(fù)。3.實(shí)驗(yàn)條件為37℃，5％CO2及100％濕度。4.接種0h、24h、48h后，每孔分別加入10ulCKK-8試劑，并在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2小時(shí)。5.將酶標(biāo)儀波長設(shè)定為570nm，檢測每個(gè)孔的光吸收值(OD)，參比波長630nm(600-650nm)。7.以各孔光吸收值減去空白孔光吸收值的平均值作為實(shí)際光吸收值，取平均值，以0h、24h、48h時(shí)間點(diǎn)光吸收值作曲線，反映細(xì)胞的增殖情況。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，siRNA-NC表示前列腺癌細(xì)胞加非特異性的siRNA實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖的情況，si-LOC100130238表示前列腺癌細(xì)胞加LOC100130238-siRNA3實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖的情況，兩者對比可以看出LOC100130238-siRNA3顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，可用于前列腺癌藥物的制備。實(shí)施例5試劑盒的制備基于實(shí)施例2得到的引物組，組裝本發(fā)明所述的用于檢測前列腺癌的試劑盒，所述試劑盒包括特異擴(kuò)增LOC100130238的引物對如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示，和特異擴(kuò)增管家基因(GAPDH)的引物對如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示；還包括SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，如PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs。所述PCR緩沖液的成分為25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4；還包括前列腺正常組織cDNA：作為陰性對照與檢測樣本cDNA共同定量PCR檢測，每個(gè)反應(yīng)體系使用與檢測樣本cDNA相同量。通過對引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，最終確定反應(yīng)體系如表3所示：表3PCR反應(yīng)體系組分加入量SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μL上游引物(10μM)1.0μL下游引物(10μM)1.0μL模板cDNA2.0μL加入滅菌蒸餾水至25μL最佳反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，(95℃變性15sec，61℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40個(gè)循環(huán)，72℃延伸15min。實(shí)施例6本前列腺癌的診斷試劑盒的應(yīng)用1、病例選取20例待篩查的前列腺癌患者，取樣來源于北京協(xié)和醫(yī)院2012年10月到2015年12月期間泌尿科治療的病人。獲取所有研究對象的前列腺癌組織樣本，編號(hào)后置-80℃低溫冰箱保存。本研究的所有臨床樣本，均對患者進(jìn)行知情告知并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。2、方法使用常規(guī)方法或使用特定的試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用實(shí)施例5中的試劑盒進(jìn)行檢測反應(yīng)。以試劑盒中前列腺正常組織cDNA作為QPCR定量檢測中的對照cDNA，檢測組織樣本中的LOC100130238相對前列腺正常組織表達(dá)量變化。3、結(jié)果通過溶解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCt法進(jìn)行相對定量，樣本和對照間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。結(jié)果顯示，待篩查的20例前列腺癌患者的組織樣本中有8例患者組織樣本中LOC100130238的表達(dá)量和前列腺癌正常組織表達(dá)量無顯著差異；有12例患者組織樣本中LOC100130238的表達(dá)量是前列腺癌正常組織表達(dá)量的1倍以上，其中有9例患者組織樣本中LOC100130238的表達(dá)量是前列腺癌正常組織表達(dá)量的3倍以上。經(jīng)臨床進(jìn)一步檢測，20例待篩查的患者中確診9例前列腺癌，這9例前列腺癌患者與本發(fā)明制備的試劑盒檢測結(jié)果一致。據(jù)此推斷，本前列腺癌的診斷試劑盒可以明確區(qū)分出前列腺癌患者，并以此為臨床提供診斷線索。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3