本申請涉及禽流感等家禽免疫抑制性病原體的檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種用于禽流感等家禽免疫抑制性病原體多重檢測的試劑、檢測方法及應用。
背景技術(shù)：
：家禽的免疫抑制性病原體有很多種，除了馬立克氏病毒1型(MDV)、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性貧血病毒以外，J亞型禽白血病病毒、新城疫病毒和禽流感病毒也能產(chǎn)生很強的免疫抑制作用。雞傳染性法氏囊病，又稱甘波羅病，是由傳染性法氏囊病毒(InfectiousBursalDiseaseVirus，縮寫IBDV)引起的一種急性、接觸傳染性疾病。以法氏囊發(fā)炎、壞死、萎縮和法氏囊內(nèi)淋巴細胞嚴重受損為特征。從而引起雞的免疫機能障礙，干擾各種疫苗的免疫效果。發(fā)病率高，幾乎達100％，死亡率一般為5％～15％，但現(xiàn)在流行的通過變異產(chǎn)生的超強毒株死亡率達到60％-100％，是目前養(yǎng)禽業(yè)最重要的疾病之一。雞傳染性貧血病是由雞傳染性貧血病毒(AvianInfectiousAnaemiaVirus，縮寫CIAV)引起的，是雞的一種免疫抑制病。該病以再生障礙性貧血、淋巴器官組織萎縮、皮下和肌肉出血、泛血細胞減少為特征；本病存在于所有主要養(yǎng)禽業(yè)國家。1979年首次于日本報道，中國于1992年首次分離到該病病毒隨后周文平等在河南、山東、江蘇、遼寧、吉林等地的雞群中也陸續(xù)分離到CIAV。此病通過垂直與水平傳播引起臨床與亞臨床感染；使雞只對馬立克病毒(MDV)、網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞增生病毒(REV)、法氏囊病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)、腺病毒、呼吸道和消化道感染病毒等的易感性增強，甚至導致免疫失效。雞傳染性貧血病及其誘發(fā)的疾病每年為養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。J亞型禽骨髓性白血病是由J亞型禽白血病病毒(AivanLeukosisVirussubgroupJ，縮寫ALV-J)引起的一種主要發(fā)生于肉用型雞的傳染病。其主要引起雞的骨髓細胞瘤。該病于1988首次發(fā)現(xiàn)于英國，隨后許多國家和地區(qū)均有該病的報道。我國也于1999年首次分離到了ALV-J。該病毒的致病性試驗表明，其不僅通過髓細胞瘤在肉雞引起較高死亡率外，還可引起雞體質(zhì)量嚴重下降，雛雞感染后其生長性能降低。其可通過水平傳播和垂直傳播迅速地感染整個雞群，使雞群在短時間內(nèi)遭受滅頂之災。馬立克氏病是由皰疹病毒科雞皰疹病毒2型，或稱馬立克氏病毒1型(SerotypeIMarek'sDiseaseVirus)，引起的一種傳染性腫瘤病。該病于1907年由匈牙利獸醫(yī)病理學家馬立克首次發(fā)現(xiàn)，是國外50年代以來最受重視的雞病，呈世界性分布，以淋巴組織增生和腫瘤形成為特征，產(chǎn)生免疫抑制，干擾各種疫苗的免疫效果。病毒經(jīng)空氣傳播，傳染力強，被感染雞產(chǎn)生腫瘤和死亡，對養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。新城疫(newcastledisease，縮寫ND)是由新城疫病毒(縮寫NDV)引起的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病。以高熱、呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜和漿膜出血為特征。具有很高的發(fā)病率和病死率，是危害養(yǎng)禽業(yè)的一種主要傳染病。OIE將其列為A類疫病。禽流感，俗稱“雞瘟”，是由禽流感病毒(AIV)引起的家禽疾病，發(fā)病率和死亡率都很高。流感病毒屬于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3個型；禽流感病毒屬于甲型流感病毒，多發(fā)于禽類，部分甲型流感病毒也可感染豬、馬、海豹和鯨等各種哺乳動物及人類。甲型流感病毒呈多形性，其中球形直徑80～120nm，有囊膜?；蚪M為分節(jié)段單股負鏈RNA。依據(jù)其外膜血凝素(H)/和神經(jīng)氨酸酶(N)蛋白抗原性的不同，可分為16個H亞型(H1～H16)和9個N亞型(N1～N9)。感染人的禽流感病毒亞型主要為H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。現(xiàn)有的家禽禽流感等免疫抑制性病原體的檢測方法主要有分離培養(yǎng)、電鏡檢查、瓊脂擴散試驗、病毒中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗等方法；但這些檢測方法不是存在耗時長、操作繁瑣，就是特異性差等缺點。因此，亟需建立一種快速、準確的針對禽免疫性抑制相關(guān)病毒的檢測方法，以減小家禽禽流感等免疫抑制性病原體對養(yǎng)殖業(yè)造成的損失，提高家禽養(yǎng)殖生產(chǎn)的安全性。技術(shù)實現(xiàn)要素：本申請的目的是提供一種用于家禽禽流感等免疫抑制性病原體多重檢測的試劑，基于該檢測試劑的多重檢測方法，以及該檢測試劑和方法的應用。本申請采用了以下技術(shù)方案：本申請的一方面公開了一種用于家禽禽流感等免疫抑制性病原體多重檢測的試劑，該試劑包括六條特異性探針，六條特異性探針分別為SeqIDNo.1所示序列的禽流感病毒特異性探針、SeqIDNo.2所示序列的新城疫病毒特異性探針、SeqIDNo.3所示序列的馬立克氏病毒1型特異性探針、SeqIDNo.4所示序列的傳染性法氏囊病毒特異性探針、SeqIDNo.5所示序列的雞傳染性貧血病毒特異性探針，以及SeqIDNo.6所示序列的J亞型禽白血病病毒特異性探針；SeqIDNo.1：5’-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA-3’SeqIDNo.2：5’-TTCTCTAGCAGTGGGACAGCCTGC-3’SeqIDNo.3：5’-ACCGCCCCAAATTCGCACTTGA-3’SeqIDNo.4：5’-CAACCGGACCGGCGTCCATTC-3’SeqIDNo.5：5’-CACCTCAAGCGACTTCGACGAA-3’SeqIDNo.6：5’-ATTTCCGTTGTCCCAGGGGTGG-3’。本申請的禽流感等家禽免疫抑制性病原體多重檢測試劑，即用于包括禽流感在內(nèi)的六種禽免疫抑制性病原體多重檢測的試劑。需要說明的是，本申請經(jīng)過大量的研究和實踐，最終研制出針對六種比較重要的包括家禽禽流感在內(nèi)的六種免疫抑制性病原體的多重檢測試劑，即六種家禽免疫抑制性病原體的特異性探針；可以理解，這六條特異性探針作為一個有機結(jié)合的整體，可以一起使用，以對六種家禽免疫抑制性病原體進行多重檢測，當然，在一些特殊的使用環(huán)境下，也可以單獨使用其中一條或幾條特異性探針。還需要說明的是，本申請的六條特異性探針能夠特異性的結(jié)合到六種家禽免疫抑制性病原體的核酸上，因此，在本申請的一種應用方式中，將這六條特異性探針用于液相芯片，與液相芯片的微球偶聯(lián)，以實現(xiàn)六種家禽免疫抑制性病原體的多重液相芯片檢測。可以理解，既然本申請的六條特異性探針具有很強的特異性，因此，也可以設計適當?shù)囊?，用于實時熒光PCR；或者，用于基因芯片作為捕獲探針，在此不做具體限定。優(yōu)選的，本申請的用于家禽禽流感等免疫抑制性病原體多重檢測的試劑，六條特異性探針中，每條特異性探針的5’端都具有胺基修飾。在本申請的一種實現(xiàn)方式中，5’端胺基修飾，具體的，是在5’端第一個堿基的第12位碳基上連接胺基-NH2。優(yōu)選的，本申請的用于家禽禽流感等免疫抑制性病原體多重檢測的試劑，還包括六組引物對，六組引物對分別為擴增禽流感病毒的第一引物對、擴增新城疫病毒的第二引物對、擴增馬立克氏病毒1型的第三引物對、擴增傳染性法氏囊病毒的第四引物對、擴增雞傳染性貧血病毒的第五引物對，以及擴增J亞型禽白血病病毒的第六引物對；第一引物對的上游和下游引物分別為SeqIDNo.7和SeqIDNo.8所示序列，第二引物對的上游和下游引物分別為SeqIDNo.9和SeqIDNo.10所示序列，第三引物對的上游和下游引物分別為SeqIDNo.11和SeqIDNo.12所示序列，第四引物對的上游和下游引物分別為SeqIDNo.13和SeqIDNo.14所示序列，第五引物對的上游和下游引物分別為SeqIDNo.15和SeqIDNo.16所示序列，第六引物對的上游和下游引物分別為SeqIDNo.17和SeqIDNo.18所示序列。需要說明的是，本申請設計了六種家禽免疫抑制性病原體的特異性探針，為了方便使用，同時設計了六組引物對，以方便對六種家禽免疫抑制性病原體進行核酸擴增。可以理解，在本申請的六條特異性探針的基礎上，還可以采用其它引物，只要能夠?qū)⒘鶙l特異性探針的特異性結(jié)合區(qū)涵蓋進去即可，不一定非要采用本申請的六組引物對；當然，本申請的六組引物對作為一個優(yōu)選的實現(xiàn)方案，也是經(jīng)過特別設計和研究的，六組引物對可以作為一個有機結(jié)合的整體，可以特異性的擴增出六種家禽免疫抑制性病原體，并且，六組引物對之間的相互干擾和影響最低。實際上，本申請的六組引物對，也可以單獨用于六種家禽免疫抑制性病原體的六重PCR擴增檢測；六條特異性探針的引入只是為了進一步的保障檢測特異性。還需要說明的是，本申請的六組引物對，在六個上游引物的5’端，引入了一段相同的20bp的序列，同時，在六個下游引物的5’端也引入了另一段相同的20bp的序列；這是本申請的一種優(yōu)選實施方案中的特殊結(jié)構(gòu)設計，通過該設計，可以采用一組超級引物，就對六個靶標序列進行同時擴增，這樣可以減小六重PCR擴增中多對引物之間干擾對PCR擴增效率的影響?？梢岳斫?，六組引物對的上游和下游引物中分別引入的20bp的相同序列，是一段與六種免疫抑制性病原體的基因組都沒有任何關(guān)系的序列，該序列不會對六種家禽免疫抑制性病原體的基因組產(chǎn)生非特異性擴增；并且，上游和下游引物中分別引入的20bp的序列，其堿基數(shù)量和具體序列都是可以根據(jù)不同的試驗平臺而改變的，這并不會影響六組引物對的特異性；甚至，可以完全刪除這20bp的序列，當然，在本申請的優(yōu)選方案中，并不建議這樣。優(yōu)選的，本申請的用于家禽禽流感等免疫抑制性病原體多重檢測的試劑，還包括一組超級引物，超級引物的上游和下游引物分別為SeqIDNo.19和SeqIDNo.20所示序列。需要說明的是，本申請的超級引物，實際上就是針對六組引物對的上游和下游引物中分別引入的20bp的序列而設計的，通過該超級引物，可以同時對六個靶標序列進行擴增。例如，采用六組引物對，預先對待測樣品進行核酸擴增，然后采用超級引物對核酸擴增產(chǎn)物再進行一次PCR擴增，這樣就可以實現(xiàn)一組超級引物對六個靶標的同時擴增。優(yōu)選的，本申請的用于家禽禽流感等免疫抑制性病原體多重檢測的試劑，其超級引物中，SeqIDNo.20所示序列的下游引物的5’端具有生物素標記。在本申請的一種實現(xiàn)方式中，5’端生物素標記，具體的，是在5’端第一個堿基的第6位或者第10位羥基上標記生物素。需要說明的是，超級引物的SeqIDNo.20所示序列的下游引物的5’端具有生物素標記，這也是用于液相芯片檢測而設計的，如果不是用于液相芯片，也可以不進行生物素標記。還需要說明的是，本申請的優(yōu)選方案中采用了超級引物的設計方案，因此，是在超級引物的5’端進行生物素標記；如果不采用超級引物的設計方案，即在六組引物對的上游和下游引物中不引入20bp的相同序列，此時，就需要直接采用六組引物對的混合引物的核酸擴增產(chǎn)物進行液相芯片檢測，因此，需要在六組引物對的下游引物的5’端進行生物素標記。本申請的另一面公開了本申請的用于家禽禽流感等免疫抑制性病原體多重檢測的試劑在家禽免疫抑制性病原體的多重基因芯片檢測、多重液相芯片檢測、多重常規(guī)PCR檢測或多重實時熒光PCR檢測中的應用。可以理解，本申請的試劑包括家禽禽流感等六種免疫抑制性病原體的特異性探針，或者特異性探針加六組特異性引物對，這些探針和引物對都具有很強的特異性，不僅可以用于液相芯片，也可以用于固相的基因芯片、常規(guī)PCR、實時熒光PCR等核酸檢測中。本申請的再一面公開了一種用于家禽禽流感等免疫抑制性病原體多重檢測的試劑盒，該試劑盒中含有本申請的用于家禽禽流感等免疫抑制性病原體多重檢測的試劑?？梢岳斫?，本申請的試劑完全可以制成試劑盒，以方便家禽禽流感等六種免疫抑制性病原體的特異性檢測。本申請的再一面公開了一種用于家禽禽流感等免疫抑制性病原體的多重檢測方法，包括以下步驟，(1)將六條特異性探針分別與液相芯片的六個不同編號的微球偶聯(lián)，六條特異性探針分別SeqIDNo.1所示序列的禽流感病毒特異性探針、SeqIDNo.2所示序列的新城疫病毒特異性探針、SeqIDNo.3所示序列的馬立克氏病毒1型特異性探針、SeqIDNo.4所示序列的傳染性法氏囊病毒特異性探針、SeqIDNo.5所示序列的雞傳染性貧血病毒特異性探針，以及SeqIDNo.6所示序列的J亞型禽白血病病毒特異性探針；(2)采用六組引物對的混合引物，對待測樣品進行核酸擴增，六組引物對分別為擴增禽流感病毒的第一引物對、擴增新城疫病毒的第二引物對、擴增馬立克氏病毒1型的第三引物對、擴增傳染性法氏囊病毒的第四引物對、擴增雞傳染性貧血病毒的第五引物對，以及擴增J亞型禽白血病病毒的第六引物對；第一引物對的上游和下游引物分別為SeqIDNo.7和SeqIDNo.8所示序列，第二引物對的上游和下游引物分別為SeqIDNo.9和SeqIDNo.10所示序列，第三引物對的上游和下游引物分別為SeqIDNo.11和SeqIDNo.12所示序列，第四引物對的上游和下游引物分別為SeqIDNo.13和SeqIDNo.14所示序列，第五引物對的上游和下游引物分別為SeqIDNo.15和SeqIDNo.16所示序列，第六引物對的上游和下游引物分別為SeqIDNo.17和SeqIDNo.18所示序列；(3)采用步驟(1)的偶聯(lián)有六條特異性探針的微球，對步驟(2)的擴增產(chǎn)物進行液相芯片檢測。優(yōu)選的，本申請的多重檢測方法還包括，在步驟(3)之前，采用一組超級引物，對步驟(2)的擴增產(chǎn)物再進行一次PCR擴增，然后將PCR擴增產(chǎn)物用于液相芯片檢測；所述超級引物的上游和下游引物分別為SeqIDNo.19和SeqIDNo.20所示序列。其中，超級引物中，SeqIDNo.20所示序列的下游引物的5’端具有生物素標記。本申請的有益效果在于：本申請的用于家禽禽流感等免疫抑制性病原體多重檢測的試劑，包含了六種免疫抑制性病原體的特異性探針，能夠?qū)αN家禽免疫抑制性病原體的靶標序列進行特異性捕獲，為六種家禽免疫抑制性病原體的高通量快速檢測奠定了基礎。本申請的多重檢測方法，采用本申請的試劑，以液相芯片為基礎，為家禽禽流感等六種免疫抑制性病原體提供了一種快速、準確的檢測方法，特別適合于檢驗檢疫等部門使用，為保障生產(chǎn)安全，控制家禽禽流感等免疫抑制性病原體傳播提供了有力的科學工具。附圖說明圖1是本申請實施例中多重RT-PCR對單個毒株進行擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖。具體實施方式下面通過具體實施例對本申請作進一步詳細說明。以下實施例僅對本申請進行進一步說明，不應理解為對本申請的限制。實施例一、試劑耗材1.毒株和雞胚本例采用的禽流感病毒H5N1(Re-6)標準血凝抗原、新城疫病標準血凝抗原購自哈爾濱病毒研究所，馬立克病毒1型1株、傳染性法氏囊病毒1株、雞傳染性貧血病毒1株和J亞型禽白血病病毒1株，均由深圳出入境檢驗檢疫局動檢實驗室保存和提供。另外，作為陰性參考的傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒等感染家禽的病毒，以及大腸桿菌O157、沙門氏菌、單增李斯特桿菌等感染家禽的細菌，也均由深圳出入境檢驗檢疫局動檢實驗室保存和提供。9天～11天的無特定病原體(Specificpathogenfree,SPF)雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司，用于家禽免疫抑制性病毒的繁殖與鑒定。2.材料和設備本例的試劑除特殊規(guī)定外，均指分析純試劑。表面含有羧基的濃度為1.25×107個/mL的熒光編碼微球、1-乙基-(3-二甲基-丙烷)氫氯化二酰亞胺(縮寫EDC)、pH4.5的0.5M2-(N-嗎啡基)乙磺酸(縮寫MES)、0.02％(w/v)吐溫-20、0.1％(w/v)十二烷基硫酸鈉SDS、5MTetramethylammoniumchloridesolution(縮寫TMAC)、QiagenOne-StepRT-PCRKit、EZ1VirusminiKit2.0。微球稀釋液為1.5×TMAC雜交液，配制見表1；檢測緩沖液為1×TMAC雜交液，配制見表2。表1微球稀釋液配制表(250mL總量)試劑名稱貨號最終濃度數(shù)量/250mL5MTMACSigmaT-3411-1L4.5M225mL20％肌胺酰SigmaL74140.15％1.88mL1MTris-HCl,pH8.0SigmaT-3038-1L75Mm18.75mL0.5MEDTA,pH8.0Sigma03690-100ml6mM3.0mL去離子水1.37mL表2檢測緩沖液配制表(250mL總量)試劑名稱貨號最終濃度數(shù)量/250mL5MTMACSigmaT-3411-1L3M150mL20％肌胺酰SigmaL74140.1％1.25mL1MTris-HCl,pH8.0SigmaT-3038-1L50Mm12.5mL0.5MEDTA,pH8.0Sigma03690-100ml4mM2.0mL牛血清白蛋白SigmaA94180.2％0.5g去離子水84.25mL本例采用的檢測設備包括，液相芯片檢測工作站、全自動核酸抽提工作站、高速臺式冷凍離心機、梯度核酸擴增儀、振蕩器、超聲波儀、臺式離心機、計時器、分析天平等。3.引物、探針序列及堿基修飾本例根據(jù)禽流感病毒、新城疫病毒、馬立克氏病毒1型、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性貧血病毒和J亞型禽白血病病毒，六種家禽禽流感等免疫抑制性病原體的核酸設計特異性探針和各自的引物。并且，在各種引物的5’端引入了20bp的隨機序列；具體的，在所有上游引物的5’端引入一段相同的20bp的隨機序列，在所有下游引物的5’端引入另外一段相同的20bp的隨機序列；并根據(jù)所引入的隨機序列，設計了一組超級引物。為了配合液相芯片檢測，本例在超級引物的反向引物(RSP)5’端第一個堿基的第6位或者第10位羥基上標記生物素(biotin)，各個疾病特異性探針5’端第一個堿基的12位碳基上連接胺基(-NH2)，所有的引物探針合成后均需要進行色譜級(HPLC)純化。探針和引物具體見表3。表3家禽禽流感等六種免疫抑制性病原體的引物及探針二、毒株繁殖和核酸提取1.毒株繁殖采用SPF雞胚，分別對除禽流感和新城疫外的其他供試病毒或細菌進行培養(yǎng)，雞胚死亡或者培養(yǎng)七天后，采集尿囊液采用相應的標準進行檢測，以確定雞胚是否為特異性死亡或感染。在確定雞胚為特異性死亡或感染后，取雞胚組織用于病毒或細菌核酸提取。同時，取沒有病毒或細菌感染的SPF雞胚的組織，提取核酸作為陰性對照。本例的樣品的采集、保存及運輸都符合GB/T18088的相關(guān)要求。2.核酸提取對于組織樣品，用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品2.0g于研缽中充分研磨，再加10mL含青霉素10000IU/mL、鏈霉素10000μg/mL的PBS混勻，或置于組織勻漿器中，加入10mL含青霉素10000IU/mL、鏈霉素10000μg/mL的PBS勻漿，然后將組織懸液轉(zhuǎn)入無菌1.5mL離心管中3000r/min4℃離心15min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無菌1.5mL離心管中，編號備用。本例的核酸抽提可使用能夠同時抽提病毒DNA和病毒RNA的核酸抽提方法，如傳統(tǒng)酚-氯仿法，也可采用自動化核酸抽提儀器和配套核酸抽提試劑進行核酸抽提。具體的，本例采用酚-氯仿法提取核酸。具體如下：(1)取滅菌的1.5mL離心管，做好標識。(2)每管加入600μL裂解液，分別加入被檢樣本、陰性對照、陽性對照各200μL，再加入200μL氯仿，混勻器上振蕩混勻5s，于4℃12000g離心15min。(3)取滅菌的1.5mL離心管，加入-20℃預冷400μL異丙醇，吸取本標準6.2各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應的管中，避免吸出中間層，顛倒混勻。(4)于4℃12000g離心15min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體；加入600μL75％預冷乙醇，顛倒洗滌。(5)于4℃12000g離心10min，棄上清，倒置于吸水紙上，沾干液體。(6)10000g離心10s，用微量加樣器將其吸干，室溫干燥(5～10)min。(7)加入15μLDEPC水，溶解管底的RNA，5000g離心5s，冰上保存?zhèn)溆?，若需長期保存應放置-70℃冰箱。三、液相芯片檢測本例的實驗室檢測符合GB19489和SN/T1193的相關(guān)要求。1.寡核苷酸探針與羧基化的熒光編碼微球偶聯(lián)按照表4，將不同的禽免疫抑制性疾病的特異性探針，與相應編碼的微球進行偶聯(lián)。表4探針和偶聯(lián)微球編碼本例所有試劑在室溫條件下至少30min，所有的操作均應避光，最好用鋁鉑膜包嚴實離心管操作。探針與微球偶聯(lián)的具體方法包括：(1)用pH4.5的0.1MMES分別溶解六條特異性探針至0.2mM。(2)取出裝有微球的貯存管，先用超聲波儀分散3min，再于旋渦震蕩器上全速震蕩至少5min。(3)從貯存管中取出20μL微球貯存液，約5×104個微球，至1.5mL的聚丙烯微量離心管中，用10000g離心5min。(4)去上清，加入50μL的pH4.5的0.1MMES，于旋渦震蕩器上全速震蕩5min，再用超聲波儀分散約5min。(5)加入3μL0.2mM的特異性探針，于旋渦震蕩器上瞬時震蕩。(6)使用前，加1.0mL的去離子水到10mg的EDC中，加2.5μl的新鮮EDC溶液到微球與探針的混合液中，瞬時震蕩，室溫避光孵育30min。(7)用新鮮的EDC重復步驟(6)一次。(8)加1.0mL0.02％(w/v)的吐溫-20，全速震蕩1min后，12000g離心10min。(9)去上清，向微球中加入1.0mL0.1％(w/v)的SDS溶液，全速震蕩5min后，12000g離心10min。(10)棄上清，加入100μL的pH4.5的0.1MMES，全速震蕩10imn，超聲波再懸浮微球約10imn。制備的微球計數(shù)：用dH2O1：100稀釋重懸偶聯(lián)的微球溶液，充分震蕩混勻，取10μL加至血球計數(shù)器，對血球計數(shù)器格子的4個大角進行微球計數(shù)。微球數(shù)/μl＝4個大角微球總和×2.5×100。微球最大數(shù)為50000個微球/μL。用1.5×TMAC雜交液將微球稀釋成1.25×105，在2～8℃避光可保存半年。偶聯(lián)后與PCR產(chǎn)物進行液相芯片檢測，并設空白對照，以確定偶聯(lián)效率。當每種熒光編碼微球個數(shù)不少于100個，且空白對照熒光強度不高于300，表明微球偶聯(lián)成功。2.RT-PCR核酸擴增本例的核酸擴增，由于六種家禽免疫抑制性疾病既有DNA病毒，又有RNA病毒。為了保證能夠同時擴增出所有的病毒，統(tǒng)一使用RT-PCR方法進行核酸擴增。反應液的配制：在PCR溶液配制區(qū)，參照各試劑盒相應說明書進行配制，具體的，每份檢測樣品的RT-PCR體系為50μL，體系見表5。將配制的每個PCR反應試劑充分混勻，瞬時離心后轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。表5RT-PCR反應體系表5的反應體系中分別加入了超級引物和混合引物，超級引物的上游和下游引物即FSP和RSP?；旌弦锸橇M引物對的混合物，混合引物的混合配比見表6。表6混合引物的配制加樣：設立陽性對照、陰性對照。在已分裝有PCR反應混合液的PCR管中分別加入已提取好的核酸5μL，蓋上管蓋，將PCR管放入PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本放置順序。本例具體采用了六個陽性對照、兩個陰性對照、一個水空白對照。RT-PCR擴增條件設置見表7。表7RT-PCR擴增條件3.微球探針與核酸擴增產(chǎn)物雜交所有試劑在室溫條件下至少30min，所有的操作均避光，最好用鋁鉑膜包嚴實離心管操作。取出裝有偶聯(lián)探針微球的貯存管，先用超聲波儀分散1min，再于旋渦震蕩器上全速震蕩至少20s。分別取偶聯(lián)好的各種熒光編碼微球10μL，將六種編碼的熒光編碼微球混合，最終用1.5×TMAC雜交液將每種微球稀釋成200個熒光編碼微球/μL。按照表8的配比制備雜交反應體系。表8微球探針與核酸擴增產(chǎn)物雜交反應體系組份量/反應(μL)六種免疫抑制性疾病微球混合雜交液33RT-PCR產(chǎn)物51×TE(PH8.0)12Total50雜交反應設計空白對照管和陽性對照管，空白對照管中直接添加去離子水5μL替換RT-PCR產(chǎn)物，陽性對照管中添加5μL合成的六條特異性探針的互補序列。反應體系配制好后，輕輕反復吹打混勻，于PCR儀中進行如下反應：94℃15min，52℃30min。反應結(jié)束后，10000r/min離心3min。離心結(jié)束后，棄各管上清，加入75μL的報告混合液，輕微吹打幾次混勻，于PCR儀上52℃孵育5min。然后，于液相芯片檢測儀上進行檢測。報告混合液為，用1×TMAC雜交液將SA-PE稀釋至4μg/mL，即制成報告混合液。液相芯片檢測儀檢測具體包括：(1)在PCR擴增進行時，打開液相芯片檢測所有相關(guān)儀器，并將儀器的上樣加熱陶瓷底板預先加熱至52℃。(2)按照液相芯片檢測儀操作說明書，進行各個參數(shù)的設置。本例采用的是Luminex100液相芯片儀，其設置如下：(a)每個樣品檢測時，應同時選擇檢測6種熒光編碼微球(33、34、35、36、37、38)，并填寫每種熒光微球?qū)膊∶Q。(b)檢測體積為45μL，流速為快速，每種熒光微球設置計數(shù)為100個，計數(shù)時間為120s，每次檢測時每種熒光編碼微球至少≥20個。(3)將樣品依次放入空白對照管、各個陰性對照管、陽性對照管和待檢樣品管，并在軟件界面進行相應的標注。4.特異性檢測(1)單株毒株特異性檢測按照“2.RT-PCR核酸擴增”中的方法和體系，分別對提取的禽流感病毒、新城疫病毒、馬立克病毒1型、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性貧血病毒和J亞型禽白血病病毒是核酸進行RT-PCR核酸擴增。并設置水空白對照1個，以及傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒、大腸桿菌O157、沙門氏菌、單增李斯特桿菌6個陰性對照。部分擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。此外，將禽流感病毒、新城疫病毒、馬立克病毒1型、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性貧血病毒和J亞型禽白血病病毒的擴增產(chǎn)物按照“3.微球探針與核酸擴增產(chǎn)物雜交”的方法和條件，進行液相芯片檢測。(2)多毒株混合特異性檢測本例分別配制了六個毒株兩兩組合的混合核酸樣品，和六個毒株一起組合的混合核酸樣品進行試驗。并設置水空白對照1個，以及傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒、大腸桿菌O157、沙門氏菌、單增李斯特桿菌6個陰性對照。部分擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。此外，將禽流感病毒、新城疫病毒、馬立克病毒1型、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性貧血病毒和J亞型禽白血病病毒組合的陽性擴增產(chǎn)物按照“3.微球探針與核酸擴增產(chǎn)物雜交”的方法和條件，進行液相芯片檢測。四、檢測結(jié)果1.瓊脂糖凝膠電泳單株毒株特異性檢測的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，水空白對照和6個陰性對照都沒有擴增條帶，而禽流感病毒、新城疫病毒、馬立克病毒1型、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性貧血病毒和J亞型禽白血病病毒六個毒株都有擴增條帶，部分結(jié)果如圖1所示，圖中，第一泳道為100bpDNALadderMarker、第二泳道為禽流感病毒的擴增條帶約174bp、第三泳道為新城疫病毒的擴增條帶約145bp、第四泳道為傳染性法氏囊病毒的擴增條帶約198bp、第五泳道為馬立克病毒1型的擴增條帶約245bp、第六泳道為J亞型禽白血病病毒的擴增條帶約185bp、第七泳道為雞傳染性貧血病毒的擴增條帶約122bp，與預期結(jié)果相符。多毒株混合特異性檢測的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，水空白對照和6個陰性對照都沒有擴增條帶，而禽流感病毒、新城疫病毒、馬立克病毒1型、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性貧血病毒和J亞型禽白血病病毒兩兩組合或者六個組合的混合樣品都有相應的擴增條帶，統(tǒng)計結(jié)果如表9所示。表9多毒株混合RT-PCR擴增結(jié)果表9中“+”表示有檢出，空白則表示沒有檢出表9的結(jié)果顯示，六個病毒的核酸兩兩組合都能夠按照預期擴增出相應的靶標片段，六個病毒的核酸一起組合也能夠擴增出六條靶標片段，大小與預期相符。2.液相芯片檢測液相芯片定性比值結(jié)果(Luminexqualitativeratioresult,LQRR)等于樣品校正后的熒光強度中位值(Medianflorescenceintensity,MFI)與空白對照MFI的平均值(MFIB)的比值。LQRR＝MFIS/mMFIB。按照儀器儀器數(shù)據(jù)分析軟件操作，獲得檢測結(jié)果的輸出。LQRR≥3，判定為陽性樣本。LQRR<2，則判定為陰性。2≤LQRR<3，則判定為可疑，可疑樣品應重新應用其他標準方法進行檢測判定。將單株毒株RT-PCR擴增產(chǎn)物純化后，直接與混合探針進行雜交，結(jié)果各個參與計數(shù)的熒光編碼微球在30個～243個之間，均≥20個，表明用于計數(shù)的熒光編碼微球數(shù)量有效，所產(chǎn)生的MFI值可信；各個熒光編碼微球的空白對照MFI介于143～2839之間，均<3000，表明結(jié)果有效，試驗可以進行判定；各毒株RT-PCR反應擴增產(chǎn)物的MFI值介于12776～15840之間。混合探針與各個毒株的RT-PCR擴增產(chǎn)物之間均有特異性的雜交，LQRR值介于7～109.7之間，表明均為陽性，詳細結(jié)果如表10所示。表10單株毒株特異性檢測結(jié)果將雙毒株混合樣品的RT-PCR擴增產(chǎn)物純化后，直接與混合液中熒光編碼微球上的探針進行雜交，結(jié)果各個參與計數(shù)的熒光編碼微球在27個～246個之間，均≥20個，表明用于計數(shù)的熒光編碼微球數(shù)量有效，所產(chǎn)生的MFI值可信；各個熒光編碼微球的空白對照MFI也均<3000，表明結(jié)果有效，試驗可以進行判定；RT-PCR反應擴增產(chǎn)物的MFI介于7747～17824之間?；旌咸结樑c各個雙毒株的RT-PCR擴增產(chǎn)物之間均有特異性的雜交，LQRR值介于3.7～93.1之間，表明均為陽性，詳細結(jié)果如表11所示。表11兩兩毒株組合特異性檢測結(jié)果六個毒株組合的RT-PCR擴增產(chǎn)物純化后，直接與混合探針進行雜交，結(jié)果各個參與計數(shù)的熒光編碼微球在28個～215個之間，均≥20個，表明用于計數(shù)的熒光編碼微球足夠，所產(chǎn)生的MFI值可信；各個熒光編碼微球的空白對照MFI均<3000，表明各個熒光編碼微球的背景信噪值不太高，試驗可以進行判定；RT-PCR反應擴增產(chǎn)物的MFI介于6848～16400?；旌咸结樑c六毒株RT-PCR擴增產(chǎn)物均有特異性的雜交，LQRR值介于3～99.9之間，表明均為陽性。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本申請所作的進一步詳細說明，不能認定本申請的具體實施只局限于這些說明。對于本申請所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本申請構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本申請的保護范圍。當前第1頁1 2 3