本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，具體涉及一種液化真菌固體菌種的方法。

背景技術(shù)：

目前，傳統(tǒng)的三級固體菌種繁育體系為試管母種-瓶裝原種-瓶裝或袋裝栽培種，液體菌種的生產(chǎn)工藝流程為專用試管種-搖床發(fā)酵專用母種-發(fā)酵罐深層發(fā)酵液體菌種。固體菌種易于培養(yǎng)，質(zhì)量穩(wěn)定，抗性強，投入成本低，適用范圍廣，儲存時間久，技術(shù)要求低，但是發(fā)菌慢，菌齡不一致、培養(yǎng)周期較長，而且隱性污染的可能性大。而液體菌種菌齡高度一致，發(fā)菌迅速，萌發(fā)點多，生長周期短，菌種純度高，但是投入成本大，不可存儲使用，對設(shè)備和技術(shù)的要求高，而且大批次污染的概率大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中菌種培養(yǎng)發(fā)菌慢、周期長、容易被污染等技術(shù)瓶頸，從而提出一種液化真菌固體菌種的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種液化真菌固體菌種的方法，所述方法包括如下步驟：

1)制備原種：取母種接種于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)；

2)粉碎：將步驟1)中制得的原種粉碎；

3)過篩：粉碎后的菌塊過篩，得到細小的菌絲顆粒；

4)二次萌發(fā)：在無菌環(huán)境中，將菌絲顆粒按照每1g菌種配合100mL液體培養(yǎng)基的比例，進行液體培養(yǎng)，直至菌絲顆粒萌發(fā)出新菌絲；

5)大量培養(yǎng)：在無菌條件下將步驟4)所得的產(chǎn)物進行搖床培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)。

優(yōu)選的，所述方法的步驟1)中，所述的固體培養(yǎng)基配方如下：

細玉米芯65重量份，粗玉米芯15重量份，麥麩19重量份，生石灰1重量份，水分含量60-65重量份；或

鋸木屑50重量份，玉米芯20重量份，麥麩20重量份，玉米粉8重量份，白糖1重量份，生石灰1重量份，水分含量60-65重量份。

優(yōu)選的，所述方法的步驟4)中，所述液體培養(yǎng)基為“PDA+瓊脂”液體培養(yǎng)基，其制備工藝如下：

稱取200g的去皮馬鈴薯，切塊，加水1000-1200mL,煮至馬鈴薯熟而不爛后用雙層紗布過濾，濾液中加入2g瓊脂粉、20g葡萄糖，補水至1000mL，加熱攪拌溶化。

優(yōu)選的，所述方法的步驟4)中，所述液體培養(yǎng)基為“玉米粉+豆餅粉”液體培養(yǎng)基，其制備工藝如下：

將25g玉米粉在1200mL冷水中攪拌沒塊，加熱至沸騰，煮20分鐘，期間不斷攪拌，然后加入10g豆餅粉、20g白糖，補水至1000mL，攪拌混勻。

優(yōu)選的，所述方法的步驟1)中，所述的母種所用的真菌為擔子菌。

優(yōu)選的，所述方法的步驟2)中，所述的過篩處理中，篩孔至少為30目。

優(yōu)選的，所述方法的步驟4)中，加入培養(yǎng)容器的液體培養(yǎng)基的體積為容器總體積的1/3。

優(yōu)選的，所述方法的步驟5)中，搖床培養(yǎng)條件為20-25℃，180-220rpm。

優(yōu)選的，所述的固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度均為20-25℃，濕度均為60-70％。

更為優(yōu)選的，所述方法所用固體培養(yǎng)基于121℃高壓蒸汽滅菌或微波滅菌1小時，液體培養(yǎng)基于121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘。

本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點：

(1)操作簡便：本發(fā)明涉及的制備液體菌種的設(shè)備均為常用設(shè)備，且操作流程都很簡便；

(2)菌絲純度高：在培養(yǎng)液體菌種期間，一旦發(fā)生污染，其氣味、色澤均會發(fā)生變化，易于經(jīng)常取樣檢查。因此，發(fā)生污染及隱性污染的概率較低；

(3)菌種活力強：制備此種液體菌種的過程中，需要粉碎專用固體菌種，粉碎過程增加了菌絲兩端的切斷面，由于菌絲是頂端生長，從而增強菌絲的活力；

(4)萌發(fā)點多：在接種生產(chǎn)的過程中，是將液體菌種與固體培養(yǎng)料攪拌混勻，使得絕大部分材料都能接種到菌絲；

(5)培養(yǎng)周期短：利用此種菌懸液制備的菌袋或菌瓶一般7-8天左右即可長滿菌絲，而液體菌種接種一般15-20天左右長滿菌絲，固體菌種接種一般20-35天長滿菌絲；

(6)節(jié)約成本：固體菌種用量少，接種方式簡單，所用設(shè)備投入較少，技術(shù)要求不高，且所用材料為農(nóng)業(yè)廢棄物。

具體實施方式

實施例1本實施例公開了一種液化真菌固體菌種的方法，所述方法步驟如下：

1.制備原種：按照如下配方：細玉米芯(8目)65％，粗玉米芯(4目)15％，麥麩19％，生石灰1％，稱取共500g固體培養(yǎng)料置于攪拌機中，并加入562.5g的自來水，充分攪拌混勻(培養(yǎng)料的水分按60％計算)。裝袋(所用菌袋為聚乙烯17cm×33cm，兩頭均開口)，300g/袋，121℃高壓蒸汽滅菌1小時。冷卻后，取一塊拇指大小且?guī)в信囵B(yǎng)基的靈芝試管母種接種于固體培養(yǎng)料(菌袋兩頭均接種)，進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件——溫度：20-25℃，濕度：60％-70％，避光；培養(yǎng)15天左右即可長滿菌袋。

2.粉碎：將步驟1中制得的原種粉碎；

3.過篩：粉碎后的菌塊過30目以上的篩子，得到細小的菌絲顆粒，除給菌絲球的形成提供附著點外，也增加了菌絲兩端的切斷面，從而增強菌絲的活力；

4.二次萌發(fā)：在無菌環(huán)境中，將將50g菌絲顆粒加入進行入一個5L的液體培養(yǎng)的專用容器(該容器可大可小，但是必須有增氧元件，如增氧蓋或插入增氧管)，加入的量為1g菌種每100mL液體培養(yǎng)基，盡量使菌絲顆粒在容器底部處分散狀態(tài)。培養(yǎng)2天左右，直至菌絲顆粒萌發(fā)出新菌絲；

5.大量培養(yǎng)：在無菌條件下將1.8L滅菌(121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘)并冷卻的“PDA+瓊脂粉”液體培養(yǎng)基倒入盛有專用固體菌種的容器，加入的液體培養(yǎng)基的體積為容器總體積的1/3。搖床培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為20-25℃，180-220rpm。培養(yǎng)24小時即可產(chǎn)生菌絲球，培養(yǎng)3-5天培養(yǎng)基中充滿了大量潔白濃密的菌絲球，備用；

所用液體液體培養(yǎng)基制法如下：

馬鈴薯去皮，稱取200g，切塊，加水1000-1200mL,煮至馬鈴薯熟而不爛后用雙層紗布過濾，濾液中加入2g瓊脂粉、20g葡萄糖，補水至1000mL，加熱攪拌溶化；

6.制備的液體菌種用于接種生產(chǎn)：

按照如下配方：小麥秸稈40％，棉籽殼20％，玉米芯30％，麥麩9％，生石灰1％，稱取共5Kg固體培養(yǎng)料置于攪拌機中，并加入5.625Kg的自來水，充分攪拌混勻，121℃高壓蒸汽滅菌1.5小時。冷卻后，接種1.8L液體菌種，用無菌攪拌機攪拌混勻后，裝袋培養(yǎng)，500g/袋。培養(yǎng)條件不變。培養(yǎng)8天菌絲即可長滿菌袋，比現(xiàn)有技術(shù)提前15-25天。且200g原種可以生產(chǎn)48Kg菌塊，即約160袋。培養(yǎng)結(jié)束后菌袋用于食用菌生產(chǎn)或友好型生物材料的制作。

以上所有步驟均在無菌環(huán)境中操作。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。