本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在蝴蝶蘭中表達(dá)的花分生組織決定基因—PhalLFY基因、含有該基因的重組植物表達(dá)載體，以及PhalLFY基因在促進(jìn)植物多花枝發(fā)育和促進(jìn)植物提前開花中的應(yīng)用

背景技術(shù)：
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在植物個(gè)體發(fā)育中，花的分化是生殖生長的開始。首先，營養(yǎng)分生組織轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄐ蚍稚M織，然后花序分生組織轉(zhuǎn)變?yōu)榛ǚ稚M織，接下來，花分生組織產(chǎn)生花器官原基，最后產(chǎn)生各種花器官。已被確定的花分生組織決定基因有LEAFY(LFY),APETALA1(AP1),CAULIFL OWER(CAL),APETALA2(AP2),and UNUSUAL FLORAL ORGANS(UFO)(Weigel et al.,1992；Yanofsky,1995)，其中，LFY起著中心調(diào)控作用，在植物花發(fā)育中發(fā)揮著重要作用(Weigel et al.,1992；Pidkowich et al.,1999)。

已經(jīng)有一些FLO/LFY同源基因從不同的物種中被克隆出來，LFY同源基因編碼的氨基酸在C-末端區(qū)域內(nèi)高度保守，而N-末端不保守(Southerton et al.,1998；Mouradov et al.,1998；Wada et al.,2002)。它們的結(jié)構(gòu)也有所不同，氨基酸序列中大部分含有5’-N端脯氨酸富集區(qū)、中央酸性區(qū)和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(XEL…XTL…XEL…)特征，擬南芥中還含有鋅指結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)具有轉(zhuǎn)錄因子的特征。所有已知的花分生組織決定基因所編碼的蛋白質(zhì)都參與調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)。但是LFY編碼的產(chǎn)物和其它任何已知的轉(zhuǎn)錄因子沒有相似性，LFY蛋白質(zhì)被顯示優(yōu)先定位于核內(nèi)，能夠在活體內(nèi)結(jié)合DNA(Weigel,1995；Weigel and Meyerowitz,1993)。當(dāng)LFY融合一個(gè)不同的激活域時(shí)，它能在酵母中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性(Parcy et al.,1998)，因此，LFY有轉(zhuǎn)錄因子的功能。

所有的花分生組織決定基因都在幼嫩的花原基中表達(dá)。然而，LFY不僅在花原基中表達(dá)，它也在營養(yǎng)器官中表達(dá)，在營養(yǎng)階段，LFY的表達(dá)在幼嫩的葉原基中被發(fā)現(xiàn)，它的表達(dá)在芽分生組織中增加。LFY在其它花分生組織決定基因之前表達(dá)，且隨著花的誘導(dǎo)，表達(dá)會增加。在營養(yǎng)階段，過量表達(dá)LFY導(dǎo)致早花。在ful/ap1/cal三突變體中，不能開花，而過量表達(dá)LFY可以修復(fù)這種突變體植物的不開花表型(Ferrandiz et al.,2000)。這個(gè)結(jié)果暗示LFY在開花轉(zhuǎn)變中起著關(guān)鍵性作用。然而，LFY本身并不能立即充分地將SAM轉(zhuǎn)變成花分生組織，沒有其它基因的上游調(diào)控，LFY的表達(dá)不能到達(dá)能成功啟動開花的域值。對LFY同源基因的時(shí)空表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，不同植物中其表達(dá)的時(shí)間和空間有所不同。金魚草中的FLO基因最早是在花分生組織中表達(dá)，而后是萼片、花瓣和心皮原基，而在雄蕊原基中沒有表達(dá)，F(xiàn)LO只在植物的開花期表達(dá)(Coen，1990)。但在擬南芥、煙草、豌豆、鳳仙花、矮牽牛、葡萄、桉樹、山楊和番茄等植物中，LFY同源基因除了在開花階段有表達(dá)外，在葉原基中也有表達(dá)(Kelly et al.,1995；Blazquez et al.,1997；Hofer et al.,1997；Pouteau et al.,1997；Souer et al.,1998；Ca rmona et al.,2002；Southerton et al.,1998；Rottmann et al.,2002；Andrea et al.,2003；Do rnelas et al.,2004)。在豌豆的葉子中LFY同源基因(UNIFOLIATA)mRNA具有很強(qiáng)的表達(dá)(Hofer et al.,1997)；蘋果中的AFL2在根、葉及花分生組織中均有很強(qiáng)的表達(dá)(Wada et al.,2002)；輻射松的2個(gè)同源基因中，NLY在營養(yǎng)生長時(shí)期表達(dá),PRFLL在雄球果中表達(dá)(Mellerowicz et a1.,1998；Mouradov et al.,1998)。單子葉植物水稻中LFY的同源基因RFL的表達(dá)明顯區(qū)別于雙子葉植物，RFL基因在幼穗中表達(dá)，而在成熟的小花和葉子中沒有表達(dá)(Kyozuka et al.,1998)。LFY同源基因這種表達(dá)特性上的差異很可能反映植物本身花結(jié)構(gòu)的進(jìn)化關(guān)系。

不同植物中LFY同源基因轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)效果并不同。擬南芥LFY基因轉(zhuǎn)入其本身后，轉(zhuǎn)基因植株的側(cè)芽全部轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄑ?，使花期提?Blazquez et a1.,1997)。轉(zhuǎn)LFY基因的楊樹、煙草、菊花、水稻及柑橘等植物也具有同樣的效果。把楊樹中LFY同源基因?qū)霐M南芥，轉(zhuǎn)基因植株花期提前，但楊樹自身的轉(zhuǎn)基因植株開花時(shí)間變化不明顯(Rottmann et a1.,2000)，這可能與其幼年期較長有關(guān)。轉(zhuǎn)入輻射松NLY基因的擬南芥對日長不敏感，均提前開花(Mour adov et a1.,1998)。但煙草NFL1基因在轉(zhuǎn)入擬南芥后不能使花期提前(Ahearn et a1.,2001)。上述情況說明盡管LFY同源基因所編碼的蛋白序列很保守，但在進(jìn)化過程中，由于一些結(jié)構(gòu)上的改變，導(dǎo)致其功能也發(fā)生了變化。

蝴蝶蘭是蘭科植物中栽培最廣泛、最受歡迎的種類之一，花形似蝴蝶，別致美麗、色彩艷麗，花期長達(dá)數(shù)月之久，觀賞價(jià)值極高，在熱帶蘭中素有“蘭花皇后”之美譽(yù)，國內(nèi)外一直視其為花中珍品，倍受人們青睞。在我國，蝴蝶蘭消費(fèi)主要集中在春節(jié)、中秋、國慶、元旦等重大節(jié)日，生產(chǎn)上確保蝴蝶蘭如期上市非常重要，花期調(diào)控是生產(chǎn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。影響蝴蝶蘭生長發(fā)育與開花的因子有肥料、基質(zhì)、溫度、光照、激素等，生產(chǎn)上主要通過調(diào)控這幾個(gè)因子來實(shí)現(xiàn)對蝴蝶蘭的花期調(diào)控。開花受環(huán)境因子和內(nèi)源因子共同調(diào)控，調(diào)節(jié)開花的環(huán)境信息和內(nèi)源信息必須通過花分生組織決定基因發(fā)揮作用，花的命運(yùn)最終被花分生組織決定基因所確定。LFY是最關(guān)鍵的花分生組織決定基因，它直接決定植物開花時(shí)間和開花狀態(tài)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種在蝴蝶蘭中表達(dá)的花分生組織決定基因—蝴蝶蘭開花基因PhalLFY及其編碼蛋白和含有該基因的重組植物表達(dá)載體。

本發(fā)明研究了一種從蝴蝶蘭中克隆出的PhalLFY基因，將其轉(zhuǎn)入擬南芥和煙草后可以促進(jìn)側(cè)芽或腋芽轉(zhuǎn)化為花芽，導(dǎo)致多花枝發(fā)育，并促進(jìn)提前開花。而在發(fā)明公布之前，尚未有任何公開報(bào)道過本專利申請中提及的蝴蝶蘭開花基因PhalLFY在轉(zhuǎn)基因植株中的功能應(yīng)用。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了一種含有上述蝴蝶蘭開花基因PhalLFY的重組植物表達(dá)載體。

優(yōu)選，所述的重組植物表達(dá)載體中的載體為pBI系列載體、pBin系列載體、Gateway^TW系列載體或pCAMBIA系列載體。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種含有所述的重組植物表達(dá)載體的植物細(xì)胞系。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種含有所述的重組植物表達(dá)載體的植物轉(zhuǎn)化體。

優(yōu)選，所述的植物轉(zhuǎn)化體中的受體植物為煙草或擬南芥。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供蝴蝶蘭開花基因PhalLFY在促進(jìn)側(cè)芽或腋芽發(fā)育成花芽，促進(jìn)花芽發(fā)育，縮短植物童期，促進(jìn)植物提前開花中的應(yīng)用，如促進(jìn)擬南芥和煙草多花芽發(fā)育，縮短煙草和擬南芥童期，促進(jìn)它們提前開花。

本發(fā)明以“蝴蝶蘭(Phalaenopsis hybrida cv.Wedding Promenade)”的花芽為材料，提取其總RNA，再將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，以該cDNA第一鏈模板，根據(jù)LFY的同源基因設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR和RACE的方法擴(kuò)增拼接獲得全長cDNA序列，該cDNA序列長度為1655bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，其開放閱讀框?yàn)樽?’端第41位至第1462位堿基，共1422bp，將此開放閱讀框命名為蝴蝶蘭開花基因PhalLFY，其編碼的蛋白的氨基酸序列具有473個(gè)氨基酸殘基，其序列如SEQ ID NO.2所示，將該蛋白命名為PhalLFY蛋白。

將蝴蝶蘭開花基因PhalLFY編碼的蛋白質(zhì)-PhalLFY蛋白的序列用ClustalW2分析其同源性，結(jié)果顯示PhalLFY蛋白在N-和C-末端都有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，它包含亮氨酸重復(fù)區(qū)域，酸性區(qū)域,堿性區(qū)域；氨基酸序列的同源性分析顯示PhalLFY分別與倒距蘭LFY的同源性為68％、與紅門蘭LFY的為67％、與風(fēng)信子LFY-like的為61％,與水稻RFL為的60％、與百合LFY1的為59％、與金魚草FLO的為59％、與擬南芥LFY的為54％。進(jìn)化樹顯示所有的LFY/FLO同源基因被分成雙子葉和單子葉兩個(gè)分支，PhalLFY屬于單子葉分支。

本發(fā)明人將上述PhalLFY基因(蝴蝶蘭開花基因PhalLFY)與植物表達(dá)載體連接，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將含有PhalLFY基因的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到擬南芥中，經(jīng)篩選培養(yǎng)獲得含有PhalLFY基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PhalLFY基因超表達(dá)促進(jìn)擬南芥提前開花，促進(jìn)腋芽分化成花芽，出現(xiàn)多花枝現(xiàn)象；該轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥花期提前，腋芽分化成花芽，花枝增多，10個(gè)轉(zhuǎn)化株的平均開花時(shí)間為15天，有3個(gè)花枝，而野生型的平均開花時(shí)間為26天，僅有1個(gè)花枝。

本發(fā)明人將上述PhalLFY基因與植物表達(dá)載體連接，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，將含有PhalLFY基因的重組植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到煙草中，經(jīng)篩選培養(yǎng)獲得含有PhalLFY基因的轉(zhuǎn)基因煙草，PhalLFY基因超表達(dá)改變了煙草的生長發(fā)育進(jìn)程，促進(jìn)了花枝發(fā)育，并促使煙草提前開花。

因此可以將本發(fā)明的蝴蝶蘭開花基因PhalLFY應(yīng)用到縮短植物童期，促進(jìn)植物開花中。本發(fā)明的PhalLFY基因與植物表達(dá)載體連接，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)入植物細(xì)胞、組織或器官，通過組織培養(yǎng)成轉(zhuǎn)基因的植物轉(zhuǎn)化體，從而實(shí)現(xiàn)縮短植物童期生長期，促進(jìn)植物開花。所述的植物表達(dá)載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pBI系列載體、pBin系列載體、Gateway^TW系列載體、pCAMBIA系列載體或其它衍生植物表達(dá)載體等，上述載體均為公開銷售的商品。

本發(fā)明首次從蝴蝶蘭中克隆到LFY同源基因—PhalLFY基因(蝴蝶蘭開花基因PhalLFY)，并且通過實(shí)驗(yàn)證明該基因能夠影響植物生長發(fā)育進(jìn)程，縮短了童期，促使植物提前開花，并促進(jìn)腋芽/側(cè)芽發(fā)育成花芽。因此，本發(fā)明提供的蝴蝶蘭開花基因PhalLFY為基因工程改良植物的生長進(jìn)程，對植物的花期進(jìn)行調(diào)控提供了一種有效的技術(shù)手段，具有廣泛的應(yīng)用前景和極大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

附圖說明：

圖1是蝴蝶蘭PhalLFY蛋白的氨基酸序列與LFY/FLO同源基因氨基酸序列比對。OrcLFY(BAC 54955)、AnaLFY(BAC55081)，DacLFY(BAC55083)，LFY-like(AAS00458),RFL(BAA21547),LiLFY1(ABR13015)，LFY(NP_200993)，BraLFY(ABF06559)。具有一致性和相似性的氨基酸分別用黑色和灰色陰影表示。酸性水解域用黑色線在序列下注明，堿性域用灰色線在序列下注明。暗示重復(fù)的亮氨酸殘基

圖2是RT-PCR檢測在蝴蝶蘭營養(yǎng)生長時(shí)期PhalLFY基因在植株根、莖、葉中的表達(dá)模式，其中root為根；stem為莖；leaf為葉；

圖3是RT-PCR檢測在蝴蝶蘭生殖生長期當(dāng)花梗長度達(dá)1cm時(shí)PhalLFY基因在植株根、莖、葉、花梗中的表達(dá)模式，其中root為根；stem為莖；scape為花梗；leaf為葉；

圖4是轉(zhuǎn)基因(PhalLFY基因)擬南芥的PCR鑒定。其中M為Marker 2000，WT為野生型擬南芥、-為轉(zhuǎn)空載體質(zhì)粒pBI121的擬南芥。1-6為篩選到的PhalLFY轉(zhuǎn)基因擬南芥株系編號。

圖5是轉(zhuǎn)基因擬南芥(35S::PhalLFY)和野生型擬南芥的(WT)開花表型比較。轉(zhuǎn)基因擬南芥明顯比野生型擬南芥提前開花，且轉(zhuǎn)基因擬南芥的腋芽多分化為花芽。

圖6是轉(zhuǎn)基因(PhalLFY)煙草的PCR鑒定。其中M為Marker 2000，WT為野生型煙草、-為轉(zhuǎn)空載體質(zhì)粒pBI121的煙草。1-6為篩選到的PhalLFY轉(zhuǎn)基因煙草株系編號。

圖7是轉(zhuǎn)基因煙草(35S::PhalLFY)和野生型煙草的(WT)開花表型比較。右圖的轉(zhuǎn)基因煙草盛花后，左圖的野生型煙草還沒有萌發(fā)花芽。轉(zhuǎn)基因煙草明顯比野生型煙草提前開花，且轉(zhuǎn)基因煙草的腋芽多已分化為花芽。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅以用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行。如J.薩姆布魯克等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》、F.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》中所述條件，或按照所用產(chǎn)品生產(chǎn)廠商的使用說明。

實(shí)施例1：

一、蝴蝶蘭PhalLFY基因的克隆及其同源性分析。

(1)以蝴蝶蘭(Phalaenopsis hybrida cv.Wedding Promenade)的花芽為實(shí)驗(yàn)材料，材料在溫室正常條件下生長(12h/12h；25-28℃)。

(2)RNA提?。河肨rizol reagent(購自Invitrogen公司)進(jìn)行試驗(yàn)材料的總RNA提取，整個(gè)操作過程嚴(yán)格按照Trizol試劑的RNA提取流程說明，然后再以該總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈。

(3)基因的克?。阂阅孓D(zhuǎn)錄的蝴蝶蘭花芽cDNA第一鏈為模板，利用引物L(fēng)FY-F和LFY-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物，測序，獲得600bp的核心片段。

LFY-F:5’-CGGAYATIAAYAARCCIAARATGMGICAYTA-3’

LFY-R:5’-CGACGTGICKIARIYKIGTIGGIACRTACCA-3’

利用該600bp的核心片段，根據(jù)RACE方法，設(shè)計(jì)擴(kuò)增3’端序列的引物PR1和PR2，以及擴(kuò)增5’端序列的引物PF1和PF2，引物為：

PF1:5'-TACAAGCCCCTCGTCGCCATCT-3'

PF2:5'-GACATCGACGCCGTCTTCA-3'

PR1:5'-GGCAGAGCTGACGGAGTTTGGTG-3'

PR2:5'-GGACGTAGTGTCGCATCTTAGGCTTGTT-3'.

PCR擴(kuò)增獲得5’端和3’端序列，最后與核心片段拼接獲得全長cDNA序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，該序列長度為1655bp，該序列的開放閱讀框?yàn)镾EQ ID NO.1的自5’端第41位至第1462位堿基，共1422bp，將該開放閱讀框命名為PhalLFY基因(蝴蝶蘭開花基因PhalLFY)，該基因編碼由473個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，命名為PhalLFY蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。將蝴蝶蘭的PhalLFY基因編碼的氨基酸序列用ClustalW2分析其同源性，結(jié)果顯示PhalLFY蛋白的氨基酸結(jié)構(gòu)非常保守，在N-和C-末端都有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，它包含亮氨酸重復(fù)區(qū)域，酸性區(qū)域,堿性區(qū)域；氨基酸序列的同源性分析顯示PhalLFY蛋白分別與倒距蘭LFY的同源性為68％、與紅門蘭LFY的為67％、與風(fēng)信子LFY-like的為61％,與水稻RFL為的60％、與百合LFY1的為59％、與金魚草FLO的為59％、與擬南芥LFY的為54％(見圖1)。進(jìn)化樹顯示所有的LFY/FLO同源基因被分成雙子葉和單子葉兩個(gè)分支，PhalLFY屬于單子葉分支。

實(shí)施例2

蝴蝶蘭開花基因PhalLFY的基因表達(dá)模式分析

在蝴蝶蘭營養(yǎng)生長期和生殖生長時(shí)期，取營養(yǎng)生長期的根、莖、葉以及生殖生長期的根、莖、葉、和花梗器官，用Trizol reagent(Invitrogen)分別提取這些器官的總RNA，測定OD260后定量取出2μgRNA，然后再使用oligo-dT引物和PrimeScript^TM Reverse Transcriptase(購自Takara公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(方法參考說明書)，以特異引物L(fēng)F：5'-ATCCCCGCCTCTCAATCT-3'和LR：5'-TCTCATCCGCACCAGTTC-3'.進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物以1.0％瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳結(jié)果如圖2和3所示，PhalLFY基因在蝴蝶蘭各器官中均有表達(dá)，營養(yǎng)生長階段，PhalLFY基因在各個(gè)器官中的表達(dá)都非常弱(圖2)；生殖生長階段，在根中的表達(dá)很弱，但在莖中的表達(dá)水平明顯提高(圖3)。

實(shí)施例3

蝴蝶蘭PhalLFY基因在擬南芥中的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定。

(1)含目的基因PhalLFY表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)引物PhLFYF 5’AATTCTAGAATGGACCCAAGCGACGCCTTCTCC3’

PhLFYR 5’CATGGATCCCTAAAGCATGGAAGGAGGGATTCC3’

以蝴蝶蘭花芽的cDNA作為模板，以PhLFYF和PhLFYR作為引物擴(kuò)增帶酶切位點(diǎn)Xba I和BamH I的蝴蝶蘭PhalLFY基因，連接到Takara的PMD18-T載體上，再根據(jù)J.薩姆布魯克等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行轉(zhuǎn)化和鑒定。將鑒定的陽性質(zhì)粒利用酶切位點(diǎn)Xba I和EcoR I從T載體上切下PhalLFY基因，與帶有35s啟動子和nos終止子的植物表達(dá)載體pBI121同樣用Xba I和EcoR I酶切后連接，構(gòu)建表達(dá)載體pBI121-35s-PhalLFY(經(jīng)測序驗(yàn)證，確認(rèn)如SEQ ID NO.1中的第41位至1462位堿基所示的PhalLFY基因插入了植物表達(dá)載體pBI121中)。

(2)將重組表達(dá)載體pBI121-35s-PhalLFY采用凍融法轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌GV3101中。

從-70℃中取出農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍，加入5μl重組表達(dá)載體pBI121-35s-PhalLFY，輕輕混勻，冰浴30min。

將此混合物轉(zhuǎn)移置研缽中，液氮速凍1min，迅速轉(zhuǎn)入37℃金屬浴中，將其融化，約2-3min。

向混合物中加入1ml LB液體培養(yǎng)基，于28℃搖床200rpm培養(yǎng)2-4h。所述的LB液體培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，其配方參考J.薩姆布魯克等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于LB+Kan(卡那霉素)50mg/L+Genta 25mg/L的平板上，吹干，封口，放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。

挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定引物采用實(shí)施例2中的特異擴(kuò)增引物L(fēng)F和LR，篩選含有目的基因(PhalLFY)的根瘤農(nóng)桿菌GV3101陽性克隆(即重組表達(dá)載體pBI121-35s-PhalLFY轉(zhuǎn)化進(jìn)入了根瘤農(nóng)桿菌GV3101中)。

(3)利用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥

挑取一個(gè)含有目的基因(PhalLFY)的根瘤農(nóng)桿菌GV3101陽性克隆，接種于LB+Kan(卡那霉素)50mg/L+Genta 25mg/L的液體培養(yǎng)基中，28℃200rpm振蕩培養(yǎng)24－36h，使OD₆₀₀＝0.8左右。

將菌液轉(zhuǎn)入無菌的50ml離心管中，5000rpm，15min離心收集菌種，再用同等體積的滲透培養(yǎng)基(1/2MS+0.5g/L MES+5％Sucrose，pH5.7)重懸農(nóng)桿菌，并加入表面活性劑Silwet，使其終濃度達(dá)到0.02％(200μl/L)。所述的MS培養(yǎng)基是本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，其配方參考(Murashige T and Skoog F,1962)。

將剛開花的擬南芥植株花序在此溶液中浸泡1min。斜置晾干多余的菌液。

將浸染菌液的擬南芥花序蓋膜保濕，黑暗培養(yǎng)8小時(shí)左右，再揭膜置于光照下正常管理成熟收獲種子。

(4)轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定。

收集當(dāng)代轉(zhuǎn)基因植株種子(T₀代)，滅菌(10％NaClO 10min，滅菌水漂洗6次)后播種于含有Kan抗生素(50mg/L)的1/2MS固體培養(yǎng)基上篩選。將生長10天左右的綠色抗性植株轉(zhuǎn)栽到盆缽里，基質(zhì)為泥炭土與蛭石比為3：1(體積比)。收集T₁代種子。將該種子種植于含有Kan抗生素(50mg/L)的1/2MS培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)分離比，選取符合3存活：1死亡分離比的轉(zhuǎn)基因株系植株移栽至缽里進(jìn)行栽培，收集T2代種子，將該種子種植于含有Kan抗生素(50mg/L)的1/2MS培養(yǎng)基上，種子在培養(yǎng)基上全部為綠苗，T2代種子為純合系。以T2代轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定檢測，PCR引物為PhLFYF2：5’ATGGACCCAAGCGACGCCTTCTCC3’，PhLFYR2：5’CTAAAGCATGGAAGGAGGGATTCC3’，檢測結(jié)果如圖4所示(部分結(jié)果)。PCR結(jié)果表明攜帶有外源蝴蝶蘭PhalLFY基因的表達(dá)質(zhì)粒已經(jīng)插入到擬南芥基因組中。由此而獲得轉(zhuǎn)入pBI121-35s-PhalLFY表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥。

(5)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型鑒定。

將轉(zhuǎn)基因擬南芥T2代植株(轉(zhuǎn)入pBI121-35s-PhalLFY表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥)和野生型擬南芥同等條件下進(jìn)行培養(yǎng)，與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥(轉(zhuǎn)入pBI121-35s-PhalLFY表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥)抽薹及開花時(shí)蓮座葉僅有7片葉，轉(zhuǎn)基因植株都比野生型擬南芥提前開花，同等培養(yǎng)條件下，野生型擬南芥需要26天開花，而轉(zhuǎn)入PhalLFY基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥僅需要15天開花。根據(jù)結(jié)果表明，PhalLFY基因超表達(dá)促進(jìn)擬南芥提前開花，同時(shí)促進(jìn)腋芽分化成花芽，出現(xiàn)多花枝現(xiàn)象，試驗(yàn)結(jié)果表明，蝴蝶蘭PhalLFY基因?yàn)橛泄δ艿幕颍粌H可以影響植株的發(fā)育，具有促進(jìn)生殖生長，縮短開花時(shí)間的作用，而且可以促進(jìn)腋芽分化成花芽，產(chǎn)生多花枝現(xiàn)象。

實(shí)施例4

蝴蝶蘭PhalLFY基因在煙草中的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定

1.含目的基因PhalLFY表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)引物PhLFYF 5’AATTCTAGAATGGACCCAAGCGACGCCTTCTCC3’

PhLFYR 5’CATGGATCCCTAAAGCATGGAAGGAGGGATTCC3’

以蝴蝶蘭花芽的cDNA作為模板，以PhLFYF和PhLFYR作為引物擴(kuò)增帶酶切位點(diǎn)Xba I和BamH I的蝴蝶蘭PhalLFY基因，連接到Takara的PMD18-T載體上，再根據(jù)J.薩姆布魯克等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行轉(zhuǎn)化和鑒定。將鑒定的陽性質(zhì)粒利用酶切位點(diǎn)Xba I和EcoR I從T載體上切下PhalLFY基因，與帶有35s啟動子和nos終止子的植物表達(dá)載體pBI121同樣用Xba I和EcoR I酶切后連接，構(gòu)建表達(dá)載體pBI121-35s-PhalLFY(經(jīng)測序驗(yàn)證，確認(rèn)如SEQ ID NO.1中的第41位至1462位堿基所示的PhalLFY基因插入了植物表達(dá)載體pBI121中)。

2.將表達(dá)載體pBI121-35s-PhalLFY采用電擊法轉(zhuǎn)化到根瘤農(nóng)桿菌LBA4404中

1)取1μl質(zhì)粒與剛制好的農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰上放置10min。

2)將此混合物轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的電極杯電擊。

3)向電擊杯中加入1000μl的YM液體培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，28℃，220-250rpm復(fù)蘇2-4小時(shí)。

4)將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板，放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。

5)挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定篩選陽性克隆，鑒定引物采用實(shí)施例2中的特異擴(kuò)增引物L(fēng)F和LR，此陽性克隆即為轉(zhuǎn)化進(jìn)入了表達(dá)載體pBI121-35s-PhalLFY的根瘤農(nóng)桿菌LBA4404。

3.利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草

1)挑取陽性克隆(含有表達(dá)載體pBI121-35s-PhalLFY的根瘤農(nóng)桿菌LBA4404)，接種于YM+Kan 50mg/L+硫酸鏈霉素25mg/L的液體培養(yǎng)基中，28℃200rpm振蕩培養(yǎng)24-36h，使OD₆₀₀＝0.5左右。

2)將菌液轉(zhuǎn)入無菌的50ml離心管中，5000rpm，15min離心收集菌種，再用同等體積的MS液體培養(yǎng)基懸浮菌種，準(zhǔn)備浸染煙草葉片。

3)于無菌條件下將煙草無菌苗的成熟葉片除去葉邊緣，切成0.5×1.0cm的小塊，浸泡在制備好的菌液中；

4)10min后取出葉片于滅菌的濾紙上吸去菌液，放在MS+3％蔗糖+0.6-0.7％瓊脂的培養(yǎng)基中，置于24±1℃光照培養(yǎng)箱中，14h光照/10h黑暗條件下共培養(yǎng)48小時(shí)；

5)當(dāng)看到葉片與培養(yǎng)基接觸邊緣長出白色農(nóng)桿菌時(shí)，將葉片轉(zhuǎn)移至不加激素的MS液體培養(yǎng)基中，于28±1℃恒溫?fù)u床上振蕩漂洗45-60min，夾出葉片放于滅菌的濾紙上除去多余的液體培養(yǎng)基；

6)將葉片轉(zhuǎn)入生芽篩選培養(yǎng)基(MS+500mg/L Carbincine+300mg/L Kanamicine+0.1mg/L NAA+1.0mg/L BA+0.59g/L+MES+3％蔗糖+0.6-0.7％瓊脂、pH 5.7-5.8)上，置于24±1℃光照培養(yǎng)箱中，14h光照/10h黑暗條件下培養(yǎng)；

7)約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(MS+200mg/L Carbincine+100mg/L Kanamicine+1.5％蔗糖+0.6-0.7％瓊脂、pH 5.7-5.8)中進(jìn)行篩選，置于24±1℃光照培養(yǎng)箱中，14h光照/10h黑暗條件下培養(yǎng)篩選；

8)待根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，溫室中培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因植株。

4.轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定

DNA的提取采用Takara的“Universal Genomic DNA Extraction Kit”。以轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定檢測，PCR引物為PhLFYF2：5’ATGGACCCAAGCGACGCCTT CTCC3’，PhLFYR2：5’CTAAAGCATGGAAGGAGGGATTCC3’。檢測結(jié)果如圖6所示(部分結(jié)果)。PCR結(jié)果表明攜帶有外源蝴蝶蘭PhalLFY基因的表達(dá)質(zhì)粒已經(jīng)插入到煙草基因組中，由此得到轉(zhuǎn)有PhalLFY基因的轉(zhuǎn)基因植株。

5.轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型鑒定

與野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因植株(轉(zhuǎn)有PhalLFY基因的轉(zhuǎn)基因植株)都比野生型煙草提前開花，花枝增多(圖7)。根據(jù)結(jié)果推測外源PhalLFY基因在宿主煙草中實(shí)現(xiàn)了超量表達(dá)，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因煙草的生殖生長和花芽發(fā)育，從而促進(jìn)了開花時(shí)間。