本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種提高CIK細(xì)胞增殖率和殺傷力的細(xì)胞培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：腫瘤的過繼性細(xì)胞免疫治療是指向腫瘤患者轉(zhuǎn)輸具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞(特異性和非特異性的)直接殺傷腫瘤或激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答殺腫瘤細(xì)胞，可作為手術(shù)、放療、化療的補(bǔ)充，以提高療效和改善患者的生存質(zhì)量。因此，近年來一直是腫瘤生物治療最活躍的領(lǐng)域。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokineinducedkillercells，CIK)是將人體外周血單個核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子刺激后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞群，它具有增殖能力強(qiáng)、殺瘤活性高、殺瘤譜廣等特點(diǎn)。CIK細(xì)胞能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，無嚴(yán)格的主要組織相容性復(fù)合體(Majorhistocompatibilitycomplex，MHC)限制性，特別是對于術(shù)后清除微小轉(zhuǎn)移灶、防止癌的擴(kuò)散和復(fù)發(fā)、提高患者自身抗腫瘤免疫能力有重要作用。對于無法手術(shù)或?qū)熌褪艿闹型砥谀[瘤患者也可起到改善生活質(zhì)量、延長生命的積極作用。提高CIK細(xì)胞的增殖率和殺傷力有助于提高過繼性細(xì)胞免疫治療的效果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種誘導(dǎo)CIK細(xì)胞的方法，以提高CIK細(xì)胞的增殖率和殺傷力。上述目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種提高CIK細(xì)胞增殖率和殺傷力的細(xì)胞培養(yǎng)方法：收集外周血的單個核細(xì)胞后進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)時在培養(yǎng)液中添加誘導(dǎo)增殖肽，利用誘導(dǎo)增殖肽作用于培養(yǎng)中的單個核細(xì)胞；所述誘導(dǎo)增殖肽為一種外源性多肽，序列如SEQIDNO.1所示。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液為含20％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)增殖肽作用于單個核細(xì)胞的濃度為10-20μmol/mL。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液中還添加有γ干擾素、抗人CD3單克隆抗體和重組人IL-2。優(yōu)選地，所述γ干擾素在培養(yǎng)液中的濃度為800-1200U/mL，所述抗人CD3單克隆抗體在培養(yǎng)液中的濃度為20-100ng/mL，所述重組人IL-2在培養(yǎng)液中的濃度為500-1500U/mL。優(yōu)選地，所述的提高CIK細(xì)胞增殖率和殺傷力的細(xì)胞培養(yǎng)方法具體包括如下步驟：步驟S1，取外周血，收集外周血的單個核細(xì)胞部分，離心，棄上清液，獲得單個核細(xì)胞；步驟S2，用完全培養(yǎng)液調(diào)整單個核細(xì)胞濃度為1×106/mL；所述完全培養(yǎng)液為含20％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，含有800-1200U/mL的γ干擾素和10-20μmol/mL的誘導(dǎo)增殖肽；步驟S3，培養(yǎng)24小時后，加入20-100ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500-1500U/mL重組人IL-2，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)；以后每隔2-3天用含20％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液半量換液，培養(yǎng)液中含20-100ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500-1500U/mL重組人IL-2；步驟S4，整個誘導(dǎo)培養(yǎng)過程為10-14天，即得高增殖率和殺傷率的CIK細(xì)胞。優(yōu)選地，所述γ干擾素的濃度為1000U/mL。優(yōu)選地，所述抗人CD3單克隆抗體的濃度為60ng/mL。優(yōu)選地，所述抗人CD3單克隆抗體為OKT3、UCHT1、HIT3a中的一種或多種。優(yōu)選地，所述重組人IL-2的濃度為1000U/mL。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的方法可以顯著提高CIK細(xì)胞的增殖率和殺傷力，有助于提高過繼性細(xì)胞免疫治療的效果。附圖說明圖1為CIK細(xì)胞的增殖倍數(shù)；圖2為CIK細(xì)胞對K562靶細(xì)胞的殺傷率。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例具體介紹本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例1：CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)制備包括如下步驟：步驟S1，采用血細(xì)胞分離機(jī)上的淋巴細(xì)胞采集程序，單采集人外周血單個核細(xì)胞部分，離心，棄上清液，獲得單個核細(xì)胞；步驟S2，用完全培養(yǎng)液調(diào)整單個核細(xì)胞濃度為1×106/mL；所述完全培養(yǎng)液為含20％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，含有1000U/mL的γ干擾素和15μmol/mL的誘導(dǎo)增殖肽；步驟S3，培養(yǎng)24小時后，加入60ng/mL抗人CD3單克隆抗體和1000U/mL重組人IL-2，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)；以后每隔3天用含20％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液半量換液，培養(yǎng)液中含60ng/mL抗人CD3單克隆抗體和1000U/mL重組人IL-2；抗人CD3單克隆抗體為OKT3、UCHT1、HIT3a的混合物，終濃度各為20ng/mL；步驟S4，整個誘導(dǎo)培養(yǎng)過程為12天，培養(yǎng)環(huán)境為5％CO2、37℃。培養(yǎng)結(jié)束后計數(shù)擴(kuò)增倍數(shù)并進(jìn)行細(xì)胞毒活性測定。實(shí)施例2：CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)制備包括如下步驟：步驟S1，采用血細(xì)胞分離機(jī)上的淋巴細(xì)胞采集程序，單采集人外周血單個核細(xì)胞部分，離心，棄上清液，獲得單個核細(xì)胞；步驟S2，用完全培養(yǎng)液調(diào)整單個核細(xì)胞濃度為1×106/mL；所述完全培養(yǎng)液為含20％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，含有800U/mL的γ干擾素和10μmol/mL的誘導(dǎo)增殖肽；步驟S3，培養(yǎng)24小時后，加入20ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500U/mL重組人IL-2，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)；以后每隔2天用含20％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液半量換液，培養(yǎng)液中含20ng/mL抗人CD3單克隆抗體和500U/mL重組人IL-2；抗人CD3單克隆抗體為OKT3；步驟S4，整個誘導(dǎo)培養(yǎng)過程為14天，培養(yǎng)環(huán)境為5％CO2、37℃。培養(yǎng)結(jié)束后計數(shù)擴(kuò)增倍數(shù)并進(jìn)行細(xì)胞毒活性測定。實(shí)施例3：CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)制備包括如下步驟：步驟S1，采用血細(xì)胞分離機(jī)上的淋巴細(xì)胞采集程序，單采集人外周血單個核細(xì)胞部分，離心，棄上清液，獲得單個核細(xì)胞；步驟S2，用完全培養(yǎng)液調(diào)整單個核細(xì)胞濃度為1×106/mL；所述完全培養(yǎng)液為含20％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，含有1200U/mL的γ干擾素和20μmol/mL的誘導(dǎo)增殖肽；步驟S3，培養(yǎng)24小時后，加入100ng/mL抗人CD3單克隆抗體和1500U/mL重組人IL-2，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)；以后每隔2天用含20％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液半量換液，培養(yǎng)液中含100ng/mL抗人CD3單克隆抗體和1500U/mL重組人IL-2；抗人CD3單克隆抗體為OKT3、UCHT1、HIT3a的混合物，OKT3和UCHT1終濃度各為30ng/mL，HIT3a濃度各為40ng/mL；步驟S4，整個誘導(dǎo)培養(yǎng)過程為10天，培養(yǎng)環(huán)境為5％CO2、37℃。培養(yǎng)結(jié)束后計數(shù)擴(kuò)增倍數(shù)并進(jìn)行細(xì)胞毒活性測定。實(shí)施例4：實(shí)施例1的對比實(shí)施例，不添加誘導(dǎo)增殖肽包括如下步驟：步驟S1，采用血細(xì)胞分離機(jī)上的淋巴細(xì)胞采集程序，單采集人外周血單個核細(xì)胞部分，離心，棄上清液，獲得單個核細(xì)胞；步驟S2，用完全培養(yǎng)液調(diào)整單個核細(xì)胞濃度為1×106/mL；所述完全培養(yǎng)液為含20％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，含有1000U/mL的γ干擾素；步驟S3，培養(yǎng)24小時后，加入60ng/mL抗人CD3單克隆抗體和1000U/mL重組人IL-2，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)；以后每隔3天用含20％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液半量換液，培養(yǎng)液中含60ng/mL抗人CD3單克隆抗體和1000U/mL重組人IL-2；抗人CD3單克隆抗體為OKT3、UCHT1、HIT3a的混合物，終濃度各為20ng/mL；步驟S4，整個誘導(dǎo)培養(yǎng)過程為12天，培養(yǎng)環(huán)境為5％CO2、37℃。培養(yǎng)結(jié)束后計數(shù)擴(kuò)增倍數(shù)并進(jìn)行細(xì)胞毒活性測定。實(shí)施例5：CIK細(xì)胞增殖倍數(shù)測定分別測定實(shí)施例1-4方法中CIK細(xì)胞的增殖倍數(shù)，結(jié)果如表1和圖1所示。表1CIK細(xì)胞的增殖倍數(shù)實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4增殖倍數(shù)36.32±7.4331.55±6.5439.87±8.799.46±1.77結(jié)果表明，本發(fā)明提供的誘導(dǎo)增殖肽可以顯著提高CIK細(xì)胞的增殖率。實(shí)施例6：CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性測定靶細(xì)胞為K562細(xì)胞株，效靶比5:1，1.8×105細(xì)胞總數(shù)/孔(96孔培養(yǎng)板)，每測量點(diǎn)設(shè)4個平行孔，效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞混合培養(yǎng)4h，加四甲基偶氮唑鹽(MTT)孵育2h后去上清，加二甲基亞砜(DMSO)，酶標(biāo)儀570nm處測吸光度(A)值，計算CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷率。實(shí)施例1-4制備的CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷率見表2和圖2。表2CIK細(xì)胞對K562靶細(xì)胞的殺傷率(％)實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3實(shí)施例4增殖倍數(shù)56.16±9.4850.44±8.9164.95±10.1328.78±3.55結(jié)果表明，本發(fā)明提供的誘導(dǎo)增殖肽可以顯著提高CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷率。實(shí)施例7：誘導(dǎo)增殖肽的制備本發(fā)明誘導(dǎo)增殖肽通過Fmoc法固相合成制備。Fmoc法固相合成技術(shù)：合成反應(yīng)按照從C端向N端進(jìn)行，Rink介質(zhì)上有自由氨基；每一步連接過程中，氨基酸殘基都要活化，活化混合物中有4倍于介質(zhì)上自由氨基的HBTU，HOBt，DIEA和Fmoc-氨基酸；每次氨基酸的連接反應(yīng)之后，都用一個吡啶/醋酸/N-甲基咪唑(3:2:0.5)的混合物來封閉未連接的自由氨基，封閉反應(yīng)10分鐘；每次氨基酸的連接反應(yīng)之后，下一個氨基酸連接之前，都要把介質(zhì)上的Fmoc-基團(tuán)去掉，去Fmoc-基團(tuán)使用含20％哌啶的二甲基甲酰胺，需15分鐘；最后，所有氨基酸殘基順序連接后，用98％三氟乙酸從Rink介質(zhì)上切割下來，切割在室溫下進(jìn)行2小時。經(jīng)質(zhì)譜鑒定確定為SEQIDNO.1所示序列。多肽的合成已經(jīng)非常成熟，也可委托生物外包公司合成。研究發(fā)現(xiàn)，如下結(jié)構(gòu)所示的六肽、七肽和八肽可以強(qiáng)化本發(fā)明誘導(dǎo)增殖肽對CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)效果，進(jìn)一步提高CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷力。六肽、七肽和八肽制備方法同實(shí)施例7。六肽：Lys-Trp-Cys-Ala-Glu-Ile七肽：Gln-Asp-Met-His-Gln-Leu-Gly八肽：Lys-Gln-Leu-Cys-Tyr-Met-Phe-Asp在實(shí)施例1誘導(dǎo)制備方法基礎(chǔ)上，步驟S2完全培養(yǎng)基中再添加0.2μmol/mL的六肽或七肽或八肽，CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷率可以提高到(73.16±10.42)％、(76.35±11.46)％、(80.06±12.17)％。但是，若不添加誘導(dǎo)增殖肽，即便添加了六肽或七肽或八肽，CIK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷率也僅與實(shí)施例4基本一致，不超過30％。這表明，上述六肽、七肽和八肽可強(qiáng)化本發(fā)明誘導(dǎo)增殖肽對CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)效果，但本身不具有提高CIK細(xì)胞殺傷力的作用。綜上，本發(fā)明提供的方法可以顯著提高CIK細(xì)胞的增殖率和殺傷力，有助于提高過繼性細(xì)胞免疫治療的效果。上述實(shí)施例的作用僅在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3