一種治療代謝疾病的重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白及其制備方法和應用與流程

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本發(fā)明涉及重組蛋白領域，尤其涉及一種重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白及其制備方法，本發(fā)明還涉及該重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白在制備治療代謝疾病藥物中的用途，屬于成纖維細胞生長因子技術領域。

背景技術：

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM），是一類由胰腺功能病變的慢性代謝類疾病，以高血糖為主要特征，是一種終身疾病。其發(fā)病機理是胰島素抵抗或胰島素分泌減少，導致機體糖脂代謝紊亂所致。隨著世界人口的老齡化，糖尿病已成為一種常見病、多發(fā)病，現(xiàn)已成為繼癌癥和心腦血管病之后，第三大威脅人類生命的疾?。∟athan DM, et al. Medical management of hyperglycaemia in type 2 diabetes: a consensus algorithm for the initiation and adjustment of therapy. Diabetes Care 2009; 32: 193–203. Culy CR, Jarvis B. Repaglinide: a review of its therapeutic use in type 2 diabetes mellitus [J]. Drugs, 2001, 61(11): 1625）。

隨著經(jīng)濟的日益發(fā)展，我國的糖尿病患者數(shù)量也呈上升趨勢，據(jù)調查結果估計，現(xiàn)中國大約有1億糖尿病患者。目前治療糖尿病的藥物大多數(shù)是以胰島素為核心發(fā)揮作用，如胰島素類制劑或其增敏劑類藥物等，但這些藥物對有些糖尿病患者特別是II型糖尿病的晚期患者效果仍然不夠理想。由于沒有可替代胰島素的藥物和更先進的治療手段，盡管病人對胰島素產生抵抗作用，導致上述藥物無法奏效，胰島素仍然是治療II型糖尿病的首選藥物。隨著胰島素抵抗作用的不斷加劇，胰島素的療效逐漸減弱，血糖無法控制在正常水平。由于血糖長期維持在較高水平，從而導致很多嚴重的并發(fā)癥，如失明、腎衰、心腦血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。因此II型糖尿病的臨床治療中一直迫切需要一種能取代胰島素，解決胰島素抵抗的新型藥物。

成纖維細胞生長因子（FGF）21屬于FGF家族中一名新成員，F(xiàn)GF21基因主要在肝臟和脂肪中表達，F(xiàn)GF21在體外能夠促進HepG2細胞和3T3-L1脂肪細胞消耗葡萄糖，在動物體內具有降低血糖和甘油三酯等功能，并且不會產生低血糖和引起腫瘤發(fā)生等副作用（Kharitonenkov A, et al. FGF-21 as a novel metabolic regulator. J Clin Invest 2005; 115:1627–35. Kharitonenkov A, et al. The metabolic state of diabetic monkeys is regulated by fibroblast growth factor-21. Endocrinology 2007;148:774–81）。FGF21安全、有效以及不依賴胰島素調節(jié)生物體內血糖水平的特點，使其有望成為治療II型糖尿病的新型藥物。然而，隨著對FGF21的深入了解，我們發(fā)現(xiàn)野生型人FGF21（hFGF21）的生物學功能及臨床應用受到了體內穩(wěn)定性和自身免疫原性的制約（Huang Z, et al. A better anti-diabetic recombinant human fibroblast growth factor 21 (rhFGF21) modified with polyethylene glycol. PLoS One 2011;6:e20669. Ye X, et al. Enhancement of the pharmacological efficacy of FGF-21 by genetic modification and PEGylation. Curr Pharm Biotechnol 2014;14:1287–98.），故對hFGF21進行改造和修飾將逐漸成為近年來研究的熱點。

人血清白蛋白（HSA）是由585個氨基酸殘基組成的單鏈無糖基化的球形蛋白質，是人體血清內含量最高的蛋白，分子量為66kDa，第356位的蘇氨酸是可能存在O-糖基化位點（He, X.M. and D.C. Carter, Atomic structure and chemistry of human serum albumin. Nature, 1992. 358(6383): p. 209-15.），其在調節(jié)血液滲透壓和促進傷口愈合等方面起著重要的作用，并且具有人體相容性好、分子量大、半衰期長及無酶活性和免疫原性等優(yōu)點，這使得白蛋白融合技術在研制長效重組蛋白藥物領域倍受關注（Nel, M.R., Human albumin administration in critically ill patients. Critical analysis of original studies has to take place. BMJ, 1998. 317(7162): p. 882.）。很多具有治療功能的蛋白質，如干擾素、人生長激素和IL-2等，經(jīng)過白蛋白融合技術的改造后，都可以開發(fā)成為具有藥效更佳和注射次數(shù)減少等優(yōu)點的重組蛋白藥物。白蛋白融合技術的優(yōu)勢在于其不需要額外的化學修飾，生產工藝簡單，產物均一，且質量控制相對容易，延長藥物半衰期的效果可能要比化學修飾（如PEG修飾和乙?；龋└行В∕uller, N., et al., Superior serum half life of albumin tagged TNF ligands. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2010. 396(4): p. 793-799.）。但在白蛋融合蛋白的表達和儲存過程中伴有降解和聚合現(xiàn)象，增加了純化的難度和臨床用藥時出現(xiàn)免疫反應的風險（Yao, X.Q., et al., Degradation of HSA-AX15(R13K) when expressed in Pichia pastoris can be reduced via the disruption of YPS1 gene in this yeast. J Biotechnol, 2009. 139(2): p. 131-6. Cordes, A.A., et al., Selective domain stabilization as a strategy to reduce fusion protein aggregation. J Pharm Sci, 2012. 101(4): p. 1400-9. Cordes, A.A., J.F. Carpenter, and T.W. Randolph, Selective domain stabilization as a strategy to reduce human serum albumin-human granulocyte colony stimulating factor aggregation rate. J Pharm Sci, 2012. 101(6): p. 2009-2016.）。近來研究發(fā)現(xiàn)，HSA 第 381-585位氨基酸殘基構成的第3結構域（3DHSA）是HSA與新生兒Fc受體（FcRn）結合的關鍵部位，在受體介導的胞吞保護作用下耐受蛋白酶的降解，從而保證HSA具有較長的半衰期（Andersen, J.T., J.D. Qian, and I. Sandlie, The conserved histidine 166 residue of the human neonatal Fc receptor heavy chain is critical for the pH-dependent binding to albumin. Eur J Immunol, 2006. 36(11): p. 3044-3051.）?；趯Π椎鞍组L效機制的深入認識，Kenanova 等（Kenanova, V.E., et al., Tuning the serum persistence of human serum albumin domain III:diabody fusion proteins. Protein Eng Des Sel, 2010. 23(10): p. 789-98.）將3DHSA 作為融合伴侶，構建了一系列抗癌胚抗原雙抗體與3DHSA的融合蛋白，證明了3DHSA作為融合伴侶延長蛋白藥物半衰期的可行性。

蛋白穩(wěn)定性的高低直接影響其在宿主細胞中的表達量，為了提高蛋白產量及穩(wěn)定性，并在不影響蛋白原有活性的基礎上，需要將FGF21進行適當?shù)耐蛔?。本發(fā)明通過對野生型hFGF21進行基因突變，并將其與HSA或3DHSA連接成融合蛋白的形式來提高FGF21的穩(wěn)定性，為以后FGF21的產業(yè)化提供了重要的技術幫助。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術問題是提供了一種治療代謝疾病的重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白及其制備方法，該重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白能夠用于制備治療糖尿病或肥胖癥的藥物或藥物組合物。

本發(fā)明為解決上述技術問題采用如下技術方案，一種治療代謝疾病的重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白，其特征在于是將人成纖維細胞生長因子21重組蛋白mFGF21與HSA或3DHSA連接而成的重組融合蛋白mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21，其中重組蛋白mFGF21的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，重組融合蛋白mFGF21-HSA的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，重組融合蛋白HSA-mFGF21的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示，重組融合蛋白mFGF21-3DHSA的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，重組融合蛋白3DHSA-mFGF21的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示。

本發(fā)明所述的重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白編碼基因，其特征在于：所述的重組融合蛋白mFGF21-HSA編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，重組融合蛋白HSA-mFGF21編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，重組融合蛋白mFGF21-3DHSA編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，重組融合蛋白3DHSA-mFGF21編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示。

本發(fā)明所述的重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白編碼基因的表達載體及含有該表達載體的宿主細胞，其特征在于：所用的表達載體優(yōu)選為pET30a（+），宿主細胞優(yōu)選為Rossetta（DE3）。

本發(fā)明所述的重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白的制備方法，其特征在于具體步驟為：將重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白編碼基因的核苷酸序列與表達載體相連接得到重組表達載體；再將該重組表達載體轉化宿主細胞，然后篩選高表達陽性宿主細胞，培養(yǎng)細胞并誘導表達重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白，收集菌體、破碎、離心、澄清、純化，得到目標產物治療代謝疾病的重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白。

本發(fā)明所述的重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白在制備治療代謝疾病藥物中的應用，其中代謝疾病包括糖尿病、肥胖癥和代謝綜合癥。

本發(fā)明所述的用于治療糖尿病或肥胖癥的藥物組合物，其特征在于包括治療上有效劑量的重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白和藥學上可接受的載體或輔料。

本發(fā)明的細胞試驗和動物學試驗結果表明，人成纖維細胞生長因子21重組蛋白（mFGF21）相比于野生型hFGF21蛋白，活性顯著提高，能夠更加有效降低糖尿病小鼠體內的血糖水平。此外，人成纖維細胞生長因子21重組蛋白和重組融合蛋白能夠較好的控制血糖波動，穩(wěn)定維持24小時血糖處于正常水平。特別是mFGF21與HSA或3DHSA連接的重組融合蛋白，其降糖效果更佳。本發(fā)明的mFGF21或其重組融合蛋白可作為藥物治療糖尿病、肥胖癥或代謝綜合癥等代謝疾病。

附圖說明

圖1是突變蛋白mFGF21與野生型hFGF21蛋白在大腸桿菌中表達量的SDS-PAGE電泳分析圖；

圖2是純化后突變蛋白mFGF21和野生型hFGF21蛋白的SDS-PAGE電泳分析圖；

圖3是融合蛋白mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21在大腸桿菌中表達量的SDS-PAGE電泳分析圖；

圖4是純化后融合蛋白mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21的SDS-PAGE電泳分析圖；

圖5是6種蛋白的體內半衰期比較圖；

圖6是6種蛋白的體外細胞活性檢測圖；

圖7是STZ誘導的I型糖尿病小鼠長期注射6種蛋白后每周血糖水平的變化曲線；

圖8是STZ誘導的I型糖尿病小鼠注射不同蛋白8周后血糖、糖化血紅蛋白及甘油三脂水平的變化曲線；

圖9是II型糖尿病db/db小鼠長期注射6種蛋白后每周血糖水平的變化曲線；

圖10是II型糖尿病db/db小鼠注射不同蛋白8周后血糖、糖化血紅蛋白及甘油三脂水平的變化曲線。

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。

說明：本發(fā)明中涉及的基因的設計、合成和克隆、表達載體的構建、核酸提取、測序和鑒定，以及表達產物的分離和純化等操作步驟，可按照本領域已知的技術進行（參見CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY）。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1

mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21表達載體的構建

根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，設計出5種基因，其核苷酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:1（mFGF21）、SEQ ID NO:2（mFGF21-HSA）、SEQ ID NO:3（HSA-mFGF21）、SEQ ID NO:4（mFGF21-3DHSA）和SEQ ID NO:5（3DHSA-mFGF21）所示。將這5種基因送至上海捷瑞生物公司合成，同時在各基因兩端設計NdeI與BamHI兩酶切位點。

將5種合成的含有各自目的基因片段的載體和pET30a（+）分別用NdeI與Bam HI雙酶切，酶切完畢后，膠回收各自需要的目標片段。使用T4 DNA連接酶將5種目的片段分別與原核表達載體pET30a（+）連接，連接反應體系為10μL，混勻，4℃連接過夜，然后各自轉化至大腸桿菌DH5α中。挑取陽性克隆，經(jīng)過酶切鑒定后，即分別構建得到5種重組質粒pET30a-mFGF21、pET30a-mFGF21-HSA、pET30a-HSA-mFGF21、pET30a-mFGF21-3DHSA和pET30a-3DHSA-mFGF21。

實施例2

mFGF21蛋白的表達及純化

（1）轉化、培養(yǎng)并誘導表達

將含有正確序列的重組質粒pET30a-mFGF21轉化至表達菌株Rosseta（DE3）（北京全式金生物技術有限公司，目錄號：CD801）。轉化后的單菌落分別接種至20mL含Kan（50μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8h，以體積比為1:100接種于另一20mL含Kan（50μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，當A₆₀₀在0.35左右時，加入IPTG至終濃度為0.25mmol/L進行誘導，誘導溫度為30℃，5h后收獲菌體，用Lysis buffer（20mmol/L Tris，150mmol/L NaCl，pH 8.0）重懸菌體，破碎菌體后離心，分別取上清和沉淀進行12wt% SDS-PAGE電泳分析。如圖1所示，泳道1：蛋白標準分子量Marker；2、3、4：hFGF21全菌、上清、沉淀；5、6、7：mFGF21全菌、上清、沉淀，結果顯示突變后的mFGF21在大腸桿菌中表達量顯著增加，目標蛋白大部分以包涵體形式存在。

（2）蛋白純化

向菌體中加入一定濃度溶菌酶（1mg/mL），冰上放置30min，超聲波細胞破碎菌體細胞（工作1s，間隔1s，4min/次，共3次循環(huán)）。菌體破碎徹底后，利用QuixStand預處理系統(tǒng)（750kD超濾中空纖維柱）處理細胞破碎液，富集包涵體，棄去膜透過端液體。當總體積約為60mL時，加入100mL wash buffer（20mmol/L Tris，2mol/L Urea，150mmol/L NaCl，pH 8.0）洗滌包涵體。當溶液體積為50mL，再向其中加入洗滌液100mL，重復上述實驗4次。

洗滌完畢后，當溶液體積為50mL，關閉透過端，向洗滌后的包涵體中加入150mL的變性液（20mmol/L Tris，10mol/L Urea，150mmol/L NaCl，pH 8.0），循環(huán)變性2小時。打開透過端，膜透過端收集液即為mFGF21變性液。用5KD中空纖維柱對變性后的mFGF21進行濃縮，至體積80mL后進行復性，將裝有復性液（20mmol/L Tris，50mmol/L NaCl，pH 8.0）的容器用膠皮管與中空纖維柱的儲液器連接。儲液器密封后，透過端流出液體后，由于儲存器中產生負壓，使復性液以一定的速度滴加至變性液中，緩慢勻速復性。當加入復性液體積為變性液6倍時，即復性完畢，8000rpm/min，4℃離心20min，收集上清。復性上清液經(jīng)AKTA purifier 100系統(tǒng)，與5倍柱體積IEX buffer A（20mmol/L Tris、10mmol/L NaCl，pH 8.0）平衡好的Capto Q柱（裝于XK16/20空柱，柱高10cm，流速300cm/h）完全結合后，用3-4倍柱體積IEX buffer A沖洗；當紫外曲線達到穩(wěn)定的基線時，利用IEX buffer A和IEX buffer B（20mmol/L Tris，1mol/L NaCl，pH 8.0）混合液洗脫，15wt%和100wt% IEX buffer B液沖洗雜蛋白，18.5wt%-19wt% IEX buffer B液洗脫目標蛋白，收集各洗脫峰，并進行15wt% SDS-PAGE電泳分析。結果顯示純化后蛋白純度在95%以上，如圖2所示，泳道1：蛋白標準分子量Marker；2：純化后的mFGF21；3：純化后的hFGF21。

實施例3

mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21四種融合蛋白的表達及純化

（1）轉化、培養(yǎng)并誘導表達

將含有正確序列的4種重組質粒pET30a-mFGF21-HSA、pET30a-HSA-mFGF21、pET30a-mFGF21-3DHSA和pET30a-3DHSA-mFGF21分別轉化至表達菌株Rosseta（DE3）（北京全式金生物技術有限公司，目錄號：CD801）。轉化后的單菌落分別接種至20mL含Kan（50μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8h，以體積比為1:100接種于另一20mL含Kan（50μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，當A₆₀₀在0.35左右時，加入IPTG至終濃度為0.25mmol/L進行誘導，誘導溫度為30℃，5h后收獲菌體，用Binding buffer（20mmol/L Na₃PO₄，pH 7.0）重懸菌體，破碎菌體后離心，分別取上清和沉淀進行12wt% SDS-PAGE電泳分析。結果顯示mFGF21與HSA或3DHSA連接后的融合蛋白大部分以可溶性形式表達，如圖3所示，A圖泳道1、2：mFGF21-HSA菌體上清、菌體沉淀；3、4：HSA-mFGF21菌體上清、菌體沉淀；5：蛋白標準分子量Marker；B圖泳道1：蛋白標準分子量Marker；2、3：3DHSA-mFGF21菌體上清、菌體沉淀；4、5：mFGF21-3DHSA菌體上清、菌體沉淀。

（2）蛋白純化

向菌體中加入一定濃度溶菌酶（1mg/mL），冰上放置30min，超聲破碎菌體細胞（工作1s，間隔1s，4min/次，共3次循環(huán)）。破碎徹底后，12000rpm，4℃離心15min，收集上清。上清液過0.22μm濾膜澄清后，通過泵進入AKTA purifier 100系統(tǒng)，與2-3倍柱體積Binding buffer平衡好的Blue Sepharose 6FF柱（裝于XK16/20空柱，柱高10cm，流速100cm/h）完全結合后，用4-5倍柱體積的binding buffer沖洗雜蛋白，當紫外曲線達到穩(wěn)定的基線時，再用2-3倍柱體積Elution buffer（20mmol/L Na₃PO₄，2 mol/L NaCl，pH 7.0）洗脫目的蛋白，把結合在填料上的融合蛋白洗脫下來并收集到試管中。

把Superdex 75凝膠過濾柱（裝于Column XK26/70空柱中，柱體積340mL，流速2mL/min）接到AKTA purifier 100系統(tǒng)中，先用2倍柱體積的蒸餾水替換其保護液（體積分數(shù)為20%乙醇），再用2倍柱體積的Desalting buffer（20mmol/L Na₃PO₄、150mmol/L NaCl，pH7.0）平衡柱子，然后將親和層析洗脫液通過Superloop進樣。收集各洗脫峰，并進行15wt% SDS-PAGE電泳分析，結果顯示經(jīng)純化過后，四種融合蛋白純度在95%以上，如圖4所示，A圖泳道1：蛋白標準分子量Marker；2：純化后的HSA-mFGF21融合蛋白；3：純化后的mFGF21-HSA融合蛋白；B圖泳道1：純化后的mFGF21-3DHSA融合蛋白；2：純化后的3DHSA-mFGF21融合蛋白；3：蛋白標準分子量Marker。

實施例4

5種蛋白mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21的體內半衰期檢測

選取體重約2kg的家兔18只，隨機分為6組。每組分別皮下注射6種蛋白hFGF21、mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21，劑量30nmol/kg，在給藥后的0h、1h、3h、5h、7h、24 h，于耳緣靜脈采血800μL左右。12000r/m離心10min，取上清保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

ELISA間接法測定6種蛋白的體內半衰期：用稀釋好不同濃度的hFGF21、mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21蛋白（2μg/mL、0.2μg/mL、200ng/mL、20ng/mL和2ng/mL）分別建立蛋白濃度含量的標準曲線，將稀釋后的標準蛋白和血清包被酶標板，應用ELISA間接法測定各血清中目標蛋白的含量，統(tǒng)計學分析并計算出6種蛋白的體內半衰期。體內半衰期t_1/2=0.301*（t₂-t₁）/log（OD₁/OD₂），其中OD₁和OD₂分別表示t1和t2時取出血清所對應酶標板上的平均光吸收值。

結果如圖5所示，經(jīng)公式計算出突變蛋白mFGF21和融合蛋白mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA、3DHSA-mFGF21及野生型蛋白hFGF21的體內半衰期分別約為54min、579min、596min、467min、489min和36min，說明了hFGF21蛋白經(jīng)突變改造和融合表達后體內半衰期顯著增加。

實施例5

5種蛋白mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21的體外糖吸收活性檢測

HepG2細胞培養(yǎng)：HepG2細胞（中國醫(yī)學科學院基礎所細胞庫）為人肝癌細胞株，其生長條件為高糖DMEM培養(yǎng)基，其中加入10wt%新生牛血清NCS（Invitrogen Corporation）、青霉素100μg/mL、鏈霉素100μg/mL，在37℃、體積分數(shù)5% CO₂、飽和濕度條件下培養(yǎng)。當細胞生長至高密度時，應進行傳代，用0.25wt%胰蛋白酶液消化后，以體積比為1:3-1:5的比例將細胞接種于新的培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

HepG2細胞接種與處理：用質量濃度為0.25%胰蛋白酶消化液消化生長狀態(tài)良好的HepG2細胞，離心收集細胞，按照2.5×10⁴的密度將細胞接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每孔中培養(yǎng)液體積為200μL。當細胞生長至均勻單層時，棄去上層培養(yǎng)液加入新鮮的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h后，即可加入待測蛋白檢測活性。

加樣HepG2細胞饑餓12h后，分別用不同濃度（10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L）的hFGF21、mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21 六種蛋白刺激細胞24h，用GOD-POD法檢測培養(yǎng)基中殘留的葡萄糖含量。取培養(yǎng)基上清液2μL加入到200μL葡萄糖檢測液中，每孔葡萄糖至少重復檢測3次，37℃反應5-10min后，在500nm波長下測OD值。計算葡萄糖消耗率，并運用統(tǒng)計學分析實驗結果。

培養(yǎng)液中殘留的葡萄糖濃度和細胞葡萄糖消耗率的計算公式如下：

葡萄糖濃度（mmol/L）=OD_樣品/OD_標準×5.55mmol/L

細胞葡萄糖消耗率（%）=[(C_{空白葡萄糖}-C_{給藥葡萄糖}) / C_{空白葡萄糖}] ×100%

數(shù)據(jù)分析結果如圖6所示，結果顯示，不同濃度時經(jīng)mFGF21蛋白刺激的細胞葡萄糖吸收都高于hFGF21蛋白刺激的細胞葡萄糖吸收，且在中、高濃度下的細胞葡萄糖吸收都顯著高于hFGF21蛋白刺激的細胞葡萄糖吸收（^**p<0.01），呈現(xiàn)劑量依賴性，說明mFGF21蛋白活性優(yōu)于hFGF21蛋白。而相對于mFGF21，mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21四種蛋白的體外細胞糖吸收活性也顯著增加，且在低、中、高三種劑量下，差異極顯著（^##p<0.01），其中3DHSA-mFGF21融合蛋白的體外活性最佳。

實施例6

5種蛋白mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21的體內藥效檢測

一、本發(fā)明5種蛋白在I型糖尿病動物模型上的活性檢測

I型糖尿病動物模型制備：雄性C57BL/6小鼠（購置于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物質量合格證號SCXK（滬）2012-0005）適應性飼喂至體重達到35g左右時開始實驗。適應性喂養(yǎng)2周，選取體重25-30g小鼠60只隨機分為6只正常對照組小鼠和52只造模組小鼠，準備開始造模。造模前小鼠需禁食不禁水12h，次日，造模組通過腹腔注射方式按體重比40mg/kg注射STZ注射液，恢復正常飲食，并給予1wt%的葡萄糖水飲用，間隔1d后再次禁食不禁水12h后，通過腹腔注射方式按體重比30mg/kg注射STZ注射液，間隔1d后第3次通過腹腔注射方式按體重比20mg/kg注射STZ注射液；對照組只注射檸檬酸-檸檬酸鈉（pH 4.4）緩沖液。腹腔注射過程中，注意注射器針頭插入的深度及角度，避免傷到小鼠內臟器官。STZ注射后，每隔7d檢測一次小鼠空腹血糖和體重的變化。將注射4周后空腹血糖濃度>16.65mmol/L的小鼠判定為I型糖尿病動物模型。

分組，給藥及指標檢測：選取成模的血糖值低于25mmol/L的I型糖尿病小鼠42只，隨機分為模型對照組、hFGF21組、mFGF21組、mFGF21-HSA組、HSA-mFGF21組、mFGF21-3DHSA組和3DHSA-mFGF21組，每組6只。于每天早上8點半左右給予實驗組相應的受試物一次，皮下注射，劑量50nmol/kg，模型對照組注射相同體積的生理鹽水，連續(xù)給藥8周。實驗過程中自由飲食、飲水。

于每周第一天早上8點左右尾靜脈采血測定各實驗組小鼠血糖水平，給藥8周后，各實驗組小鼠處死（前夜禁食），眼球取血測定實驗小鼠血糖（BG）、糖基化血紅蛋白（GHb）和甘油三脂（TG）水平。所得實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

實驗檢測數(shù)據(jù)如圖7、8所示，圖7結果表明，相對于模型對照組，6種給藥組小鼠血糖在給藥1周后下降顯著，且之后每周血糖變化趨勢一致，但與hFGF21組相比，mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21 五組小鼠血糖水平下降迅速。mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21 五種蛋白在I型糖尿病小鼠上的長效降糖效果明顯優(yōu)于hFGF21，作用持續(xù)時間長，其中3DHSA-mFGF21組小鼠長期降糖效果最佳。

糖基化血紅蛋白（GHb）測試通?？梢苑从郴颊呓?-12周的血糖控制情況，故本實驗檢測給藥8周后各實驗組小鼠血糖和糖基化血紅蛋白水平來比較6種蛋白控制血糖波動的能力。結果如圖8所示，進一步說明了mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21 五種蛋白對I型糖尿病小鼠的血糖水平具有長久持續(xù)的調控作用，且效果顯著優(yōu)于hFGF21。

給藥8周后，各實驗組小鼠血清甘油三脂水平結果如圖8所示，相對于生理鹽水組，六種蛋白都能顯著降低TG含量。而與hFGF21相比，mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21 五種蛋白在I型糖尿病小鼠的血脂水平上表現(xiàn)出更佳的改善效果。

二、本發(fā)明5種蛋白在II型糖尿病動物模型上的活性檢測

分組、給藥及指標檢測：取SPF級9-11周齡雄性db/db小鼠（購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物質量合格證號SCXK（滬）2012-0005）50只，預飼養(yǎng)1周后稱重，次日禁食不禁水6h，尾靜脈取血測定小鼠的空腹血糖，剔除體重異常，篩選血糖值相對接近均值的成模小鼠42只，隨機分為模型對照組、hFGF21組、mFGF21組、mFGF21-HSA組、HSA-mFGF21組、mFGF21-3DHSA組和3DHSA-mFGF21組，每組6只。于每天早上8點半左右給予實驗組相應的受試物一次，皮下注射，劑量50nmol/kg，模型對照組注射相同體積的生理鹽水，連續(xù)給藥8周。實驗過程中自由飲食、飲水。

實驗檢測數(shù)據(jù)如圖9、10所示，圖9結果表明，相對于模型對照組，6種給藥組小鼠血糖在給藥1周后下降顯著，且之后每周血糖變化趨勢一致，但與hFGF21組相比，mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21五組小鼠血糖水平下降迅速。mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21 五種蛋白在II型糖尿病小鼠上的長效降糖效果明顯優(yōu)于hFGF21，作用持續(xù)時間長，其中3DHSA-mFGF21組小鼠長期降糖效果最佳。

糖基化血紅蛋白（GHb）測試通?？梢苑从郴颊呓?-12周的血糖控制情況，故本實驗檢測給藥8周后各實驗組小鼠血糖和糖基化血紅蛋白水平來比較6種蛋白控制血糖波動的能力。結果如圖10所示，進一步說明了mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21五種蛋白對II型糖尿病小鼠的血糖水平具有長久持續(xù)的調控作用，且效果顯著優(yōu)于hFGF21。

給藥8周后，各實驗組小鼠血清甘油三脂水平結果如圖10所示，相對于生理鹽水組，六種蛋白都能顯著降低TG含量。而與hFGF21相比，mFGF21、mFGF21-HSA、HSA-mFGF21、mFGF21-3DHSA和3DHSA-mFGF21五種蛋白在II型糖尿病小鼠的血脂水平上表現(xiàn)出更佳的改善效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南師范大學

<120> 一種治療代謝疾病的重組人成纖維細胞生長因子21融合蛋白及其制備方法和應用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> SEQ ID NO:1

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:1

gcagactcca gtcctctcct gcaattcggg ggccaagtcc ggcagcggta cctctacaca 60

gatgatgccc agcgtacaga agcccacctg gagatcaggg aggatgggac ggtggggggc 120

gctgctgacc agagccccga aagtctcctg cagctgaaag ccttgaagcc gggagttatt 180

caaatcttgg gagtccgtac accgaggttc ctgtgccagc ggccagatgg ggccctgtat 240

ggatcgctcc actttgaccc tgaggcctgc agcttccggg agctgcttct tgaggacgga 300

tacaatgttt accagtccga agcccacggc ctcccgctgc acctgccagg gaacaagtcc 360

ccacaccggg accctgcacc ccgaggacca gctcgcttcc tgccactacc attcctgccc 420

cccgcactcc cggagccacc cggaatcctg ggtccccagc cccccgatgt gggctcctcg 480

gaccctctga gcatggtggg accttcccag ggccgaagcc ccagctacgc ttcctga 537

<210> SEQ ID NO:2

<211> 2355

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:2