本發(fā)明涉及一種源于桔綠木霉的生物堿類化合物青霉烯醇E1在惡性黑色素瘤方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

生物堿是一類由生物次級代謝產(chǎn)生的含氮有機化合物，自然界中的生物堿種類較多，大多來源于植物，因此又有植物堿之稱。生物堿對人和動物有重要的生理作用，包括平喘鎮(zhèn)咳、降血糖、降血脂、抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等，其中以抗菌、抗腫瘤活性最為突出。天然結(jié)構(gòu)生物堿是創(chuàng)新藥物研究中發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的重要來源，目前應(yīng)用于臨床的生物堿藥物已經(jīng)近百種。研究發(fā)現(xiàn)，一些海洋真菌能夠在次級代謝過程中產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性好的生物堿，具有很好的藥用和產(chǎn)業(yè)化前景。

本發(fā)明人研究得知，桔綠木霉（Trichoderma citrinoviride.）IBPT-4（已于2013年1月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：武漢 武漢大學，保藏編號是：CCTCC NO：M 2013055）的發(fā)酵產(chǎn)物的粗提取物有很好的腫瘤細胞增殖抑制活性，遂對其活性成分進行研究。研究發(fā)現(xiàn)，所示生物堿類化合物針對惡性黑色素瘤具有抗腫瘤活性，而目前尚未見該化合物的化學結(jié)構(gòu)及其針對惡性黑色素瘤細胞增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有與此相關(guān)的藥物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種源于桔綠木霉的生物堿類化合物在惡性黑色素瘤方面的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種源于桔綠木霉的生物堿類化合物在制備針對惡性黑色素瘤細胞增殖抑制藥物中的用途，或該化合物在制備抗惡性黑色素瘤藥物中的用途；

所述化合物的化學結(jié)構(gòu)式為：

；

其結(jié)構(gòu)特征是：含有一個五環(huán)酰胺的分子骨架、含有一個羰基連接一條十碳飽和脂肪長鏈、N上連接一個甲基、分子中存在兩個羥基基團。

所述化合物是將桔綠木霉（Trichoderma citrinoviride.）IBPT-4進行發(fā)酵培養(yǎng)，然后從其菌絲體和發(fā)酵液提取物中分離得到的；所述桔綠木霉（Trichoderma citrinoviride.）IBPT-4已于2013年1月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：武漢 武漢大學，保藏編號是：CCTCC NO：M 2013055。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：本發(fā)明所得化合物是一個結(jié)構(gòu)新穎的生物堿，其具有顯著的抗惡性黑色素瘤活性，而目前尚未見該化合物的化學結(jié)構(gòu)及其針對惡性黑色素瘤細胞增殖抑制活性的報道，因此市場上也尚未見有與此相關(guān)的藥物。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所得生物堿類化合物主要的COSY和HMBC信號。

具體實施方式

在如下的實施例中所指的化合物的化學結(jié)構(gòu)式為：

。

實施例1 化合物的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制

1. 發(fā)酵生產(chǎn)

生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)：按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取桔綠木霉（Trichoderma citrinoviride.）IBPT-4（已于2013年1月25日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：武漢 武漢大學，保藏編號是：CCTCC NO：M 2013055）適量，接種到PDA固體斜面培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。

取斜面培養(yǎng)4天的桔綠木霉（Trichoderma citrinoviride.）IBPT-4適量，接種到裝有400mL培養(yǎng)液[培養(yǎng)液組成(克/升)：甘露醇20.0，酵母膏3.0，麥芽糖20.0，味精10.0，葡萄糖10.0，KH₂PO₄ 0.5，MgSO₄ 0.3，NaCl 6.0 定容]的1000mL錐形瓶中，28℃靜止培養(yǎng)30天后，獲得菌絲體和發(fā)酵液。

2. 浸膏的獲得

用紗布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將發(fā)酵液與乙酸乙酯1:2（v/v）萃取兩次，萃取液減壓蒸餾至干，得到發(fā)酵液的乙酸乙酯浸膏。菌絲體則以含70%-80%丙酮的水溶液超聲破碎3次，除去殘渣，將清液合并后減壓濃縮去除丙酮，按體積比為1:2加入乙酸乙酯萃取兩次，減壓濃縮至干，得菌絲體的乙酸乙酯浸膏。將菌絲體和發(fā)酵液的乙酸乙酯浸膏合并后得到提取物總浸膏。

3. 化合物的分離精制

將提取物總浸膏用100-200目硅膠拌樣后，以石油醚:二氯甲烷:甲醇為洗脫液，用減壓硅膠色譜柱梯度洗脫。洗脫液經(jīng)過活性跟蹤，得到活性組分B（二氯甲烷-甲醇50:1 v/v洗脫物），然后以石油醚:二氯甲烷:甲醇為洗脫劑，進一步通過加壓硅膠柱層析梯度洗脫，得到的活性亞組分B1（二氯甲烷-甲醇20:1 v/v洗脫物），再以氯仿-甲醇（1:2 v/v）為溶劑進行Sephadex LH-20凝膠柱層析，最后通過半制備液相色譜(1010型ODS-A，10×250 mm，5μm)：分離流速為5 mL/min，流動相為85%乙腈含0.1% TFA，得到所示化合物（32.1 mg，t_R20.7min）。

化合物：淡黃色油狀物，高分辨質(zhì)譜HRESI-MS在m/z 324.2161處給出分子離子峰[M–H]^–，(Calcd for C₁₈H₃₀NO₄, 324.2175)，提示分子量為325，結(jié)合波譜信息推測分子式為C₁₈H₃₁NO₄。¹H和¹³C-NMR等NMR數(shù)據(jù)見表1。

表1 化合物的¹H和¹³C-NMR數(shù)據(jù)(500 MHz，CDCl₃)^a)

實施例2 體外抗腫瘤活性的測試

1. 實驗樣品及實驗方法

被測樣品溶液的配制：測試樣品為實施例1中分離精制的化合物純品。精密稱取適量樣品，用甲醇配制成所需濃度的溶液，供測活性。

細胞系及細胞的繼代培養(yǎng)采用人黑色素瘤A375細胞系，A375細胞用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、通入5% CO₂的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。

細胞增殖抑制活性測試方法

四氮唑鹽（MTT）法：取對數(shù)生長期的細胞，將細胞密度調(diào)至每毫升2×10⁵個細胞，按每孔200微升接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，于37℃、通入5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。每孔加入2微升樣品液或空白溶液，培養(yǎng)24小時后，每孔加MTT液（每毫升生理鹽水中含5毫克MTT）10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，37℃、2000轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘，吸去上清。每孔加入DMSO各100微升，在微量振蕩器上振蕩15分鐘，至結(jié)晶完全溶解后，利用MD公司產(chǎn)SPECTRAMAX Plus型酶標儀測定每孔在570nm處的吸光值（OD值）。在同一塊96孔板中，每個濃度樣品均設(shè)置三孔，另設(shè)三孔空白對照和無細胞調(diào)零孔（如果藥物有顏色要做相應(yīng)藥物濃度無細胞調(diào)零）。各孔OD值先做相應(yīng)無細胞調(diào)零，再取三孔平均OD值，按IR（%）=（OD_空白對照-OD_樣品）/OD_空白對照×100%計算每個濃度下細胞增殖抑制率（IR%）。

2. 實驗結(jié)果

細胞增殖抑制活性測試結(jié)果

在MTT法測試中，根據(jù)不同濃度的該化合物的A375細胞增殖抑制率，應(yīng)用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理并計算半數(shù)抑制濃度IC₅₀值。結(jié)果見表2。

表2 化合物對人黑色素瘤A375細胞增殖的抑制活性

3. 結(jié)論

該化合物具有明顯的黑色素瘤細胞增殖抑制作用，可用于制備黑色素瘤細胞增殖抑制劑或抗黑色素瘤藥物，用于抗腫瘤的研究。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。