本發(fā)明屬于微生物肥料領(lǐng)域，具體涉及一株哥斯達黎加鏈霉菌屬放線菌及其用途。

背景技術(shù)：

植物內(nèi)生放線菌(Endophytic actinobacteria)是指以共生或寄生方式存在于植物組織內(nèi)部，不引發(fā)植物明顯病癥的微生物，在長期協(xié)同進化的過程中，植物內(nèi)生放線菌與宿主間不斷進行物質(zhì)、能量以及遺傳信息的交換，許多功能特異的放線菌與植物間形成了復(fù)雜的共生關(guān)系，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。定殖于植物體內(nèi)的放線菌，不易受外界環(huán)境影響，以溶磷固氮作用、分泌植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、合成鐵載體、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性以及產(chǎn)生抗真菌代謝產(chǎn)物等方式促進植物生長，并長期持續(xù)作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有很大的應(yīng)用潛力。國內(nèi)外已報道的具有抗病促生內(nèi)生放線菌主要有：從蕨類植物Pteridium aquilinum中分離得到的Streptomyces hygroscopicus TP-A0451產(chǎn)生的pteridic acids A和B，能夠促進菜豆胚軸形成不定根；Qin等從麻風(fēng)樹Jatropha curcas L.中分離得到19株具有產(chǎn)生ACC、吲哚乙酸、鐵載體、溶磷和固氮能力的內(nèi)生放線菌，其中7株能夠顯著性的提高Jatropha curcas L.幼苗的株高、根長和鮮重；Li從澤瀉Alisma orientale中分得一株Streptomyces CNS-42能產(chǎn)生星孢霉素(staurosporine)具有促生抗病雙重功能。Passari等從藥用植物中分得42株內(nèi)生放線菌，其中22株具有產(chǎn)吲哚乙酸的能力，20株的吲哚乙酸濃度在10-32 μg/mL；所有分離菌株具有產(chǎn)氨能力，產(chǎn)氨濃度在5.2-54mg/mL，21株菌具有產(chǎn)鐵載體能力；14株菌具有溶磷能力，19株菌具有產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性，15株菌具有產(chǎn)HCN的能力，從20和19株菌中擴增到吲哚乙酸(iaaM)和幾丁質(zhì)酶(chic)基因，進一步研究發(fā)現(xiàn)2株潛力菌株Streptomyces sp.(BPSAC34)和Leifsonia xyli(BPSAC24)對辣椒有促進生長的作用。

川楝(Melia Toosendan Sieb.et Zucc)為楝科楝屬落葉喬木，主要分布于我國西南地區(qū)，是重要的工業(yè)用材樹木，也是水土保持的重要植物。作為傳統(tǒng)中藥，川楝在我國的藥用歷史悠久，樹皮、根皮、樹干、樹葉和果實均可入藥，以產(chǎn)自四川的川楝果實為上乘，故名川楝子，是重要的川產(chǎn)地道中藥材。從川楝中提取的川楝素(Toosendanin)對昆蟲、線蟲和螨蟲以及微生物都有抑制作用，且尚未發(fā)現(xiàn)昆蟲產(chǎn)生抗藥性的情況，是制作高效無殘毒無污染新型植物類農(nóng)藥的重要原料。在與宿主植物長期協(xié)同進化過程中，棲于川楝內(nèi)部的放線菌，在宿主植物及外部環(huán)境長期影響作用下，可能具備產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特的生物活性物質(zhì)的潛力，并通過自身代謝產(chǎn)物供給宿主植物生長，提高寄主植物對環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，以及通過不同機制抑制植物病原菌和降解某些有毒物質(zhì)等方式來促進植物生長。因此，從川楝中分離獲得具有促生抗菌作用的內(nèi)生放線菌，并探究其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力，符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)的需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明從野生川楝皮中分離篩選出一株內(nèi)生放線菌菌株哥斯達黎加鏈霉菌(Streptomyces costaricanus)，簡稱LP69。該菌株已于2016年08月29日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為GDMCC No：60071，保藏地址為廣東 省廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，廣東省微生物研究所。

同時，本發(fā)明還提供了該放線菌的16s rDNA的核苷酸序列，為序列表SEQ ID NO.1所述。

此外，本發(fā)明提供了一種放線菌的孢子菌懸液，由以下步驟制備得到：

取放線菌菌株GDMCC 60071，接種于基平板上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，待整個平板長滿菌絲后，用無菌解剖刀將培養(yǎng)基切碎，接入裝有無菌麥粒種的菌種瓶中，28℃培養(yǎng)1周以上，待所有麥粒長滿鏈霉菌LP69的孢子后，取出麥粒用無菌水洗下孢子，然后將孢子懸液以10000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5min，再用無菌水將LP69的孢子濃度調(diào)節(jié)為10⁸cfu/mL，得孢子菌懸液。cfu為本領(lǐng)域常用術(shù)語，即指菌落形成單位。

本發(fā)明還提供了上述孢子菌懸液的施肥方法，包括以下步驟：

在植物幼苗移栽時，隨定根水使用孢子菌懸液，并在植株幼苗移栽培養(yǎng)10天后進行灌根，在根附近灌入孢子懸液10-50mL，如20mL。

同時，本發(fā)明還提供了放線菌GDMCC 60071和/或放線菌GDMCC 60071的孢子均懸液制備生物肥料的用途；所述生物肥料具有產(chǎn)吲哚乙酸、產(chǎn)鐵載體、溶解磷、提高土壤氮元素含量、提高土壤鉀元素含量、提高土壤鐵元素含量和/或提高土壤磷元素含量的用途。

此外，本發(fā)明還提供了一種用于煙草的生物肥料，該生物肥料含有放線菌GDMCC 60071；

以及，提供了一種菌制劑，含有GDMCC 60071和可接受的輔料；

所述菌制劑優(yōu)選為為固態(tài)菌劑，菌劑的活菌數(shù)為(1～5)×10⁹cfu/g，優(yōu)選為2×10⁹cfu/g。

此外，本發(fā)明還提供了上述生物肥料、菌制劑產(chǎn)吲哚乙酸、產(chǎn)鐵載體、溶解磷、提高土壤氮元素含量、提高土壤鉀元素含量和/或提高土壤磷元素含量的用途。

本發(fā)明的LP69菌株的生物學(xué)特征如下：

菌株形態(tài)特征：在ISP₄培養(yǎng)基上生長，菌落緊密較小、邊緣不整齊，表面粗糙，菌落顏色呈灰褐色，氣生菌絲與基內(nèi)菌絲均發(fā)育良好，不產(chǎn)色素，氣生菌絲形成緊密的螺旋孢子鏈。

生理生化特征：菌株LP69在15℃-50℃溫度范圍都能生長，在pH<4.0時不能生長，在0％-5％NaCl溶液中能夠生長，可以利用D-果糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、半乳糖為唯一碳源，不能利用L-阿拉伯糖、蔗糖、棉子糖、鼠李糖；能利用L-半胱氨酸、L-絲氨酸、L-纈氨酸，不能利用L-組氨酸和L-蛋氨酸為唯一氮源；不能使明膠液化，能水解淀粉，分解纖維素。

菌株LP69進行16S rDNA序列測定，所測序列提交EzBioCloud網(wǎng)站(www.ezbiocloud.net)進行同源性比對,并利用MEGA 5.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，菌株LP69與哥斯達黎加鏈霉菌(Streptomyces costaricanus)的16S rDNA核苷酸序列的同源性在99％以上。綜合形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rDNA序列同源性分析等實驗結(jié)果，鑒定LP69為哥斯達黎加鏈霉菌(Streptomyces costaricanus)。

菌株LP69能產(chǎn)生吲哚乙酸，鐵載體，可將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可被植物利用的可溶性磷酸鹽。

制備麥粒種，接種菌株LP69，待麥粒長滿孢子后，用無菌水洗下制成濃度為1×10⁸cfu/mL的孢子液作為菌劑，在煙苗移栽時隨定根水使用，并在煙苗移 栽培10天后進行灌根，每株20mL。

通過盆栽實驗，驗證了菌株LP69對煙草的生長具有明顯的促進作用，煙草株高、最大莖圍、最大葉長、最大葉寬和鮮重、干重分別增加了23.3％、18.7％、17.6％、11.7％、28.6％、28.1％。

有益效果

本發(fā)明分離篩選提供的川楝內(nèi)生放線菌LP69具有產(chǎn)生吲哚乙酸，鐵載體，溶磷等促生能力，通過在煙草栽培上的應(yīng)用，獲得能夠促進煙草的生長的效果，可減少種植過程中化學(xué)肥料的施入量，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有較好的應(yīng)用潛力。

附圖說明

圖1為哥斯達黎加鏈霉菌LP69的菌落形態(tài)圖。

圖2為哥斯達黎加鏈霉菌LP69的菌體形態(tài)圖。

圖3為基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的哥斯達黎加鏈霉菌LP69系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖4為哥斯達黎加鏈霉菌LP69通過灌根方式促進煙草生長的盆栽效果。其中左邊為LP69灌根處理，右邊為清水對照。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖和具體的實例來進一步描述本發(fā)明。本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料、試劑和儀器設(shè)備均為本領(lǐng)域所熟知。但本發(fā)明并不限于下述的實施例。

實施例一：川楝內(nèi)生放線菌LP69的分離、篩選和鑒定

1.川楝內(nèi)生放線菌的分離

采自四川雅安雨城區(qū)野生川楝的根、莖、葉、果、皮等組織帶回實驗室，先用自來水將植物樣品沖洗干凈，再用超聲(15千赫)清洗10min，去除植物組織表面雜質(zhì)，作適當(dāng)?shù)男藜艉?，先?.1％Tween 20清洗30s，無菌水沖洗三次；75％乙醇浸泡5min，無菌水沖洗三次；2％次氯酸鈉浸泡5min，無菌水沖洗三次；10％碳酸氫鈉漂洗10min。將處理好的樣品置于鋪有無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，吸干植物組織表面的水分后，用無菌粉碎機粉碎樣品后，取適量預(yù)處理好的樣品組織均勻撒布于高氏一號培養(yǎng)基上，正置平板，28℃培養(yǎng)7周以上。待放線菌長出后，用無菌竹簽挑取在ISP₄培養(yǎng)基上純化，純化后的菌株LP69保種于ISP₄試管斜面，4℃保存。最后一遍清洗樣品的無菌水200μL，涂布于LB固體培養(yǎng)基后，置于28℃培養(yǎng)，7天后平板上如有菌落生成，證明表面消毒不徹底；若無菌落長出，則可以視分離出來的菌株為內(nèi)生菌。

2.川楝內(nèi)生放線菌LP69的促生功能篩選

2.1產(chǎn)吲哚乙酸能力測定

菌株產(chǎn)吲哚乙酸能力測定，方法如下：

a)含氮培養(yǎng)液分裝于試管中，每管4mL，121℃，20min滅菌；

b)加入過濾除菌的2.5mg/mL的L-色氨酸溶液1mL；

c)將供試菌株接入上述培養(yǎng)基，140rmp/min，28℃，培養(yǎng)7天；

d)發(fā)酵液8000rmp/min，離心5min；

e)取上清液2mL，加入4mL的顯色液，充分混勻，25℃暗處理，顯色30min，在530nm波長下測定吸光度值A(chǔ)；

f)以未接菌的液體培養(yǎng)基為對照調(diào)零，以濃度0、5、20、40、60mg/L 的吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)液同上做標(biāo)曲，計算出發(fā)酵液中吲哚乙酸的濃度；

2.2產(chǎn)鐵載體能力測定

a)取0.012g鉻天青溶于10mL雙蒸水中，并與2mL 1mmoL/L的FeCl₃·6H₂O溶液混勻，得到溶液a；

b)取0.015g十六烷基三甲基溴化銨溶于8mL雙蒸水中，得到溶液b；

c)將a液緩慢加到b液中，混合均勻，得到染液c；

d)將10×MM9鹽溶液20mL和6.04g哌嗪二乙磺酸加入盛有150mL雙蒸水的三角瓶中混合均勻后用50％NaOH調(diào)節(jié)pH到6.8，再加入3.2g瓊脂粉，得到培養(yǎng)基d；

e)將染液c，培養(yǎng)基d及1mmoL/L的CaCl₂，1mmoL/L的MgSO₄，20％的葡萄糖，10％的酪蛋白氨基酸分別在115℃滅菌20min，待各溶液溫度降至50-60℃時，取200μL CaCl₂，4mL MgSO₄，6mL酪蛋白氨基酸，2mL葡萄糖加入培養(yǎng)基d，再沿著瓶壁加入染液c，充分混勻切勿產(chǎn)生氣泡即得藍色檢測培養(yǎng)基，倒板。

f)用無菌竹簽接種供試菌株，每板等距接種5個菌餅，每株菌重復(fù)3次，28℃，培養(yǎng)3天，觀察記錄橘黃色透明圈大小。

2.3溶磷能力測定

將供試菌株接種蒙金娜培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)10天，觀察有無溶磷圈及溶磷圈的大小。以溶磷圈的大小來確定其對無機磷的溶解能力，值越大，溶磷能力強，反之，溶磷能力弱，不產(chǎn)生溶磷圈的菌株無溶磷能力；

4菌株鑒定

4.1菌株形態(tài)

(1)菌落形態(tài)特征：將菌株接種在ISP₄培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)5天，觀察菌株的菌落形態(tài)。

(2)菌體形態(tài)特征：將菌株接種在ISP₄培養(yǎng)基上，然后在接有菌種的位置斜插入無菌的蓋玻片(插片法)，置于28℃培養(yǎng)5天，取出覆蓋有菌絲的蓋玻片并用復(fù)紅進行簡單染色鏡檢，將所觀察到的形態(tài)結(jié)果顯微照相，如圖2所示。4.2菌株LP69生理生化特征

(1)碳源利用試驗：將菌株接種于含有不同碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，連續(xù)傳代3次，能長出菌落的為陽性。

(2)氮源利用試驗：將菌株接種于含有不同氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，連續(xù)傳代3次，能長出菌落的為陽性。

(3)生長溫度：將菌株接種于ISP₄培養(yǎng)基上，分別置于5℃、15℃、25℃、35℃、45℃、55℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，觀察是否有菌落形成。

(4)耐鹽試驗：將菌株接種于含0％、3％、5％、7％、10％、15％、20％的ISP₄培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，觀察是否有菌落形成。

(5)耐酸堿試驗：將菌株接種于pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的ISP₄培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，觀察是否有菌落形成。

(6)淀粉水解反應(yīng)：將菌株點種于含有可溶性淀粉的培養(yǎng)基上，重復(fù)3次，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，形成菌落后，在平板上滴加盧哥爾氏碘液，將整個平皿覆蓋，平板呈藍色，如菌落周圍有無透明圈出現(xiàn)，說明淀粉被水解，透明圈大小表明其水解淀粉能力的大小。如無透明圈出現(xiàn)，則說該菌無水解淀粉的能力。

(7)纖維素分解：將菌株接種到纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)5天，若菌株周圍產(chǎn)生清晰透明圈，則證明是具有降解纖維素能力的陽性菌株，反之亦然。

(8)明膠液化：將菌株穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，再置于4℃冰箱內(nèi)30min后觀察結(jié)果，若培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為明膠液化陽性，若培養(yǎng)基仍為固體狀態(tài)則為明膠液化陰性。

4.3菌株的分子鑒定

4.3.1試劑：溶菌酶，蛋白酶K，10×TAE，1×TE，3mol/L乙酸鈉(pH4.8-5.2)，70％乙醇，(飽和酚：氯仿：異戊醇＝25:24:1)，Mix。

4.3.2引物

Primer A：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(與16S rRNA 5′端8-27位點堿基相同)；Primer B：5′-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3′(與16S rRNA 3′端1523-1504位點堿基相同)；

4.3.3內(nèi)生放線菌DNA提取

取少許菌體于無菌的1.5mL Eppendorf管中，加入20μl(50mg/mL)終濃度達到2mg/mL的溶菌酶，放入37℃搖床，200rmp/min，1-2h；加入20％SDS 50μL及蛋白酶K 5μL(20mg/mL)，混勻放入55℃搖床，200rmp/min處理1-2h；加入550μL(苯酚：氯仿：異戊醇＝25:24:1)抽提，12000rmp/min離心10min，吸取上清(重復(fù)三次)；加入800μL無水乙醇，80μL 3mol/L乙酸鈉(pH4.8-5.2)，混勻，于4℃沉淀DNA，1h，12000rmp/min，10min，棄上清；加入200μL 70％乙醇，清洗管壁1-2次，12000rmp/min，離心5min，棄上清；待乙醇揮發(fā)干后，加入50μL 1×TE溶解DNA，并于-20℃保存；1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

4.3.4內(nèi)生放線16S rRNA基因擴增

16S rRNA基因擴增條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性1min，56℃退火1min，72℃延2min，30個循環(huán)，72℃總延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)上海生工EZ Spin Column PCR Product Purification Kit UNlQ-1柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(SK1142-N)純化，按操作指南進行，純化產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

4.3.5 16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測序后所得序列提交EzBioCloud網(wǎng)站(www.ezbiocloud.net)進行同源性比對，選取相似性最高已發(fā)表菌株的16S rRNA基因序列作為參比序列，采用Clustal X軟件進行多序列比對分析，并通過MEGA5.0軟件以鄰近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定該內(nèi)生放線菌的分類地位。

5.實驗結(jié)果

通過檢測，篩選到一株產(chǎn)吲哚乙酸能力、產(chǎn)鐵載體、溶磷能力均較好的內(nèi)生放線菌菌株，命名為LP69。該菌株在ISP₄培養(yǎng)基上生長，菌落緊密較小、邊緣不整齊，表面粗糙，菌落顏色呈灰褐色，氣生菌絲與基內(nèi)菌絲均發(fā)育良好，不產(chǎn)色素，氣生菌絲形成柔曲、螺旋、頂端卷曲的孢子鏈，呈現(xiàn)典型的鏈霉菌特征(圖1，圖2)。菌株LP69在15℃-50℃溫度范圍都能生長，在pH<4.0時不能生長，在0％-5％NaCl溶液中能夠生長，可以利用D-果糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、半乳糖為唯一碳源，不能利用L-阿拉伯糖、蔗糖、棉子糖、鼠李糖；能利用L-半胱氨酸、L-絲氨酸、L-纈氨酸，不能利用L-組氨酸和L-蛋氨酸為唯一氮源；不能使明膠液化，能水解淀粉，分解纖維素。

菌株LP69進行16S rDNA序列測定，所測序列提交EzBioCloud網(wǎng)站 (www.ezbiocloud.net)進行同源性比對，比較結(jié)果顯示菌株LP69與哥斯達黎加鏈霉菌(Streptomyces costaricanus)的16S rDNA核苷酸序列的同源性在99％以上，并通過MEGA5.0軟件以鄰近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。綜合形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rDNA序列同源性分析等實驗結(jié)果，鑒定LP69為哥斯達黎加鏈霉菌(Streptomyces costaricanus)。

菌株LP69具有較強的溶磷以及產(chǎn)生吲哚乙酸、鐵載體的能力(表1)。

表1內(nèi)生放線菌LP69促生能力結(jié)果

實例2哥斯達黎加鏈霉菌LP69促進煙草生長效果實驗

1.接種菌株孢子菌懸液制備

將菌株LP69接種于高氏一號培養(yǎng)基平板上，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，待整個平板長滿菌絲后，用無菌解剖刀將培養(yǎng)基切碎，接入裝有無菌麥粒種的菌種瓶中，28℃培養(yǎng)1周以上，待所有麥粒長滿哥斯達黎加鏈霉菌LP69的孢子后，取出麥粒用無菌水洗下孢子，然后將孢子懸液10000rmp/min離心5min，再用無菌水將LP69的孢子濃度調(diào)節(jié)為10⁸cfu/mL。高氏一號培養(yǎng)基由可溶性淀粉20g；KNO₃ 1g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01g，自來水1000mL制備得到。

2.取煙草云煙87種子播種于育苗盤中，自然條件下培養(yǎng)，每天澆水一次，當(dāng)煙草幼苗的植株高度為10cm時，選取健康長勢良好且一致的煙草幼苗，進行移載。孢子懸液在煙苗移栽時隨定根水使用，并在煙苗移栽培10天后進行灌根， 在根附近灌入孢子懸液20mL，作為空白對照的煙草中則加入等量的無菌水。

3.灌根90天后，測定煙草的株高、根系形態(tài)、鮮重、干重、葉片數(shù)及土壤中主要營養(yǎng)元素含量。

4.煙草外部特征是煙草生長情況最直觀的體現(xiàn)。煙草盆栽試驗結(jié)果表明，菌株LP69灌根處理的煙草生長狀況明顯優(yōu)于對照組，菌株LP69灌根處理煙草的株高、最大莖圍、最大葉長和最大葉寬分別比CK增加了23.3％、18.7％、17.6％和11.7％；煙草鮮重和干重也分別比CK增加了28.6％、28.1％(表2，圖4)。

表2接種菌株LP69對煙草生長的影響

5.根系的發(fā)達程度與植株吸收營養(yǎng)的能力關(guān)系密切。由表3可見，經(jīng)菌株LP69灌根處理后，煙草根系的總根長、根總表面積、根平均直徑、總根體積、總根毛數(shù)與CK結(jié)果，存在顯著性差異(P<0.05)。

表3接種菌株LP69對煙草根系的影響

注：^＊表示有顯著性差異(LSD,P<0.05)，下同。

表4接種菌株LP69對土壤主要營養(yǎng)元素的影響

菌株LP69灌根處理后，顯著提高了土壤中堿解N、速效K以及速效P的含 量，分別比CK提高了17.1％、7.1％、28.2％(表4)。

綜上所述，本發(fā)明分離自川楝內(nèi)生放線菌哥斯達黎加鏈霉菌(Streptomyces costaricanus)LP69可有效促進煙草生長。

實施例3生物肥料的制備

1、菌劑制作

①平板菌種(一級種)：高氏一號培養(yǎng)基(由可溶性淀粉20g；KNO₃ 1g，K₂HPO₄·3H₂O 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01g，自來水1000mL)，接種哥斯達黎加鏈霉菌(Streptomyces costaricanus)P69后在28℃下培養(yǎng)7天制成一級種子。

②麥粒菌種(二級種)：用無菌解剖刀將長滿菌絲的培養(yǎng)基切碎，接入裝有無菌麥粒種的菌種瓶中，28℃培養(yǎng)1周以上，待所有麥粒長滿哥斯達黎加鏈霉菌LP69的孢子后，取出麥粒用無菌水洗下孢子，然后將孢子懸液10000rmp/min離心5min，再用無菌水將LP69的孢子濃度調(diào)節(jié)為10⁸cfu/mL。

③固態(tài)發(fā)酵：以麥麩為基質(zhì)(載體)，按重量體積比加入，玉米粉1％，豆餅粉1％，KH₂PO₄ 0.1％，CaCO₃ 0.1％，pH 7.0，加水調(diào)節(jié)麥麩含水量至60％，121℃，0.1Mpa蒸氣滅菌30min；將P69孢子懸液按20％(體積比)的接種量接種于固態(tài)培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)9天后，取出自然風(fēng)干，粉碎后為哥斯達黎加鏈霉菌(Streptomyces costaricanus)P69固態(tài)發(fā)酵菌劑，菌劑活菌數(shù)為2×10⁹cfu/g。

④制劑保存：菌劑無菌條件下常溫干燥保存半年不影響其促生活性。

2、菌劑P69田間應(yīng)用

供試植物：烤煙云87。

烤煙苗移栽時，按以下4個處理對烤煙苗進行處理：CK對照常規(guī)移栽；處理1營養(yǎng)土蘸根；處理2菌劑P69用營養(yǎng)土稀釋10倍；處理3菌劑P69用營養(yǎng)土稀釋50倍蘸根；處理4菌劑P69用營養(yǎng)土稀釋100倍蘸根，于烤煙生長的團棵期和打頂期進行烤煙農(nóng)藝性狀的測定(表5和表6)。

表5菌劑LP69對烤煙團棵期農(nóng)藝性狀的影響

在云煙87的團棵期，菌劑LP69在100倍以內(nèi)的各稀釋液均可以有效提高烤煙的株高和葉片數(shù)等農(nóng)藝性狀指標(biāo)。

表6菌劑LP69對烤煙打頂期農(nóng)藝性狀的影響

在云煙87的打頂期，菌劑LP69在100倍以內(nèi)的各稀釋液同樣可以有效提高烤煙的株高、葉片數(shù)、節(jié)距和莖圍等農(nóng)藝性狀指標(biāo)。