發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及包含已知改善施用對(duì)象的代謝譜的成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)和其他代謝調(diào)節(jié)物的新型蛋白質(zhì)。

發(fā)明背景

成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)家族的特征是22種遺傳上有區(qū)別的同源配體，被分為7個(gè)亞家族。FGF-21與FGF-19和FGF-23最密切相關(guān)，并形成亞家族。該FGF亞家族調(diào)控多種對(duì)經(jīng)典FGF而言不常見的生理學(xué)過程，即，能量和膽酸的內(nèi)穩(wěn)態(tài)、葡萄糖和脂類代謝，以及磷酸鹽和維生素D的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。此外，與其他FGF不同，該亞家族以內(nèi)分泌的方式發(fā)揮作用(Moore,D.D.(2007)Science 316,1436-8)(Beenken等人(2009)Nature Reviews Drug Discovery 8,235)。

FGF21是209個(gè)氨基酸的多肽，含有28個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序列(SEQ ID NO:132)。人FGF21與小鼠FGF21具有約79％氨基酸同一性，與大鼠FGF21具有約80％氨基酸同一性。成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)被描述為用于治療缺血性血管病、創(chuàng)傷愈合、和與肺、支氣管或肺泡細(xì)胞功能喪失相關(guān)的疾病(Nishimura等人(2000)Biochimica et Biophysica Acta,1492:203-206；專利公開WO01/36640；和專利公開WO01/18172)。雖然FGF-21激活FGF受體和下游信號(hào)傳遞分子，包括FRS2a和ERK，但尚未檢測到FGFR與FGF-21的直接相互作用。研究已鑒別了在肝臟、脂肪細(xì)胞和胰腺中高表達(dá)的β-klotho是FGF-21細(xì)胞應(yīng)答的決定子，也是通過FGFR介導(dǎo)FGF-21信號(hào)傳遞的輔助因子(Kurosu,H.等人(2007)J Biol Chem 282,26687-95)。FGF21是FGFR1(IIIc)、FGFR2(IIIc)和FGFR3(IIIc)β-klotho信號(hào)傳遞復(fù)合物的強(qiáng)力激動(dòng)劑。

FGF-21已表現(xiàn)出誘導(dǎo)不依賴胰島素的葡萄糖攝入。FGF-21還表現(xiàn)出減輕多種糖尿病嚙齒類模型中的高血糖。此外，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FGF-21的轉(zhuǎn)基因小鼠耐受膳食誘導(dǎo)的代謝異常，并且表現(xiàn)出減少的體重和脂肪質(zhì)量，和胰島素敏感性的增強(qiáng)(Badman,M.K.等人(2007)Cell Metab 5,426-37)。向糖尿病的非人靈長類施用FGF-21導(dǎo)致空腹血漿葡萄糖、甘油三酯、胰島素和胰高血糖素水平減少，并導(dǎo)致脂蛋白譜的顯著改善，包括HDL膽固醇增加幾乎80％(Kharitonenkov,A.等人(2007)Endocrinology 148,774-81)。目前的研究探討了FGF21作用的分子機(jī)制，已經(jīng)鑒別FGF21是幫助控制適應(yīng)空腹?fàn)顟B(tài)的重要內(nèi)分泌激素(Badman等人(2009)Endocrinology 150,4931)(Inagaki等人(2007)Cell Metabolism 5,415)。這提供了之前缺乏的PPARα下游的關(guān)聯(lián)，肝臟藉此與身體的其余部分在調(diào)控能量內(nèi)穩(wěn)態(tài)生物學(xué)中溝通(Galman等人(2008)Cell Metabolism 8,169)(Lundasen等人(2007)Biochemical and Biophysical Research Communications 360,437)。

FGF21通過激活A(yù)MPK/SIRT1/PGC1α通路抑制PPARγ表達(dá)和增加線粒體功能，來調(diào)控脂肪細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。(Chau等人(2010)PNAS 107,12553)如培養(yǎng)的人肌管和分離的小鼠組織中測量的，F(xiàn)GF21還增加骨骼肌的葡萄糖攝入(Mashili等人(2011)Diabetes Metab Res Rev 27,286-97)。嚙齒類胰島細(xì)胞的FGF21治療導(dǎo)致通過激活ERK1/2和Akt通路的改善的功能和存活(Wente等人(2006)Diabetes 55,2470)。FGF21治療還導(dǎo)致嚙齒類肝臟中關(guān)于脂肪發(fā)生和脂肪酸氧化酶的基因表達(dá)改變，可能是通過HNF4α和Foxa2信號(hào)傳遞。然而，目前的研究(Wei等人(2012)PNAS 109,3143-48)提示，由于消退的PPARγ激活(通過降低的SUMO化作用)，用FGF21治療膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠誘導(dǎo)骨丟失；在FGF21治療后，骨中存在增加的PPARγ活性的條件下，可觀察到充質(zhì)干細(xì)胞從向成骨細(xì)胞分化轉(zhuǎn)變?yōu)橄蛑炯?xì)胞分化。

與使用FGF-21直接作為生物治療劑相關(guān)的困難是其半壽期非常短(Kharitonenkov,A.等人(2005)Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635)。在小鼠中，人FGF21的半壽期是0.5至1小時(shí)，而在食蟹猴中，半壽期是2至3小時(shí)。FGF21可以作為多用途的、無菌藥物制劑使用。然而，已確定防腐劑，即，間甲酚，在上述條件下對(duì)其穩(wěn)定性具有不利作用。

另一種已處于臨床的強(qiáng)力代謝調(diào)節(jié)物是胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)(Knudsen等人(2004)Journal of Medicinal Chemistry 47,4128)。GLP-1是由哺乳動(dòng)物腸道的L細(xì)胞分泌的36個(gè)氨基酸的腸降血糖素，作用于α和β細(xì)胞，以依賴于葡萄糖的方式刺激胰島素分泌和抑制胰高血糖素釋放(Hare等人(2010)Diabetes 59,1765；Meier等人(2005)Diabetes-Metabolism Research and Reviews 21,91)。GLP-1結(jié)合和激活GLP-1受體(GLP-1R)，后者是II類G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族的7次跨膜的螺旋蛋白質(zhì)(Mayo等人(2003)Pharmacological Reviews 55:167)。作為GLP-1受體激動(dòng)劑，GLP-1通過刺激胰腺分泌胰島素，從而增加外周組織吸收葡萄糖和抑制胰高血糖素分泌，導(dǎo)致降低的肝葡萄糖釋放，在減少餐后血糖水平中扮演了重要的角色。

第二個(gè)臨床上重要的GLP-1受體激動(dòng)劑是毒蜥外泌肽(Exendin)-4.毒蜥外泌肽-4是由毒蜥蜥蜴(Gila Monster)唾液腺生產(chǎn)的39個(gè)殘基的多肽(Goke等人(1993)Diabetes 46:433-439；Fehmann等人(1995)Endocrine Rev.16:390-410)。雖然它是獨(dú)特的非哺乳動(dòng)物基因的產(chǎn)物，并且似乎僅由唾液腺表達(dá)，但是毒蜥外泌肽-4與GLP-1享有52％氨基酸序列同源性，且在哺乳動(dòng)物中與GLP-1受體相互作用(Goke等人；Thorens等人(1993)Diabetes 42:1678-1682)。在體外，毒蜥外泌肽-4已表現(xiàn)出促進(jìn)胰島素生產(chǎn)細(xì)胞分泌胰島素，在給予等摩爾量時(shí)，比GLP-1更強(qiáng)力地導(dǎo)致胰島素生產(chǎn)細(xì)胞釋放胰島素。此外，毒蜥外泌肽-4在嚙齒類和人類中都強(qiáng)力刺激胰島素釋放以降低血漿葡萄糖水平，且比GLP-1作用時(shí)間更長；然而，由于它不是哺乳動(dòng)物中天然存在的，毒蜥外泌肽-4在哺乳動(dòng)物中具有GLP-1所缺少的某些潛在抗原特性。

臨床上已經(jīng)建立了GLP-1和毒蜥外泌肽-4類似物(例如，利拉魯肽(Liraglutide)和艾塞那肽(Byetta))改善人體內(nèi)的葡萄糖控制的能力(Idris(2010)Diabetes Obesity&Metabolism 12,89；Monami等人(2009)European Journal of Endocrinology 160,909)。還報(bào)道了GLP-1通過誘導(dǎo)增殖和抑制凋亡，來增加β細(xì)胞量(Egan,A等人(2003)Diabetes-Metabolism Research and Reviews 19,115；Farilla,L.等人(2003)Endocrinology 144,5149；Xu,G.等人(1999)Diabetes 48,2270)。它還作為腸道激素發(fā)揮作用，抑制胃內(nèi)的胃酸分泌和胃排空，同時(shí)提供減少胃口的飽食信號(hào)(Vilsboll等人(2009)Best Practice&Research Clinical Endocrinology&Metabolism 23,453)。這些效果可能解釋了向2型糖尿病患者施用GLP-1類似物時(shí)觀察到的有益的體重減輕。GLP-1還在缺血后的嚙齒類心臟中表現(xiàn)出護(hù)心作用(Ossum等人(2009)Pharmacological Research 60,411；Sonne,D.P.等人(2008)Regulatory Peptides 146,243；Nikolaidis,L.A.等人(2004)Circulation 109,962)。

此外，GLP-1可以通過降低PPARγ的表達(dá)，降低人充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)向脂肪細(xì)胞分化，并且GLP-1促進(jìn)細(xì)胞增殖和hMSC的細(xì)胞保護(hù)作用(Sanz等人(2010)Am J Physiol Endocrinol Metab 298,E634-E643)。

在研發(fā)用作治療1型和2型糖尿病和其他代謝病況的治療劑的FGF21蛋白(包括其變體或類似物)時(shí)，半壽期和穩(wěn)定性的增加是理想的。具有增強(qiáng)的半壽期和穩(wěn)定性的FGF21蛋白將允許對(duì)要施用所述蛋白質(zhì)的患者頻率較低的給藥。明顯的，需要研發(fā)用于治療性蛋白質(zhì)FGF21的穩(wěn)定的水性蛋白質(zhì)制劑。

此外，在研發(fā)蛋白質(zhì)藥劑(如代謝調(diào)節(jié)物FGF21、GLP-1和毒蜥外泌肽-4)中的重大挑戰(zhàn)是解決其物理和化學(xué)的不穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)的組成變化和特征定義了特殊的行為，如折疊、構(gòu)象穩(wěn)定性和解折疊/變性。當(dāng)目標(biāo)是利用水性的蛋白質(zhì)溶液使研發(fā)藥物制劑條件過程中的蛋白質(zhì)穩(wěn)定時(shí)，應(yīng)該解決這類特征(Wang,W.,Int.J.of Pharmaceutics,18,(1999))。穩(wěn)定目標(biāo)治療蛋白(例如本發(fā)明的蛋白質(zhì))的理想效果是增加對(duì)蛋白水解和酶促降解的耐受性，從而改善蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和降低蛋白質(zhì)聚集。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及鑒別新型蛋白質(zhì)，例如，融合蛋白，所述融合蛋白包含成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)和其他代謝調(diào)節(jié)物(例如GLP-1和毒蜥外泌肽-4)，并且在藥劑制劑條件下，具有相比構(gòu)件活性劑改良的藥劑特性，例如更穩(wěn)定、具有改善施用對(duì)象的代謝參數(shù)的能力、對(duì)蛋白水解和酶促降解更不易受、更不可能聚集和形成復(fù)合物，和更不可能是免疫原性的。本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有FGF21受體激動(dòng)劑和GLP-1受體激動(dòng)劑活性；其包含F(xiàn)GF21的截短形式和變體，并且還包含例如，胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、毒蜥外泌肽-4或其他代謝調(diào)節(jié)物或其變體中的一個(gè)或多個(gè)。

還公開了這樣的方法，所述方法用于治療FGF21相關(guān)疾病和GLP-1相關(guān)疾病，以及其他代謝的、內(nèi)分泌的和心血管的病癥，如肥胖、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非醇型脂肪肝病(NAFLD)、非醇型脂肪性肝炎(NASH)、胰島素耐受、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖、代謝綜合征、急性心肌梗塞、高血壓、心血管病、動(dòng)脈粥樣硬化、外周動(dòng)脈病、中風(fēng)、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病并發(fā)癥、神經(jīng)病、胃輕癱、與胰島素受體的嚴(yán)重失活突變相關(guān)的病癥、包括HIV相關(guān)性脂肪營養(yǎng)不良在內(nèi)的脂肪營養(yǎng)不良和其他的代謝病癥，和降低垂危患者的死亡率和發(fā)病率。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用作規(guī)律施用的(例如，每天、更優(yōu)選每周、每兩周或每月)可注射劑、單獨(dú)或與口服抗糖尿病劑組合，將改善1型和2型糖尿病患者的血糖控制、體重和脂類譜。蛋白質(zhì)還可用于治療肥胖或其他FGF21或GLP-1相關(guān)性病況。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)，例如，本發(fā)明的GLP-1-FGF21變體和毒蜥外泌肽-4-FGF21變體融合蛋白，克服了與蛋白質(zhì)治療劑相關(guān)的，包括例如與施用野生型FGF21相關(guān)的生理學(xué)不穩(wěn)定性的顯著障礙，因?yàn)槠湓谒幬镏苿l件下，比野生型FGF21更穩(wěn)定、對(duì)蛋白水解和酶促降解更不易受、更不可能聚集和形成復(fù)合物，和更不可能是免疫原性的。

在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了成纖維細(xì)胞生長因子21(FGF21)蛋白，例如包含表1列舉的和本文進(jìn)一步描述的一條或多條序列的融合蛋白。本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可包含GLP-1和/或毒蜥外泌肽-4蛋白，不論是野生型、截短的或突變的形式，或其變體。表1列舉的FGF21序列是野生型FGF21序列的變體，例如，具有NCBI參考號(hào)NP_061986.1的野生型FGF21序列，并可見于專利公開中，例如屬于Chiron Corporation的US 6,716,626B1。表1列舉的GLP-1和毒蜥外泌肽-4序列是野生型GLP-1和毒蜥外泌肽-4序列的變體，例如，分別具有NCBI參考號(hào)NP_002045和AAB22006.1的那些序列，并可見于專利公開中，例如分別屬于Eli Lilly and Co.和General Hospital Corp.的WO98/19698和WO87/06941A(GLP-1)和屬于Amylin的US 5,424,286(毒蜥外泌肽-4)。

其他實(shí)施方案涉及編碼本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)的多核苷酸，含有所述多核苷酸的載體和攜帶所述載體的宿主細(xì)胞。

本文提供了用于生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法，其中所述方法涉及通過例如在野生型FGF21蛋白的目標(biāo)位置上位點(diǎn)特異性地?fù)饺氚被醽硇揎椧吧虵GF21蛋白，以及在分子的FGF21部分與其他代謝調(diào)節(jié)物(如胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和毒蜥外泌肽-4)之間的融合，或者與用GLP-1和/或毒蜥外泌肽-4修飾的聚合物綴合。所述修飾和融合增強(qiáng)了本發(fā)明的蛋白質(zhì)相對(duì)于蛋白質(zhì)的野生型形態(tài)(例如，F(xiàn)GF21、GLP-1和毒蜥外泌肽-4)的生物學(xué)特性，以及在一些情況下，作為例如標(biāo)簽和蛋白質(zhì)半壽期延長活性劑的連接點(diǎn)，并用于將所述變體固定在固體支持物的表面的目的。本發(fā)明的相關(guān)實(shí)施方案是生產(chǎn)能夠生產(chǎn)本發(fā)明的所述蛋白質(zhì)的細(xì)胞的方法，和生產(chǎn)能夠生產(chǎn)含有編碼所述變體和融合物的DNA的載體的細(xì)胞的方法。

在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可包含F(xiàn)GF21、毒蜥外泌肽-4和/或GLP-1序列的一個(gè)或多個(gè)片段，包括長度小至8-12個(gè)氨基酸殘基的片段，其中多肽能夠降低哺乳動(dòng)物中的血糖。在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可包括FGF21、毒蜥外泌肽-4和/或GLP-1序列的一個(gè)或多個(gè)變體，例如，相對(duì)于其野生型序列具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、插入、添加或取代。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以與一種或多種聚合物共價(jià)連接，例如聚乙二醇(PEG)或多聚唾液酸，不論是在相對(duì)于野生型FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4進(jìn)行位點(diǎn)特異性氨基酸修飾的位置上，還是在與這些蛋白質(zhì)的野生型形態(tài)通常共享的氨基酸位置上。PEG基團(tuán)是以這樣的方式連接的，所述方式增強(qiáng)，和/或不干擾本發(fā)明的融合蛋白的構(gòu)件部分(例如，GLP-1蛋白變體或FGF21蛋白變體)的生物學(xué)功能。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽可以與異源氨基酸序列融合，任選通過接頭，如GS、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:8)或SGGGGSGGG(SEQ ID NO:128)。異源氨基酸序列可以是IgG恒定結(jié)構(gòu)域或其片段(例如Fc區(qū))、人血清白蛋白(HSA)或白蛋白結(jié)合多肽。本文公開的這類融合蛋白也可以形成多聚物。

在一些實(shí)施方案中，異源氨基酸序列(例如，HSA、Fc等)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)的氨基端融合。在其他實(shí)施方案中，融合異源氨基酸序列(例如，HSA、Fc等)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)的羧基端融合。在其他仍然更優(yōu)選的實(shí)施方案中，異源氨基酸序列(例如，HSA、Fc等)位于本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)的中間，即，在GLP-1或毒蜥外泌肽-4序列的C-末端殘基與FGF21序列的N-末端殘基之間。所述優(yōu)選的實(shí)施方案，例如，為了最大的GLP-1(毒蜥外泌肽-4)活性留下游離的N-末端，和為了最大的FGF21活性留下游離的完整C-末端。

在一些實(shí)施方案中，GLP-1受體激動(dòng)劑與抗體的重鏈和輕鏈的N-末端融合，同時(shí)FGF21與同一抗體的重鏈和輕鏈的C-末端融合(即，本文所述的fusobody)。所述優(yōu)選的實(shí)施方案為了最大的GLP-1(毒蜥外泌肽-4)活性留下游離的N-末端，和為了最大的FGF21活性留下游離的完整C-末端。優(yōu)選的實(shí)施方案使用PCT公開WO2011/076781中描述的抗體序列。

在一些實(shí)施方案中，GLP-1或毒蜥外泌肽-4肽與FGF21化學(xué)連接。在一些實(shí)施方案中，所述肽與FGF21的氨基酸殘基側(cè)鏈連接。在其他實(shí)施方案中，所述肽通過天然的化學(xué)鍵或本領(lǐng)域已知的其他方法，與FGF21的N-末端連接。優(yōu)選的實(shí)施方案為了最大的活性而留下GLP-1(毒蜥外泌肽-4)的游離的N-末端，和為了最大活性而留下FGF21的完整的C-末端。

在一些實(shí)施方案中，GLP-1或毒蜥外泌肽-4肽共價(jià)連接于聚合物分子，所述聚合物分子轉(zhuǎn)而與FGF21蛋白變體連接。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，GLP-1或毒蜥外泌肽-4肽連接于PEG聚合物，所述PEG聚合物同時(shí)連接于FGF21蛋白變體。所述優(yōu)選的實(shí)施方案為了最大的GLP-1(毒蜥外泌肽-4)活性而留下了游離的N-末端，和為了最大的FGF21活性而留下了游離的完整C-末端。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，GLP-1受體激動(dòng)劑肽通過PEG接頭或其他聚合物接頭與FGF21變體連接的，所述其他聚合物接頭同時(shí)提供了半壽期延長和兩種受體激動(dòng)劑的共價(jià)連接。

另一個(gè)實(shí)施方案涉及治療患者的方法，所述患者表現(xiàn)出一種或多種FGF21相關(guān)疾病或GLP-1-相關(guān)疾病，如肥胖、2型糖尿病、1型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非醇型脂肪肝病(NAFLD)、非醇型脂肪性肝炎(NASH)、胰島素耐受、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖、代謝綜合征、急性心肌梗塞、高血壓、心血管病、動(dòng)脈粥樣硬化、外周動(dòng)脈病、中風(fēng)、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病并發(fā)癥、神經(jīng)病、胃輕癱、與胰島素受體的嚴(yán)重失活突變相關(guān)的病癥、包括HIV相關(guān)性脂肪營養(yǎng)不良在內(nèi)的脂肪營養(yǎng)不良和其他的代謝病癥，所述方法包括向所述需要這類治療的患者施用治療有效量的一種或多種本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其藥物組合物。

本發(fā)明還提供了包含本文公開的本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)和可藥用的配制劑的藥物組合物。這類藥物組合物可用于治療代謝病癥的方法中，并且方法包括向所述有需要的人類患者施用本發(fā)明的藥物組合物?？梢灾委煹拇x病癥的非限制性例子包括1型和2型糖尿病，以及肥胖。

在本發(fā)明的下列詳細(xì)說明中，闡明了在本發(fā)明的這些和其他方面。

附圖簡介

圖1A和1B顯示了具有不同N-末端突變的GLP-1-FGF21-PEG融合蛋白，和毒蜥外泌肽-4-FGF21-PEG融合蛋白的活性。圖1A顯示了添加的用于減慢DPP-4蛋白酶加工的突變(GLP-1肽(圓圈)或含有野生型(V231；空心方塊)、G0(V251；空心圓圈)、A8G(V258；空心三角)、A8S(V232；三角)或E9P(V271；方塊)GLP-1的雙功能蛋白質(zhì))。圖1B顯示了毒蜥外泌肽-4融合物(GLP-1肽(方塊)或具有毒蜥外泌肽-4 1-39(V234；三角)、1-30(V267；圓圈)或1-30/E16G/E17Q(V268；空心三角)的雙功能蛋白質(zhì))。

圖2顯示了GLP-1-FGF21-PEG融合蛋白(FGF21-PEG(V294；空心方塊)、GLP-1(A8S)-PEG(V253；空心圓圈)或具有野生型GLP-1(V237；圓圈)或GLP-1(A8S)(V235；三角)GLP-1的雙功能蛋白質(zhì))的藥代動(dòng)力學(xué)特性(PK)。顯示了注射0.25mg/kg的野生型非PEG化的FGF21的PK用于比較(方塊)。

圖3A-3C顯示了使用口服糖耐受測試(OGTT)測量半壽期延長的GLP-1-FGF21-PEG融合蛋白的效力的結(jié)果。腹膜內(nèi)(i.p.)注射1mg/kg化合物或載體(實(shí)心白色柱；三角)，對(duì)8周齡C57BL/6J小鼠(n＝5)給藥。在給藥1和24小時(shí)后測量血糖，評(píng)估GLP-1的急性效果，1小時(shí)的效果與野生型GLP-1(V239；散列柱；方塊)和GLP-1(A8S)形態(tài)(V232；黑色柱；圓圈)相似，而24小時(shí)仍然保持比GLP-1(A8S)形態(tài)略佳。在第三晚，在給藥后72小時(shí)用1.5g/kg口服葡萄糖刺激前，使小鼠空腹。用A8S形態(tài)給藥的小鼠表現(xiàn)出比用野生型GLP-1形態(tài)給藥的小鼠顯著改善的血糖控制，提示A8S突變?cè)黾踊钚訥LP-1的長期水平。

圖4顯示了GLP-1-FGF21-PEG融合蛋白在ob/ob小鼠中的功效。用所示化合物對(duì)10周齡雄性ob/ob小鼠(n＝8)i.p.給藥，每周2次，共計(jì)2周。等量給藥的FGF21-PEG(V238；對(duì)角線散列柱；方塊)和GLP-1-FGF21(R154C)-PEG(V239；水平線散列柱；空心方塊)顯示出與載體治療組(圓圈)非常相似的對(duì)血糖水平、體重和肝臟健康狀態(tài)(由血清ALT水平和肝重測量)的改善作用。DPP-4-抗性融合物、0.2mg/kg GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG(V235；垂直線散列柱；空心三角)顯示出與其他化合物相似的效力，但以1mg/kg GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG(V235；黑色柱；三角)的相等給藥產(chǎn)生額外降低血糖、體重、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和肝重。

圖5A-5G顯示了在ob/ob小鼠中GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG(V235；黑色柱；空心三角)融合蛋白與共同施用FGF21(R154C)-PEG+GLP-1(A8S)-PEG(垂直線散列柱；空心圓圈)、單一施用FGF21(R154C)-PEG(V238；0.2mg/kg(淺色對(duì)角線散列柱)；1mg/kg(深色對(duì)角線散列柱；方塊))，和單一施用GLP-1(A8S)-PEG(V253；0.2mg/kg(淺色水平線散列柱)；1mg/kg(深色水平線散列柱；空心方塊))的比較。用所示化合物或載體(實(shí)心白色柱；圓圈)對(duì)9周齡雄性ob/ob小鼠(n＝8)i.p.給藥，每周2次，共計(jì)4周。融合物顯示出比共同施用FGF21(R154C)-PEG+GLP-1(A8S)-PEG顯著改善的效力。雖然僅在FGF21(R154C)-PEG和GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG中觀察到中等程度的體重丟失，但其他組卻增加了大量體重，僅部分是由于食物攝取的差異。

圖6A-6F顯示了GLP-1(A8S)-FGF21-PEG融合蛋白在ob/ob小鼠中的效力，比較FGF21(R154C)-PEG(V235；深色柱)與FGF21(V76)-PEG(V272；淺色柱)。用所示化合物或載體(實(shí)心白色柱)對(duì)9周齡雄性ob/ob小鼠(n＝8)i.p.給藥，每周2次，共計(jì)2周。從0.05至0.2mg/kg(0.05對(duì)角線散列柱；0.1水平線散列柱；0.2垂直線散列柱)，GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG和GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG融合物都表現(xiàn)出對(duì)葡萄糖控制和體重的劑量應(yīng)答。在0.2mg/kg，GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG比GLP-1(A8S)-FGF21FGF21(R154C)-PEG更有效，特別是對(duì)于降低葡萄糖水平、體重、血清甘油三酯和膽固醇。圖6A-6C分別顯示了基礎(chǔ)葡萄糖(AUC)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和血清總膽固醇的水平。圖6D-6F分別顯示了D12體重、肝脂類和血清甘油三酯的水平。

圖7A-7B顯示了相對(duì)于單獨(dú)的活性劑的組合，GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG融合蛋白改善胰腺功能和增加胰島的胰島素含量的能力。用單獨(dú)的GLP-1(A8S)-PEG+FGF21(V76)-PEG的組合(V76+V253；垂直線散列柱)，以及用本發(fā)明的GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG雙功能融合蛋白(V272；對(duì)角線散列柱；淺色為0.5mg/kg，深色為1mg/kg)或載體(白色柱)對(duì)Db/db小鼠每周給藥2次，共計(jì)4周。

圖8A-8B顯示了相對(duì)于單獨(dú)的活性劑的組合，GLP-1-FGF21-PEG融合蛋白改善葡萄糖降低和體重的能力。使用載體(白色柱；空心圓圈)、單獨(dú)的GLP-1(A8S)-PEG(V253；3mg/kg(淺色水平線散列柱；空心菱形)和5mg/kg(深色水平線柱；菱形))和FGF21(V76)-PEG(3mg/kg(V76；淺色對(duì)角線散列柱；空心方塊)和5mg/kg(深色對(duì)角線散列柱；方塊))的組合，以及用本發(fā)明的GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG雙功能融合蛋白(V272；0.2mg/kg(小格子柱；空心三角)；1mg/kg(大格子柱；三角))，對(duì)Db/db小鼠每周給藥2次，共計(jì)2周。如圖可見，0.2mg/kg的GLP-1(7-35；A8S)-FGF21(V76)-PEG雙功能融合蛋白(V272)與5mg/kg的FGF21(V76)-PEG同樣有效。圖中還可見，對(duì)于血糖和體重終點(diǎn)而言，1.0mg/kg的GLP-1(7-35；A8S)-FGF21(V76)-PEG雙功能融合蛋白(V272)比FGF21(V76)-PEG+GLP-1(7-35；A8S)-PEG(1+1mg/kg(淺色水平線散列柱；X形)和3+3mg/kg(深色水平線柱；星形)的最大有效組合劑量更有效。

圖9顯示了FGF21活性測定的結(jié)果。在用所示化合物處理HEK293-β-klotho細(xì)胞后，測量ERK的磷酸化。在存在或缺少等摩爾艾塞那肽(艾塞那肽)的條件下，與相同的FGF21變體FGF21(V76)-PEG對(duì)比，GLP-1(A8S)-V76-PEG(V272)的信號(hào)高度的活性顯著更高。

圖10展示了與匹配的單個(gè)激動(dòng)劑蛋白質(zhì)或肽相比，用于測量融合蛋白活性的受體藥理學(xué)測定法的結(jié)果。在化合物處理1小時(shí)后，測定用GLP-1R和FGFR1c/β-klotho(10a和10b)，或僅用GLP-1R(10c和10d)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的GLP-1R對(duì)β-抑制蛋白的招募。測定法中檢測的分子是：毒蜥外泌肽-4(方塊)、GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272；圓圈)、GLP-1(A8S)-PEG(V253；三角)、V253+FGF21(V76)-PEG(空心菱形)、毒蜥外泌肽-4(1-39)-Fc-FGF21(V103)(V211；空心圓圈)、毒蜥外泌肽-4(1-39)-Fc(V201；空心三角)和V201+FGF21(V101)(菱形)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明的蛋白質(zhì)代表了如本領(lǐng)域已知的全長野生型FGF21多肽的修飾的形態(tài)。以FGF21野生型序列作為參考序列(SEQ ID NO:1)，例如當(dāng)需要比較FGF21野生型序列和蛋白質(zhì)變體時(shí)。FGF21野生型序列具有NCBI參考序列號(hào)NP_061986.1，并且可見于這類公開的專利中，例如屬于Chiron Corporation的US 6,716,626B1(SEQ ID NO:1)。

下面顯示了編碼全長FGF21多肽的相應(yīng)mRNA序列(NCBI參考序列號(hào)NM_019113.2)(SEQ ID NO:2)：

成熟的FGF21序列缺少前導(dǎo)序列，并且還可以包括多肽的其他修飾，如氨基末端(有或無前導(dǎo)序列)和/或羧基末端的蛋白水解加工、從較大的前體切割較小的多肽、N-連接和/或O-連接的糖基化，和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他翻譯后修飾。成熟的FGF21序列的代表性例子具有下列序列(SEQ ID NO:3，其代表全長FGF21蛋白序列(NCBI參考序列號(hào)NP_061986.1)的第29-209位氨基酸)：

下面顯示了編碼成熟的FGF21多肽(SEQ ID NO:3)的相應(yīng)cDNA序列(SEQ ID NO:4)：

本發(fā)明的蛋白質(zhì)代表了全長的野生型GLP-1多肽的修飾形態(tài)，如本領(lǐng)域已知的。以GLP-1野生型序列作為參考序列(SEQ ID NO:5)，例如當(dāng)需要比較GLP-1野生型序列和蛋白質(zhì)變體時(shí)。

GLP-1野生型序列是翻譯后修飾的，否則源自前原胰高血糖素野生型序列。前原胰高血糖素(preproglucagon)序列(SEQ ID NO:5)具有NCBI參考序列號(hào)NP_002045，并且可見于這類專利公開中，例如分別屬于Eli Lilly和Co.and the General Hospital Corp.的WO98/19698和WO87/06941A。如上所述，例如，在Goke,等人(1991)European Journal of Clinical Investigation 21,135中，GLP-1是源自前原胰高血糖素的37mer(GLP-1構(gòu)成了前原胰高血糖素的第92-138位殘基，在下文SEQ ID NO:5中是下劃線的)。通過切割6個(gè)N-末端殘基，將GLP-1進(jìn)一步加工成活性31mer。

加工的、野生型GLP-1序列的例子如下(SEQ ID NO:129)：

1 HDEFERHAEG TFTSDVSSYL EGQAAKEFIA WLVKGRG

活性GLP-1序列的例子如下(SEQ ID NO:30)：

1 HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR G

編碼前原胰高血糖素GLP-1野生型序列(SEQ ID NO:5)的相應(yīng)mRNA序列顯示如下(SEQ ID NO:6)：

本發(fā)明的蛋白質(zhì)代表了全長野生型毒蜥外泌肽-4多肽的修飾形態(tài)，如本領(lǐng)域已知的。以毒蜥外泌肽-4野生型序列作為參考序列(SEQ ID NO:7)，例如當(dāng)需要比較毒蜥外泌肽-4野生型序列和蛋白質(zhì)變體時(shí)。

毒蜥外泌肽-4野生型序列具有NCBI參考序列號(hào)GenBank：AAB22006.1，并可見于這類專利公開中，例如屬于Amylin Pharmaceuticals,Inc.和Eli Lilly and Co.的US 5,424,286。野生型序列的例子如下(SEQ ID NO:7)：

1 HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS

本發(fā)明的蛋白質(zhì)可包含本文列舉的野生型蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)變體或突變體，例如，F(xiàn)GF21變體、GLP-1變體，和/或毒蜥外泌肽-4變體。如本文使用的，術(shù)語“蛋白質(zhì)變體”、“人變體”、“多肽或蛋白質(zhì)變體”、“變體”、“突變體”及其任何類似的術(shù)語或其特定形態(tài)(例如，“FGF21蛋白變體”、“人GLP-1變體”、“毒蜥外泌肽-4多肽或蛋白變體”、“變體”、“FGF21突變體”等)定義了包含天然存在的(即，野生型)蛋白質(zhì)或多肽對(duì)應(yīng)物或相應(yīng)的天然序列的修飾、截短、其他變體的蛋白質(zhì)或多肽序列。例如，相對(duì)于本文所述的野生型(即，天然存在的)FGF21蛋白，描述了“變體FGF21”或“FGF21突變體”。

表1中列舉了本發(fā)明的代表性的雙功能蛋白質(zhì)序列。所述激動(dòng)劑的描述包括了單個(gè)構(gòu)件激動(dòng)劑，以及適用時(shí)，接頭。如果使用變體作為構(gòu)件激動(dòng)劑，則所作出的改變或取代是相對(duì)于其野生型對(duì)應(yīng)物編號(hào)的。作為示例，“雙功能蛋白-1”(SEQ ID NO:9)含有本文所述的野生型GLP-1序列的第7-35位殘基(即，GLP-1受體激動(dòng)劑)、接頭序列和FGF21變體(即，F(xiàn)GF21受體激動(dòng)劑)，所述FGF21變體具有多個(gè)所列舉對(duì)本文所述FGF21野生型序列(SEQ ID NO:1)的改變。

表1.本發(fā)明的雙功能蛋白和核苷酸

用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)中的變體或突變體，例如，野生型FGF21、GLP-1和/或毒蜥外泌肽-4的變體的特征是相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)至少一個(gè)取代的、添加的和/或去除的氨基酸。此外，變體可包括相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的N-和/或C-末端截短。一般而言，變體具有野生型蛋白質(zhì)的一些改性的結(jié)構(gòu)或功能的特性。例如，變體可具有在濃縮溶液中增強(qiáng)的或改善的物理穩(wěn)定性(例如，較少的疏水性介導(dǎo)的聚集作用)，當(dāng)與血漿孵育時(shí)增強(qiáng)的或改善的血漿穩(wěn)定性，或降低的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，或增強(qiáng)的或改善的生物活性，同時(shí)保留有利的生物活性譜。

構(gòu)成本發(fā)明的蛋白質(zhì)的部分及其野生型比較蛋白質(zhì)之間的差異的可接受的氨基酸取代和修飾包括，但不限于，一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代，包括用吡咯賴氨酸、吡咯啉-羧基-賴氨酸(Pcl)和非天然存在的氨基酸類似物取代，和截短。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)(例如，本發(fā)明的融合蛋白)包括但不限于，定點(diǎn)突變體、截短的多肽、抗蛋白水解的突變體、聚集作用降低的突變體、組合突變體，和本文所述的融合蛋白。

蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以在任何本發(fā)明的蛋白質(zhì)的N-末端導(dǎo)入甲硫氨酸或甲硫氨酸-精氨酸序列，用于在大腸桿菌中表達(dá)，并且被考慮落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，用于調(diào)控表達(dá)水平、純化或穩(wěn)定的目的，可以在任何本發(fā)明的蛋白質(zhì)的N-末端導(dǎo)入額外的標(biāo)簽或融合結(jié)構(gòu)域，有或沒有被用于之后去除所述標(biāo)簽或融合結(jié)構(gòu)域的特定蛋白酶靶向消化的額外的肽，用于在任何宿主細(xì)胞中表達(dá)，并且被考慮落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以在任何本發(fā)明的蛋白質(zhì)的N-末端導(dǎo)入將表達(dá)的蛋白質(zhì)靶向到周質(zhì)空間或胞外空間的前導(dǎo)肽，用于在大腸桿菌或其他細(xì)菌宿主中表達(dá)，并被考慮落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以在任何本發(fā)明的蛋白質(zhì)的N-末端導(dǎo)入將表達(dá)的蛋白質(zhì)靶向到ER、分泌囊泡或胞外空間的前導(dǎo)肽，用于在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)，并被考慮落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)可具有與藥物防腐劑(例如，間甲酚、苯酚、苯甲醇)增加的相容性，因此使得能夠制備保藏的藥物制劑，該制劑在儲(chǔ)藏過程中維持蛋白質(zhì)的物理化學(xué)特性和生物學(xué)活性。因此，在生理學(xué)和保藏的藥物制劑條件下，相對(duì)于野生型具有增強(qiáng)的藥物穩(wěn)定性的變體在濃縮溶液中都具有改善的物理穩(wěn)定性，同時(shí)維持了生物學(xué)效價(jià)。作為非限制性的例子，相比其對(duì)應(yīng)的野生型對(duì)應(yīng)物或相應(yīng)的天然序列，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以更耐受蛋白水解和酶促降解；可以具有改善的穩(wěn)定性；可以較不易聚集。如本文使用的，這些術(shù)語不是互斥的或限制的，給定的變體完全可能具有野生型蛋白質(zhì)的一種或多種改性的特性。

本發(fā)明還涵蓋了編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸分子，所述蛋白質(zhì)包含例如，與SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少約95％同一性的FGF21氨基酸序列，但其中賦予FGF21蛋白變體理想特性(例如，改善的FGF21-受體效價(jià)、蛋白水解抗性、增加的半壽期或降低的聚集特性，及其組合)的特定殘基沒有被另外修飾。換言之，除了FGF21突變體序列中為了賦予蛋白水解抗性、降低的聚集作用或其他特性而已經(jīng)被修飾的殘基外，約5％(可選的4％，可選的3％，可選的2％，可選的1％)的FGF21突變體序列中的所有其他氨基酸殘基可被修飾。這樣的FGF21突變體具有野生型FGF21多肽的至少一種活性。

類似的，本發(fā)明還包含編碼分子的GLP-1和毒蜥外泌肽-4部分的核酸分子，其氨基酸序列分別與SEQ ID NO:30和7的氨基酸序列具有至少約85％同一性，更優(yōu)選具有至少約90至95％同一性，但其中賦予雙功能蛋白質(zhì)變體理想特性(例如，蛋白水解抗性、增加的半壽期或降低的聚集特性，及其組合)的特定殘基沒有被另外修飾。

本發(fā)明還涵蓋了包含這樣的核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6，和編碼野生型毒蜥外泌肽-4的cDNA序列的核苷酸序列具有至少約85％同一性，更優(yōu)選至少約90至95％同一性，但其中編碼賦予被編碼的蛋白質(zhì)的蛋白水解抗性、降低的聚集特性或其他特性的氨基酸殘基的核苷酸沒有被另外修飾。換言之，除了編碼FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4突變體序列中為了賦予蛋白水解抗性、降低的聚集特性或其他特性而已經(jīng)被修飾的殘基的核苷酸外，突變體序列中約15％，更優(yōu)選約10至5％的所有其他核苷酸可被修飾。這樣的核酸分子編碼具有其野生型對(duì)應(yīng)物的至少一種活性的蛋白質(zhì)。

本文提供了用于生成本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法，其中這類方法涉及對(duì)蛋白質(zhì)的野生型形態(tài)(例如，本文所述的FGF21野生型蛋白質(zhì))的位點(diǎn)特異性修飾和非位點(diǎn)特異性修飾，例如，野生型蛋白質(zhì)的截短，和在野生型蛋白質(zhì)內(nèi)的目標(biāo)位置位點(diǎn)特異性摻入氨基酸。所述修飾增強(qiáng)了本發(fā)明的蛋白質(zhì)相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性，并且，在一些情況下，充當(dāng)例如標(biāo)記和蛋白質(zhì)半壽期延長活性劑的連接點(diǎn)，并用于將所述變體固定在固體支持物表面上的目的。本發(fā)明相關(guān)的實(shí)施方案是生產(chǎn)能夠生產(chǎn)本發(fā)明所述的雙功能蛋白質(zhì)的細(xì)胞，和生產(chǎn)能夠生產(chǎn)含有編碼所述變體的DNA的載體的細(xì)胞的方法。

在某些實(shí)施方案中，使用這樣的修飾，例如位點(diǎn)特異性修飾，來連接綴合物(例如，連接PEG基團(tuán)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽)，用于例如延長所述蛋白質(zhì)、多肽和/或肽的半壽期或改善所述蛋白質(zhì)、多肽和/或肽的生物學(xué)特性的目的。本文其他地方描述了所述技術(shù)。

在其他實(shí)施方案中，使用這樣的修飾，例如位點(diǎn)特異性修飾，來連接延長本發(fā)明的蛋白質(zhì)的半壽期的其他聚合物、小分子和重組蛋白質(zhì)序列。一個(gè)這樣的實(shí)施方案包括連接脂肪酸或特定的白蛋白結(jié)合化合物與蛋白質(zhì)、多肽和/或肽。在其他實(shí)施方案中，修飾對(duì)特定的氨基酸類型進(jìn)行，并且可以連接蛋白質(zhì)上的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。

在其他實(shí)施方案中，使用這樣的修飾，例如位點(diǎn)特異性修飾，作為連接工具，用于生產(chǎn)野生型和/或變體多聚體，例如二聚體(同源二聚體或異源二聚體)或三聚體或四聚體。這些多聚的蛋白質(zhì)分子可以額外具有這樣的基團(tuán)(如PEG、糖和/或PEG-膽固醇綴合物)，所述基團(tuán)與其他蛋白質(zhì)(如Fc、人血清白蛋白(HAS)等)氨基末端或羧基末端連接或融合。

在其他實(shí)施方案中，使用這樣的位點(diǎn)特異性修飾來生產(chǎn)蛋白質(zhì)、多肽和/或肽，其中位點(diǎn)特異性摻入的吡咯賴氨酸、吡咯啉-羧基-賴氨酸或吡咯賴氨酸類似物或非天然存在的氨基酸(對(duì)-乙酰-Phe、對(duì)-疊氮-Phe)的位置允許這類蛋白質(zhì)、多肽和/或肽在固體支持物的表面上受控的方向和連接，或者具有連接的基團(tuán)例如PEG、糖和/或PEG-膽固醇綴合物。

在其他實(shí)施方案中，使用這樣的位點(diǎn)特異性修飾來位點(diǎn)特異性地交聯(lián)蛋白質(zhì)、多肽和/或肽，從而形成異源寡聚物，包括但不限于異源二聚體和異源三聚體。在其他實(shí)施方案中，使用這樣的位點(diǎn)特異性修飾來位點(diǎn)特異性地交聯(lián)蛋白質(zhì)、多肽和/或肽，從而形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)綴合物、蛋白質(zhì)-多肽綴合物、蛋白質(zhì)-肽綴合物、多肽-多肽綴合物、多肽-肽綴合物或肽-肽綴合物。在其他實(shí)施方案中，位點(diǎn)特異性修飾可包括允許在蛋白質(zhì)、多肽或肽的單個(gè)位點(diǎn)上連接多于一種類型的分子的分枝點(diǎn)。

在其他實(shí)施方案中，可以以非位點(diǎn)特異性方式進(jìn)行本文列舉的修飾，并獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)綴合物、蛋白質(zhì)-多肽綴合物、蛋白質(zhì)-肽綴合物、多肽-多肽綴合物、多肽-肽綴合物或肽-肽綴合物。

定義

本文全文使用了多種定義。大部分詞匯都具有屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員詞匯的含義。在本文的下文或其他地方具體定義的詞匯具有本發(fā)明上下文作為整體所提供的含義，并且通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的意思。

如本文使用的，術(shù)語“FGF21”指成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)蛋白質(zhì)家族的成員。FGF21的氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)NP_061986.1)如SEQ ID NO:1所述，其相應(yīng)的多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述(NCBI參考序列號(hào)NM_019113.2)?！癋GF21變體”、“FGF21突變體”和相似術(shù)語描述了FGF21蛋白的修飾的形態(tài)，例如，構(gòu)件氨基酸殘基被缺失、添加、修飾或取代。

如本文使用的，術(shù)語“FGF21受體”指FGF21的受體(Kharitonenkov,A,等人(2008)Journal of Cellular Physiology 215:1-7；Kurosu,H等人(2007)JBC 282:26687-26695；Ogawa,Y等人(2007)PNAS 104:7432-7437)。

術(shù)語“FGF21多肽”指在人中表達(dá)的天然存在的多肽。出于本公開內(nèi)容的目的，術(shù)語“FGF21多肽”可互換的使用，指任何全長FGF21多肽，例如，由209個(gè)氨基酸殘基組成且由SEQ ID NO:2的核苷酸序列編碼的SEQ ID NO:1；多肽的任何成熟形式，其由181個(gè)氨基酸殘基組成，并且其中去除了全長FGF21多肽的氨基末端的28個(gè)氨基酸殘基(即，構(gòu)成信號(hào)肽)。

如本文使用的，“變體76”或“V76”是FGF21蛋白變體，特征是通過Cys154連接的40kDa分枝的PEG，和相對(duì)于177個(gè)氨基酸的野生型蛋白質(zhì)的8個(gè)點(diǎn)突變。本文詳細(xì)的描述了變體的合成。

如本文使用的，“變體101”或“V101”是FGF21蛋白變體，特征是改造的二硫橋，和相對(duì)于177個(gè)氨基酸的野生型蛋白質(zhì)的8個(gè)點(diǎn)突變，其作為含GS接頭的與人IgG1Fc-結(jié)構(gòu)域的融合物表達(dá)。本文詳細(xì)的描述了變體的合成。

如本文使用的，“變體103”或“V103”是FGF21蛋白變體，特征是改造的二硫橋，和相對(duì)于177個(gè)氨基酸的野生型蛋白質(zhì)的8個(gè)點(diǎn)突變，其作為含GS接頭的與人IgG1Fc-結(jié)構(gòu)域的融合物表達(dá)。本文詳細(xì)的描述了變體的合成。

如本文使用的，“變體188”或“V188”是FGF21蛋白變體，特征是改造的二硫橋，和相對(duì)于177個(gè)氨基酸的野生型蛋白質(zhì)的8個(gè)點(diǎn)突變，其作為含(SGGGG)₃接頭的與人IgG1Fc-結(jié)構(gòu)域的融合物表達(dá)。本文詳細(xì)的描述了變體的合成。

“GLP-1-FGF21-PEG雙重激動(dòng)劑”、“雙功能蛋白質(zhì)”、“雙功能融合蛋白”、“雙活性蛋白質(zhì)”、“融合產(chǎn)物”、“雙重FGF21受體激動(dòng)劑和GLP-1受體激動(dòng)劑”、“本發(fā)明的雙重FGF21受體激動(dòng)劑和GLP-1受體激動(dòng)劑”、“GLP-1-FGF21融合蛋白”、“本發(fā)明的融合蛋白”、“本發(fā)明的融合物”和相似的術(shù)語定義了蛋白質(zhì)或多肽融合物，所述蛋白質(zhì)或多肽融合物至少包含與另一個(gè)代謝調(diào)節(jié)物(如GLP-1或毒蜥外泌肽-4)融合或連接的FGF21多肽或蛋白質(zhì)變體、突變體或截短的形態(tài)。其包含具有關(guān)于其各個(gè)構(gòu)件的受體的雙活性或雙功能的單個(gè)分子，即，其表現(xiàn)出激發(fā)FGF21受體和GLP-1受體的能力。所述融合蛋白的構(gòu)件序列可包含天然存在的(即，野生型)蛋白質(zhì)或多肽對(duì)應(yīng)物的修飾、截短、其他變體，并可應(yīng)用任何數(shù)量的多種其他修飾，例如用于延長半壽期的PEG基團(tuán)。

本發(fā)明的GLP-1-FGF21-PEG融合蛋白的特別優(yōu)選的實(shí)施方案摻入(本文定義的)V76作為FGF21變體。所述優(yōu)選的實(shí)施方案在本文中也被稱為“GLP-1(A8S)-FGF21-PEG”，并且特征是相對(duì)于野生型GLP-1序列(SEQ ID NO:5129)第8位丙氨酸被取代為絲氨酸，和相對(duì)于野生型FGF21序列(SEQ ID:1)第154位精氨酸被取代為半胱氨酸。GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG的序列如下(SEQ ID NO:9)。

術(shù)語“分離的核酸分子”指這樣的本發(fā)明的核酸分子，所述核酸分子(1)已經(jīng)與從源細(xì)胞中分離總核酸時(shí)至少約50％的天然發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物或其他材料分離，(2)不與“分離的核酸分子”天然連接的全部或部分多核苷酸連接，(3)與不天然連接的多核苷酸有效連接，或(4)不作為較大的多核苷酸序列的一部分天然存在。優(yōu)選的，本發(fā)明的分離的核酸分子基本上不含在其自然環(huán)境中可見的任何其他污染的核酸分子或其他污染物，所述污染的核酸分子或污染物將干擾其在多肽生產(chǎn)或其治療、診斷、預(yù)后或研究用途中的應(yīng)用。

術(shù)語“載體”用于指任何用于將編碼信息轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞的分子(例如，核酸、質(zhì)?；虿《?。

術(shù)語“表達(dá)載體”指適合轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞和含有核酸序列的載體，所述核酸序列指導(dǎo)和/或控制插入的異源核酸序列的表達(dá)。表達(dá)包括但不限于這樣的過程，如轉(zhuǎn)錄、翻譯和RNA剪切(如果存在內(nèi)含子)。

術(shù)語“有效連接的”在本文中用于指側(cè)翼序列的排列，其中配制或裝配所述側(cè)翼序列以實(shí)施其正常的功能。融合蛋白的元件可以是彼此有效連接的，使得允許融合蛋白如同其為天然存在的、內(nèi)源性蛋白質(zhì)那樣發(fā)揮功能，和/或以協(xié)同的方式組合所述融合蛋白的不同元件。

在核苷酸水平，與編碼序列有效連接的側(cè)翼序列能夠影響編碼序列的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)編碼序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)，編碼序列與啟動(dòng)子是有效連接的。只要能夠正確的發(fā)揮功能，側(cè)翼序列不必與編碼序列連續(xù)。因此，例如，啟動(dòng)子序列和編碼序列之間可以存在間插的非翻譯但轉(zhuǎn)錄的序列，并且啟動(dòng)子序列仍然可以被認(rèn)為是與編碼序列“有效連接的”。

術(shù)語“宿主細(xì)胞”用于指已被轉(zhuǎn)化的，或能夠用核酸序列轉(zhuǎn)化，并然后能夠表達(dá)選擇的目標(biāo)基因的細(xì)胞。術(shù)語包括親代細(xì)胞的后代，不論后代的形態(tài)學(xué)或遺傳學(xué)組成是否與原始親本相同，只要仍存在選擇的基因。

如本文使用的，術(shù)語“氨基酸”指天然存在的氨基酸、以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮功能的非天然氨基酸、氨基酸類似物和氨基酸模擬物，都處于其D型和L型立體異構(gòu)體如果其結(jié)構(gòu)允許這類立體異構(gòu)體形式。在本文中，用名稱、常規(guī)已知的三字母符號(hào)或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的一字母符號(hào)稱呼氨基酸。

當(dāng)與生物學(xué)材料(如核酸分子、多肽、宿主細(xì)胞等)結(jié)合使用時(shí)，術(shù)語“天然存在的”指在自然界發(fā)現(xiàn)的材料并且不是人為操作的。類似的，“非天然存在的”在本文中用于指在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)的，或經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾或人為合成的材料。當(dāng)與核苷酸結(jié)合使用時(shí)，術(shù)語“天然存在的”指堿基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。當(dāng)與氨基酸結(jié)合使用時(shí)，術(shù)語“天然存在的”指20種常規(guī)氨基酸(即，丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、賴氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y))，以及硒代半胱氨酸、吡咯賴氨酸(Pyl或O)和吡咯啉-羧基-賴氨酸(Pcl或Z)。

吡咯賴氨酸(Pyl)是在甲烷八疊球菌(Methanosarcina)科的產(chǎn)甲烷古菌(methanogenic archaea)的甲胺甲基轉(zhuǎn)移酶中天然發(fā)現(xiàn)的氨基酸。吡咯賴氨酸是在相應(yīng)mRNA中符合讀框的UAG密碼子處共翻譯摻入的賴氨酸類似物，被認(rèn)為是第22種天然氨基酸。

至少如PCT專利公開WO2010/48582(申請(qǐng)人IRM,LLC)所述，在大腸桿菌中嘗試生物合成吡咯賴氨酸(Pyl)導(dǎo)致形成“去甲基化的吡咯賴氨酸”，在本文中被稱為吡咯啉-羧基-賴氨酸或Pcl。如本文使用的，“Pcl”指Pcl-A或Pcl-B。

如本文使用的，術(shù)語“非天然氨基酸”和“不天然氨基酸”是可互換的，意在代表不能在任何生物體中使用來自任何生物體的未修飾或修飾的基因，而生物合成生成的氨基酸結(jié)構(gòu)，不論是相同或不同的。術(shù)語指在天然存在的(野生型)FGF21蛋白序列或本發(fā)明的序列中不存在的氨基酸殘基。這包括但不限于，不是20種天然存在的氨基酸,硒代半胱氨酸,吡咯賴氨酸(Pyl)或吡咯啉-羧基-賴氨酸(Pcl,例如PCT專利公開WO2010/48582所述)中的一種的修飾的氨基酸和/或氨基酸類似物?？梢酝ㄟ^取代天然存在的氨基酸，和/或向天然存在的(野生型)FGF21蛋白序列或本發(fā)明的序列中插入非自然氨基酸，導(dǎo)入這類非自然氨基酸殘基。還可以摻入非天然氨基酸殘基，使得給予FGF21分子理想的功能性，例如連接官能團(tuán)(例如，PEG)的能力。如本文使用的，當(dāng)與氨基酸結(jié)合使用時(shí)，符號(hào)“U”應(yīng)該意指“非天然氨基酸”和“不天然氨基酸”。

此外，應(yīng)理解這類“不天然氨基酸”通常需要修飾的tRNA和修飾的tRNA合成酶(RS)用于摻入到蛋白質(zhì)中。這些“選擇的”正交tRNA/RS對(duì)是通過Schultz等人研發(fā)的選擇過程，或通過隨機(jī)或靶向突變產(chǎn)生的。作為示例，吡咯啉-羧基-賴氨酸是“天然的氨基酸”，因?yàn)樗峭ㄟ^從一種生物體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的基因生物合成產(chǎn)生的，且因?yàn)樗峭ㄟ^使用天然的tRNA和tRNA合成酶基因摻入到蛋白質(zhì)中的，但是p-氨基苯丙氨(參見Generation of a bacterium with a 21amino acid genetic code,Mehl RA,Anderson JC,Santoro SW,Wang L,Martin AB,King DS,Horn DM,Schultz PG.J Am Chem Soc.2003Jan 29；125(4):935-9)則是“不天然氨基酸”，因?yàn)樗m然是生物合成產(chǎn)生，但它是通過“選擇的”(即，不是“天然存在的”)正交tRNA/tRNA合成酶對(duì)摻入到蛋白質(zhì)中的。

修飾的編碼的氨基酸包括但不限于羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、O-磷酸絲氨酸、吖丁啶羧酸、2-氨基已二酸、3-氨基已二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2,4-二氨基異丁酸、鎖鏈素、2,2’-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羥賴氨酸、別-羥賴氨酸、3-羥脯氨酸、4-羥脯氨酸、異鎖鏈素、別-異亮氨酸,N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基纈氨酸、naphthalanine、正纈氨酸、正亮氨酸、鳥氨酸、戊基甘氨酸、2-哌啶酸和硫代脯氨酸。術(shù)語“氨基酸”還包括這樣的天然存在的氨基酸，其在某些生物體中是代謝物但不由遺傳密碼編碼用于摻入到蛋白質(zhì)中。這類氨基酸包括但不限于鳥氨酸、D-鳥氨酸或D-精氨酸。

如本文使用的，術(shù)語“氨基酸類似物”指具有與天然存在的氨基酸相同基礎(chǔ)化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，僅作為示例，結(jié)合氫原子、羧基、氨基和R基的α-碳。氨基酸類似物包括天然的和不天然的氨基酸，所述氨基酸是可逆或不可逆地化學(xué)封閉的，或者其C-末端的羧基、其N-末端的氨基和/或其側(cè)鏈官能團(tuán)是化學(xué)修飾的。這類類似物包括但不限于甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸砜、S-(羧基甲基)-半胱氨酸,S-(羧基甲基)-半胱氨酸亞砜、S-(羧基甲基)-半胱氨酸砜、天冬氨酸-(β-甲酯)、N-乙基甘氨酸、丙氨酸甲酰胺、高絲氨酸、正亮氨酸和甲硫氨酸甲基锍。

如本文使用的，術(shù)語“氨基酸模擬物”指具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，但其以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)的化學(xué)化合物。

術(shù)語“生物學(xué)活性變體”指任何用于本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)中的多肽變體，例如，作為融合物的構(gòu)件蛋白，具有其野生型(例如，天然存在的)蛋白質(zhì)或多肽對(duì)應(yīng)物的活性，如調(diào)節(jié)血糖、HbA1c、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；增加胰腺功能；降低肝臟的脂類水平；減少體重；改善糖耐受、能量消耗或胰島素敏感性的能力，而不論導(dǎo)入到多肽變體中的修飾的類型或數(shù)量。具有相對(duì)于其野生型形態(tài)一定程度減少的活性水平的多肽變體仍然可以被認(rèn)為是生物學(xué)活性的多肽變體。本發(fā)明的生物學(xué)活性的多肽變體的非限制性的代表例子是這樣的FGF21變體，其是修飾的，且具有與野生型FGF21相似或增強(qiáng)的生物學(xué)特性。

術(shù)語“有效量”和“治療有效量”都指用于支持野生型多肽或蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)物的一種或多種生物學(xué)活性的可觀察水平的本發(fā)明的融合蛋白的量，如降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；降低肝臟的甘油三酯或膽固醇水平；降低肝臟的甘油三酯或脂類水平；減少體重；或改善糖耐受、能量消耗或胰島素敏感性的能力。例如，向表現(xiàn)出、患有或傾向患有FGF21-相關(guān)疾病或GLP-1-相關(guān)疾病(如1型或2型糖尿病、肥胖或代謝綜合征)的患者施用的“治療有效量”是這樣的量，所述量導(dǎo)致、減輕或者引起與上述病癥相關(guān)的病理學(xué)癥狀、疾病進(jìn)程、生理病況的改善或抵抗死于上述病癥。出于本發(fā)明的目的，“對(duì)象”或“患者”優(yōu)選是人，但也可以是動(dòng)物，更具體的是伴侶動(dòng)物(例如，狗、貓等)、農(nóng)場動(dòng)物(例如，牛、綿羊、豬、馬等)和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。

術(shù)語“可藥用的運(yùn)載體”或“生理學(xué)可接受的運(yùn)載體”在本文中指適合實(shí)現(xiàn)或增強(qiáng)本發(fā)明的融合蛋白遞送的一種或多種制劑材料。

術(shù)語“抗原”指分子或分子的一部分，其能夠被抗體結(jié)合，并且還能夠用于在動(dòng)物中生產(chǎn)能夠結(jié)合該抗原的表位的抗體。抗原可具有一個(gè)或多個(gè)表位。

術(shù)語“天然Fc”指包含獲得自完整抗體的消化，或者通過其他手段生產(chǎn)的非抗原結(jié)合片段的序列的分子或序列，不論其是單體或多聚體的形式，且可以含有鉸鏈區(qū)。天然Fc的原始免疫球蛋白來源優(yōu)選是人起源的，并可以是任何免疫球蛋白，但I(xiàn)gG1和IgG2是優(yōu)選的。天然Fc分子由可以通過共價(jià)(即，二硫鍵)和非共價(jià)締合連接成二聚體或多聚體形式的單體多肽組成。在天然Fc分子的單體亞基之間的分子間二硫鍵的數(shù)量范圍是從1至4個(gè)，取決于類型(例如，IgG、IgA和IgE)或亞類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)。天然Fc的一個(gè)例子是以二硫鍵連接的二聚體，其獲得自IgG的木瓜蛋白酶消化(參見Ellison等人,1982,Nucleic Acids Res.10:4071-9)。用于本文中的術(shù)語“天然Fc”一般是單體、二聚體和多聚體形式。術(shù)語“Fc變體”指由天然Fc修飾而來，但仍然包含補(bǔ)救受體FcRn(新生兒Fc受體)的結(jié)合位點(diǎn)的分子或序列。國際公開號(hào)WO 97/34631和WO 96/32478描述了示例性的Fc變體，以及與補(bǔ)救受體的相互作用，并通過引用整合到本文中。因此，術(shù)語“Fc變體”可包含從非人的天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以去除的區(qū)域，因?yàn)檫@些區(qū)域提供了本發(fā)明的蛋白質(zhì)融合分子不需要的結(jié)構(gòu)特征或生物學(xué)活性。因此，術(shù)語“Fc變體”包含這樣的分子或序列，所述分子或序列缺少一個(gè)或多個(gè)天然Fc位點(diǎn)或殘基，或者其中的一個(gè)或多個(gè)天然Fc位點(diǎn)或殘基已被修飾，所述位點(diǎn)或殘基影響或參與：(1)二硫鍵形成，(2)與選擇的宿主細(xì)胞的不相容性，(3)在選擇的宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)N-末端異質(zhì)性，(4)糖基化作用，(5)與補(bǔ)體的相互作用，(6)與補(bǔ)救受體以外的Fc受體結(jié)合，或(7)抗體依賴性的細(xì)胞毒性(ADCC)。下文進(jìn)一步詳細(xì)描述了Fc變體。

術(shù)語“Fc結(jié)構(gòu)域”涵蓋了天然Fc和Fc變體和上述序列。對(duì)于Fc變體和天然Fc分子，術(shù)語“Fc結(jié)構(gòu)域”包括單體或多聚體形式的分子，不論是從完整抗體消化獲得的，或者通過其他手段生產(chǎn)的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域可以通過例如，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域和FGF21序列之間的共價(jià)鍵，與FGF21或FGF21突變體(包括FGF21或FGF21突變體的截短的形式)融合。這類融合蛋白可以通過Fc結(jié)構(gòu)域的締合形成多聚體，并且這些融合蛋白及其多聚體也是本發(fā)明的一個(gè)方面。

如本文中使用的，術(shù)語“fusobody”指包含2個(gè)異源二聚體的抗體樣可溶性蛋白質(zhì)，每個(gè)異源二聚體都由1條氨基酸重鏈和1條氨基酸輕鏈組成，通過例如一個(gè)或多個(gè)二硫鍵彼此穩(wěn)定地締合在一起。每條重鏈或輕鏈包含抗體的恒定區(qū)，在下文中分別被稱為fusobody的重鏈和輕鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)至少包含抗體的C_H1區(qū)，還可包含C_H2和C_H3區(qū)，包括鉸鏈區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含抗體的C_L區(qū)。在fusobody中，抗體的可變區(qū)被異源的可溶性結(jié)合結(jié)構(gòu)域取代。作為非限制性例子，本發(fā)明的fusobody可包含本發(fā)明的雙功能融合蛋白，其中GLP-1受體激動(dòng)劑與抗體的重鏈和輕鏈的N-末端融合，并且FGF21同時(shí)與同一抗體的重鏈和輕鏈的C-末端融合。

術(shù)語“異源”意指這些結(jié)構(gòu)域不是天然發(fā)現(xiàn)與抗體恒定區(qū)締合的。特別的是，這類異源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域不具有由4個(gè)框架區(qū)FR1、FR2、FR3和FR4，和之間的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)組成的抗體可變結(jié)構(gòu)域的典型結(jié)構(gòu)。因此，fusobody的每個(gè)臂包含第一單鏈多肽和第二單鏈多肽，所述第一單鏈多肽包含共價(jià)連接在抗體的恒定C_H1重鏈區(qū)的N-末端部分上的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而所述第二單鏈多肽包含共價(jià)連接在抗體的恒定C_L輕鏈區(qū)的N-末端部分上的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域。共價(jià)連接可以是直接的，例如通過肽鍵，或者可以是間接的，通過接頭，例如肽接頭。fusobody的2個(gè)異源二聚體是共價(jià)連接的，例如通過其鉸鏈區(qū)處的至少一個(gè)二硫鍵，類似抗體結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了具有fusobody結(jié)構(gòu)的分子實(shí)例，特別是包含異源二聚體受體的配體結(jié)合區(qū)的fusobody(參見例如，國際專利公開號(hào)WO01/46261和WO11/076781)。

術(shù)語“聚乙二醇”或“PEG”指聚烷撐二醇化合物或其衍生物，有或無偶聯(lián)劑或者由偶聯(lián)或激活部分衍生。

術(shù)語“艾塞那肽”表示毒蜥外泌肽-4的合成形態(tài)，作為Byetta和Bydureon銷售的艾塞那肽是2005年4月批準(zhǔn)的胰高血糖素樣肽-1激動(dòng)劑(GLP-1激動(dòng)劑)藥物，用于治療2型糖尿病。它屬于腸降血糖素模擬物，由Amylin Pharmaceuticals生產(chǎn)。

毒蜥外泌肽-4是在毒蜥蜥蜴(Gila Monster)唾液腺中生產(chǎn)的39個(gè)殘基的多肽(Goke等人(1993)Diabetes 46:433-439；Fehmann等人(1995)Endocrine Rev.16:390-410)。雖然它是一種獨(dú)特的非哺乳動(dòng)物基因的產(chǎn)物，并且似乎僅由唾液腺表達(dá)，但是毒蜥外泌肽-4與GLP-1享有52％氨基酸序列同源性，且在哺乳動(dòng)物中與GLP-1受體相互作用(Goke等人；Thorens等人(1993)Diabetes 42:1678-1682)。

術(shù)語“FGF21-相關(guān)病癥”、“GLP-1-相關(guān)病癥”、“毒蜥外泌肽-4-相關(guān)病癥”和本文類似使用的術(shù)語包括了肥胖、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非醇型脂肪肝病(NAFLD)、非醇型脂肪性肝炎(NASH)、胰島素耐受、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖、代謝綜合征、急性心肌梗塞、高血壓、心血管病、動(dòng)脈粥樣硬化、外周動(dòng)脈病、中風(fēng)、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病并發(fā)癥、神經(jīng)病、胃輕癱、與胰島素受體的嚴(yán)重失活突變相關(guān)的病癥、包括HIV相關(guān)性脂肪營養(yǎng)不良在內(nèi)的脂肪營養(yǎng)不良和其他的代謝病癥。

術(shù)語“與胰島素受體中的嚴(yán)重失活性突變相關(guān)的病癥”和本文類似使用的術(shù)語描述了患有胰島素受體(或其直接下游的可能的蛋白質(zhì))突變的對(duì)象中的病況，所述突變導(dǎo)致了嚴(yán)重的胰島素耐受，但通常(并非一直)沒有2型糖尿病中常見的肥胖。在許多方面，患有這些病況的對(duì)象表現(xiàn)出1型糖尿病和2型糖尿病的雜合癥狀。因而受累對(duì)象按基本遞增的嚴(yán)重程度分為若干類別，包括：A型糖尿病抗性、C型胰島素抗性(AKA HAIR-AN綜合征)、Rabson-Mendenhall綜合征，最后是Donohue氏綜合征或矮怪病(Leprechaunism)。這些病癥與非常高的內(nèi)源性胰島素水平相關(guān)，和非常常見的與高血糖相關(guān)。因而受累對(duì)象還存在多種與“胰島素毒性”相關(guān)的臨床特征，包括雄激素過多、多囊卵巢綜合征(PCOS)、多毛癥和在皮膚褶皺中的黑棘皮病(過度的生長和色素沉積)。

“包括HIV相關(guān)性脂肪營養(yǎng)不良的脂肪營養(yǎng)不良”，是脂肪組織的病癥，其特征是選擇性的丟失體脂。脂肪營養(yǎng)不良的患者具有出現(xiàn)胰島素抗性、高胰島素血癥、高血糖、高甘油三酯血癥和脂肪肝的傾向。存在多種形式的先天性(遺傳的)或獲得性的脂肪營養(yǎng)不良。遺傳形式的脂肪營養(yǎng)不良包括先天性全身脂肪營養(yǎng)不良(Berardinelli-Seip綜合征)和若干種類型的家族性部分脂肪營養(yǎng)不良(Dunnigan型、Kobberling型、下頜骨末端發(fā)育不良型)。獲得性形式的脂肪營養(yǎng)不良包括獲得性全身脂肪營養(yǎng)不良(Lawrence綜合征)、獲得性部分脂肪營養(yǎng)不良(Barraquer-Simons綜合征)，和由用于治療HIV的蛋白酶抑制劑和核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑導(dǎo)致的脂肪營養(yǎng)不良。

“2型糖尿病”是這樣的病況，其特征是無視胰島素的可利用度的葡萄糖過度生產(chǎn)，并且由于不充分的葡萄糖清除導(dǎo)致循環(huán)葡萄糖水平仍然非常高。

“1型糖尿病”是這樣的病況，其特征是由總體缺少的胰島素導(dǎo)致的高血糖水平。是當(dāng)身體的免疫系統(tǒng)攻擊胰腺中的胰島素生產(chǎn)β細(xì)胞并破壞這些細(xì)胞時(shí)發(fā)生的。于是胰腺生產(chǎn)很少或不生產(chǎn)胰島素。

“葡萄糖不耐受”或受損的糖耐受(IGT)是血糖代謝障礙的前糖尿病狀態(tài)，與增加的心血管病理風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。前糖尿病病況阻止對(duì)象將葡萄糖有效率地移入細(xì)胞并利用葡萄糖作為有效率的燃料來源，導(dǎo)致血液中升高的葡萄糖水平和一定程度的胰島素耐受。

“高血糖癥”定義為血液中過多的糖(葡萄糖)。

“低血糖癥”也被稱為低血糖，當(dāng)血糖水平降至太低而不能提供身體活動(dòng)足夠的能源時(shí)發(fā)生。

“高胰島素血癥”定義為血液中高于正常水平的胰島素。

“胰島素耐受”定義為這樣的狀態(tài)，其中，正常量的胰島素產(chǎn)生了低于正常的生物學(xué)應(yīng)答。

“肥胖”就人類對(duì)象而言，可定義為體重比給定群體的理想體重高出20％(R.H.Williams,Textbook of Endocrinology,1974,904-916頁)。

“糖尿病并發(fā)癥”是由高血糖水平和其他的身體功能(如腎、神經(jīng)(神經(jīng)病)、足(足部潰瘍和循環(huán)低下)和眼(例如，視網(wǎng)膜病))導(dǎo)致的問題。糖尿病還增加心臟病和骨和關(guān)節(jié)病癥的風(fēng)險(xiǎn)。糖尿病的其他長期并發(fā)癥包括皮膚問題、消化問題、性功能障礙和牙齒與牙齦的問題。

“代謝綜合征”可定義為下列信號(hào)中的至少3個(gè)的群：腹部肥胖--大部分男性中，40英寸腰或更粗；高血糖--空腹后至少110毫克/分升(mg/dl)；高甘油三酯--血流中至少150mg/dL；低HDL--少于40mg/dl；130/85mmHg或更高的血壓。

“胰腺炎”是胰腺的炎癥。

“血脂異?！笔侵鞍状x的病癥，包括脂蛋白過度生產(chǎn)或缺陷。血脂異常可以表現(xiàn)為血液中的總膽固醇、低密度脂蛋白(LDL)膽固醇和甘油三酯濃度的升高，和高密度脂蛋白(HDL)膽固醇濃度的減少。

“非醇型脂肪肝病(NAFLD)”是與醇消耗無關(guān)的肝病，其特征是肝細(xì)胞的脂肪改變。

“非醇型脂肪性肝炎(NASH)”是與醇消耗無關(guān)的肝病，其特征是肝細(xì)胞的脂肪改變，伴隨小葉內(nèi)炎癥和纖維化。

“高血壓”或高血液壓力是全身動(dòng)脈血壓暫時(shí)或持續(xù)升高至可能導(dǎo)致心血管損害或其他不利結(jié)果的水平。高血壓可人為定義為高于140mmHg的收縮壓或高于90mmHg的舒張壓。

“心血管疾病”是涉及心臟或血管的疾病。

“急性心肌梗塞”當(dāng)在對(duì)部分心臟的血液供應(yīng)中斷時(shí)發(fā)生。如果在足夠長的時(shí)間內(nèi)沒有治療所導(dǎo)致的缺血和缺氧，可以導(dǎo)致心臟肌肉組織(心肌)的損害或死亡(梗塞)。

“外周動(dòng)脈病”當(dāng)在將血液攜帶給頭部、內(nèi)臟或四肢的動(dòng)脈中斑塊增多時(shí)發(fā)生。斑塊可以隨時(shí)間變硬，使動(dòng)脈變窄，這限制富氧血流向器官和身體的其他部分。

“動(dòng)脈粥樣硬化”是血管病，其特征是在大型和中型動(dòng)脈的內(nèi)膜上不規(guī)則分布的脂類沉積物，導(dǎo)致動(dòng)脈管腔變窄，并最終發(fā)展為纖維化和鈣化。病損通常是病灶性的，并緩慢且間歇地發(fā)展。血流受限是大部分臨床表現(xiàn)的原因，但臨床表現(xiàn)隨病損的分布和嚴(yán)重程度改變。

“中風(fēng)”是與持續(xù)超過24小時(shí)的腦循環(huán)損傷相關(guān)的任何急性臨床事件。中風(fēng)涉及不可逆的腦損害，癥狀的類型和嚴(yán)重程度取決于循環(huán)已經(jīng)受損的腦組織的位置和范圍。

“心力衰竭”，也被稱為阻塞性心力衰竭，是心臟不再泵送充足的血液至身體其余部分的病癥。

“冠心病”，也被稱為冠狀動(dòng)脈病，是為心臟供應(yīng)血液和氧氣的小血管變窄。

“腎臟病”或腎病是腎臟的任何疾病。糖尿病性腎病是1型或2型糖尿病人的發(fā)病率和死亡率的主要原因。

“神經(jīng)病”是任何涉及腦神經(jīng)或外周或自主神經(jīng)系統(tǒng)的疾病。

“胃輕癱”是胃蠕動(dòng)減弱，導(dǎo)致延遲的腸排空。

“點(diǎn)擊化學(xué)(Click chemistry)”是由K.B.Sharpless在2001年引入的術(shù)語，描述了高產(chǎn)率、范圍廣、僅產(chǎn)生可以不用色譜去除的副產(chǎn)物的反應(yīng)，所述反應(yīng)是立體異構(gòu)特異性的、易于實(shí)施，且可以在易于去除的或良性溶劑中進(jìn)行。

本發(fā)明涵蓋的危重患者一般經(jīng)歷著不穩(wěn)定的高代謝狀態(tài)。該不穩(wěn)定的代謝狀態(tài)是由于底物代謝改變?cè)斐傻?，這可導(dǎo)致一些營養(yǎng)物的相對(duì)缺乏。一般而言，脂肪和肌肉都存在增加的氧化作用。

此外，危重患者優(yōu)選是經(jīng)歷全身性炎性應(yīng)答綜合征或呼吸窘迫的患者。發(fā)病率降低意指危重患者出現(xiàn)其他疾病、病況或癥狀的可能性降低，或者其他疾病、病況或癥狀的嚴(yán)重程度降低。例如，降低的發(fā)病率可對(duì)應(yīng)于減少的細(xì)菌血癥或敗血癥或與多器官衰竭相關(guān)的并發(fā)癥發(fā)生。

如本文使用的，除非上下文中另外明確指出，否則單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括了復(fù)數(shù)的指代。因此，例如，“抗體”的稱呼包括了兩個(gè)或多個(gè)這類抗體的混合物。

如本文使用的，術(shù)語“約”指數(shù)值的+/-20％，更優(yōu)選+/-10％，或仍然更優(yōu)選+/-5％。

術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”是可互換使用的，指任何長度的氨基酸的聚合形式，可以包括編碼和非編碼的氨基酸、天然和非天然存在的氨基酸、化學(xué)或生物化學(xué)修飾的或衍生的氨基酸，和具有修飾的肽骨架的多肽。術(shù)語包括融合蛋白，包括但不限于具有異源氨基酸序列的融合蛋白、具有異源和同源前導(dǎo)序列的融合物、有或無N-末端甲硫氨酸殘基；免疫標(biāo)記的蛋白質(zhì)等。

術(shù)語“個(gè)體”、“對(duì)象”、“宿主”和“患者”可互換的使用，指任何需要診斷、治療或療法的對(duì)象，特別是人。其他對(duì)象可包括牛、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬等。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)象是人。

如本文使用的，術(shù)語“樣品”指來自患者的生物學(xué)材料。本發(fā)明測定的樣品不限于任何特定的類型。作為非限制性的例子，樣品包括單細(xì)胞、多細(xì)胞、組織、腫瘤、生物體液、生物分子，或任何上述材料的上清液或提取物。例子包括從活組織檢查移出的組織、在切除中移出的組織、血液、尿液、淋巴組織、淋巴液、腦脊液、粘液和糞便樣品。使用的樣品一般根據(jù)測定模式、檢測方法和待測定的腫瘤、組織、細(xì)胞或提取物的性質(zhì)而改變。用于制備樣品的方法是本領(lǐng)域普遍已知的，可以方便地調(diào)整從而獲得與所用方法相容的樣品。

如本文使用的，術(shù)語“生物學(xué)分子”包括但不限于多肽、核酸和糖類。

如本文使用的，術(shù)語“調(diào)節(jié)”指基因、蛋白質(zhì)或位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)、外側(cè)或表面上的任何分子的質(zhì)量或數(shù)量的改變。改變可以是分子的表達(dá)或水平的增加或減少。術(shù)語“調(diào)節(jié)”還包括改變生物學(xué)功能/活性的質(zhì)量或數(shù)量，所述生物學(xué)功能/活性包括但不限于降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；降低肝臟的脂類或肝臟甘油三酯的水平；減少體重；改善糖耐受、能量消耗或胰島素敏感性的能力。

如本文使用的，術(shù)語“調(diào)節(jié)劑”指調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)與FGF21相關(guān)性疾病(如1型或2型糖尿病或代謝病況(如肥胖))相關(guān)的生理學(xué)或生物化學(xué)事件的組合物。所述事件包括但不限于降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；降低肝臟的脂類或肝臟甘油三酯的水平；減少體重；改善糖耐受、能量消耗或胰島素敏感性的能力。

“基因產(chǎn)物”是由基因表達(dá)或產(chǎn)生的生物聚合產(chǎn)物?；虍a(chǎn)物可以是例如未剪切的RNA、mRNA、mRNA剪切變體、多肽、翻譯后修飾的多肽、剪切變體多肽等。該術(shù)語還涵蓋了使用RNA基因產(chǎn)物作為模板生產(chǎn)的生物聚合產(chǎn)物(即，RNA的cDNA)?；虍a(chǎn)物可以酶促的、重組的、化學(xué)的生產(chǎn)，或者在對(duì)該基因而言是天然的細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)。在一些實(shí)施方案中，如果基因產(chǎn)物是蛋白質(zhì)性質(zhì)的，則其表現(xiàn)出生物學(xué)活性。在一些實(shí)施方案中，如果基因產(chǎn)物是核酸，則其可翻譯成表現(xiàn)出生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)性質(zhì)的基因產(chǎn)物。

如本文使用的，“調(diào)節(jié)FGF21活性”、“調(diào)節(jié)GLP-1活性”和“調(diào)節(jié)毒蜥外泌肽-4活性”分別指FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4活性的增加或減少，其可以是例如活性劑與FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4多核苷酸或多肽相互作用、抑制FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4轉(zhuǎn)錄和/或翻譯(例如，通過與FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4基因，或與FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4轉(zhuǎn)錄物的反義或siRNA相互作用，通過調(diào)節(jié)促進(jìn)FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子)等的結(jié)果。例如，調(diào)節(jié)生物學(xué)活性指生物學(xué)活性的增加或減少?？梢酝ㄟ^以下手段評(píng)估FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4活性，包括但不限于測定對(duì)象的血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平，評(píng)估FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4多肽水平，或通過評(píng)估FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4轉(zhuǎn)錄水平。

還可以通過例如測量FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4下游生物標(biāo)志物的水平，和測量FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4信號(hào)傳遞的增加，實(shí)現(xiàn)FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4活性的比較。還可以通過測量：細(xì)胞信號(hào)傳遞；激酶活性；脂肪細(xì)胞中攝入的葡萄糖；血液胰島素、甘油三酯或膽固醇水平的波動(dòng)；肝臟脂類或甘油三酯水平的改變；FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4與受體之間的相互作用；或FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4受體的磷酸化，來評(píng)估FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4活性。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)GF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4受體的磷酸化可以是酪氨酸磷酸化。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4活性可以導(dǎo)致調(diào)節(jié)FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4-相關(guān)的表型。

如本文使用的，“FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4下游生物標(biāo)志物”是基因或基因產(chǎn)物，或基因或基因產(chǎn)物的可測量標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，是FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4的下游標(biāo)志物的基因或活性表現(xiàn)出改變的表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，在存在FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4調(diào)節(jié)劑的條件下，下游標(biāo)志物的活性是改變的。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)干擾FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4信號(hào)傳遞時(shí)，下游標(biāo)志物表現(xiàn)出改變的表達(dá)水平。例如，F(xiàn)GF21下游標(biāo)志物包括但不限于葡萄糖或2-脫氧葡萄糖攝取、pERK和其他磷酸化或乙?；牡鞍踪|(zhì)或NAD水平。

如本文使用的，術(shù)語“上調(diào)”指活性或數(shù)量的增加、激活或刺激。例如，F(xiàn)GF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4調(diào)節(jié)劑(如本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì))可以增加或激動(dòng)FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4受體的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)答于本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)，F(xiàn)GFR-1(IIIc)、FGFR-2(IIIc)或FGFR-3(IIIc)和/或β-klotho中的一個(gè)或多個(gè)可上調(diào)。上調(diào)還可以指FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4-相關(guān)的活性，例如降低血糖、胰島素、甘油三酯或膽固醇水平；降低肝臟的脂類或甘油三酯水平；減少體重；或改善糖耐受、能量消耗或胰島素敏感性；或?qū)е翭GF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4受體磷酸化；或增加FGF21、GLP-1或毒蜥外泌肽-4下游標(biāo)志物的能力。例如，F(xiàn)GFR21受體可以是FGFR-1(IIIc),FGFR-2(IIIc)或FGFR-3(IIIc)和/或β-klotho中的一個(gè)或多個(gè)。相比對(duì)照，上調(diào)的范圍可以是從25％至500％的任何。

如本文使用的，術(shù)語“N-末端”指蛋白質(zhì)的至少前20個(gè)氨基酸。

如本文使用的，術(shù)語“N-末端結(jié)構(gòu)域”和“N-末端區(qū)”可互換的使用，指從蛋白質(zhì)的第一個(gè)氨基酸處開始并在蛋白質(zhì)N-末端一半的任一氨基酸處結(jié)束的蛋白質(zhì)片段。例如，F(xiàn)GF21的N-末端結(jié)構(gòu)域是從SEQ ID NO:1的第一位氨基酸至SEQ ID NO:1的第10和105位氨基酸之間的任一氨基酸。

如本文使用的，術(shù)語“C-末端”指蛋白質(zhì)的至少最后20個(gè)氨基酸。

如本文使用的，術(shù)語“C-末端結(jié)構(gòu)域”和“C-末端區(qū)”可互換的使用，指從蛋白質(zhì)C-末端一半的任一氨基酸處開始并在蛋白質(zhì)的最后一個(gè)氨基酸處結(jié)束的蛋白質(zhì)片段。例如，F(xiàn)GF21的C-末端結(jié)構(gòu)域在從SEQ ID NO:1的第105和200位氨基酸之間的任一氨基酸處開始并在SEQ ID NO:1的第209位氨基酸處結(jié)束。

術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”在本文中指對(duì)生物分子的已知功能或疑似功能有貢獻(xiàn)的生物分子的結(jié)構(gòu)部分。結(jié)構(gòu)域可以擴(kuò)及區(qū)域或其部分，還可以并入全部或部分所述區(qū)域以外，不同于特定區(qū)域的生物分子的部分。

如本文使用的，術(shù)語“信號(hào)結(jié)構(gòu)域”(也被稱為“信號(hào)序列”或“信號(hào)肽”)指位于前體蛋白質(zhì)(通常是膜結(jié)合的或分泌的蛋白質(zhì))的N-末端區(qū)的氨基酸序列的連續(xù)片段中的肽結(jié)構(gòu)域，并參與翻譯后蛋白質(zhì)運(yùn)輸。在許多情況下，在完成分選過程后，通過專門的信號(hào)肽酶，從全長蛋白質(zhì)中去除信號(hào)結(jié)構(gòu)域。每個(gè)信號(hào)結(jié)構(gòu)域指明了前體蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的特定目的地。FGF21的信號(hào)結(jié)構(gòu)域是SEQ ID NO:1的第1-28位氨基酸。

如本文使用的，術(shù)語“受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指與膜結(jié)合型受體蛋白質(zhì)接觸的蛋白質(zhì)的任何部分或區(qū)域，導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)答，如信號(hào)傳遞事件。

如本文使用的，術(shù)語“配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域”指本發(fā)明的融合蛋白的任何部分或區(qū)域，所述部分或區(qū)域保留了相應(yīng)天然序列的至少一個(gè)定性的結(jié)合活性。

術(shù)語“區(qū)域”指生物分子的初級(jí)結(jié)構(gòu)的物理上連續(xù)的部分。在蛋白質(zhì)的情況下，區(qū)域定義為該蛋白質(zhì)的氨基酸序列的連續(xù)部分。在一些實(shí)施方案中，“區(qū)域”與生物分子的功能相關(guān)。

術(shù)語“片段”在本文中指生物分子的初級(jí)結(jié)構(gòu)的物理上連續(xù)的部分。在蛋白質(zhì)的情況下，部分定義為該蛋白質(zhì)的氨基酸序列的連續(xù)部分并且指至少3-5個(gè)氨基酸，至少8-10個(gè)氨基酸，至少11-15個(gè)氨基酸，至少17-24個(gè)氨基酸，至少25-30個(gè)氨基酸，和至少30-45個(gè)氨基酸。在寡核苷酸的情況下，部分定義為該寡核苷酸的核酸序列的連續(xù)部分并且指至少9-15個(gè)核苷酸，至少18-30個(gè)核苷酸，至少33-45個(gè)核苷酸，至少48-72個(gè)核苷酸，至少75-90個(gè)核苷酸，和至少90-130個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，生物分子的部分具有生物學(xué)活性。在本發(fā)明的上下文中，F(xiàn)GF21多肽片段不包含SEQ ID NO:1中所述的整個(gè)FGF21多肽序列。

“天然序列”多肽是具有與自然界來源的多肽相同的氨基酸序列的多肽。這類天然序列多肽可以從自然界分離，或者可以通過重組或合成的手段生產(chǎn)。因此，天然序列多肽可以具有天然存在的人多肽、鼠多肽或來自任何其他哺乳動(dòng)物物種的多肽的氨基酸序列。

如本文使用的，詞組“同源核苷酸序列”或“同源氨基酸序列”或其變化形式，指由至少指明的百分比的核苷酸水平或氨基酸水平的同源性表征的序列，并與“序列同一性”可互換的使用。同源核苷酸序列包括那些編碼蛋白質(zhì)同種型的序列。作為例如RNA的可變剪切的結(jié)果，這類同種型可以在同一生物體的不同組織中表達(dá)。可選的，同種型可以由不同的基因編碼。同源核苷酸序列包括編碼人以外的物種(包括，但不限于哺乳動(dòng)物)的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。同源核苷酸序列還包括但不限于本文所示出的核苷酸序列的天然存在的等位改變和突變。同源氨基酸序列包括含有保守性氨基酸取代并且所述多肽具有相同的結(jié)合和/或活性的那些氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，如果與對(duì)比序列具有至少60％或更大的，最多99％的同一性，則核苷酸或氨基酸序列是同源的。在一些實(shí)施方案中，如果與對(duì)比序列享有一個(gè)或多個(gè)，最多60個(gè)核苷酸/氨基酸取代、添加或缺失，核苷酸或氨基酸序列是同源的。在一些實(shí)施方案中，同源氨基酸序列具有不超過5個(gè)或不超過3個(gè)保守的氨基酸取代。

可以通過例如Gap程序(Wisconsin序列Analysis Package,Version 8for UNIX,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison WI)和使用默認(rèn)設(shè)置，來確定百分比同源性或同一性，該程序使用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.,1981,2,482-489)。在一些實(shí)施方案中，探針和靶之間的同源性在約75％至約85％之間。在一些實(shí)施方案中，核酸具有與SEQ ID NO:2或其部分至少約95％，約97％，約98％，約99％和約100％同源的核苷酸。

同源性還可以在多肽水平。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)的構(gòu)件多肽可以與其全長野生型對(duì)應(yīng)物或相應(yīng)的天然序列、或其部分至少95％同源。本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)或其部分和不同氨基酸序列的同一性程度或百分比計(jì)算為兩條序列比對(duì)中準(zhǔn)確匹配的數(shù)量除以“本發(fā)明序列”或“外源序列”的最短長度。結(jié)果表示為百分比同一性。

如本文使用的，術(shù)語“混合”指在相同區(qū)域中組合一個(gè)或多個(gè)化合物、細(xì)胞、分子等在一起的過程。這可以在例如允許一個(gè)或多個(gè)化合物、細(xì)胞、分子混合的試管、培養(yǎng)皿或任何容器中實(shí)施。

如本文使用的，術(shù)語“基本純化的”指從其天然環(huán)境中移出且不含至少60％，至少75％，和至少90％的與其天然相關(guān)的其他組分的化合物(例如，多核苷酸或多肽或抗體)。

術(shù)語“可藥用的運(yùn)載體”指用于施用治療劑，如抗體或多肽、基因和其他治療劑的運(yùn)載體。術(shù)語指任何本身不導(dǎo)致產(chǎn)生對(duì)接受組合物的個(gè)體有害的抗體的藥學(xué)運(yùn)載體，且可以施用而沒有不過度的毒性。合適的載體可以是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、多聚乳酸、多聚甘油酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物、脂類聚集物和失活的病毒顆粒。這類運(yùn)載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍已知的。治療組合物中的可藥用的運(yùn)載體可包括液體，如水、生理鹽水、甘油和乙醇。這類運(yùn)載體中也可以存在輔助物質(zhì)，如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。

由半胱氨酸殘基提供的天然存在的二硫鍵一般地增加了蛋白質(zhì)的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。按融解溫度增加測量的，增加的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性的成功例子是酶T4溶菌酶(Matsumura等人，PNAS 86:6562-6566(1989))和芽孢桿菌RNA酶(barnase)(Johnson等人,J.Mol.Biol.268:198-208(1997))的多個(gè)二硫鍵突變體。本發(fā)明的一個(gè)方面是在存在防腐劑的條件下FGF21的增強(qiáng)的物理穩(wěn)定性，這是由變體中存在的二硫鍵實(shí)現(xiàn)的，所述二硫鍵限制了野生型FGF21的靈活性從而限制了防腐劑接近蛋白質(zhì)的疏水核心。由于變體中存在的二硫鍵的本發(fā)明蛋白質(zhì)的FGF21的物理穩(wěn)定性的增強(qiáng)，可以賦予所述蛋白質(zhì)額外的保護(hù)作用，不論是否存在防腐劑，包括但不限于保護(hù)其免受環(huán)境條件的波動(dòng)，如pH和溫度。

本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)相對(duì)于野生型蛋白質(zhì)比較物及其組合的改善

本領(lǐng)域普遍已知，研發(fā)蛋白質(zhì)藥物的重要挑戰(zhàn)是處理蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)不穩(wěn)定性。當(dāng)預(yù)計(jì)將蛋白質(zhì)藥物制劑用于多種用途時(shí)，該挑戰(zhàn)甚至更明顯，可注射制劑需要穩(wěn)定的、濃縮的和保藏的溶液，同時(shí)保持有利的生物活性譜。文獻(xiàn)中的野生型FGF21的生物物理特征確立了當(dāng)濃縮的蛋白質(zhì)溶液(>5mg/ml)暴露于脅迫條件(如高溫或低pH)時(shí)，導(dǎo)致加快的締合和聚集(即，低下的物理穩(wěn)定性和生物制藥特性)。FGF21的濃縮蛋白質(zhì)溶液暴露于制藥防腐劑(例如，間甲酚)也對(duì)物理穩(wěn)定性具有負(fù)面影響。

因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是在生理學(xué)和防腐制劑條件下，增強(qiáng)濃縮溶液的物理穩(wěn)定性，同時(shí)維持化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)效價(jià)。認(rèn)為締合和聚集可能是由疏水性相互作用導(dǎo)致的，因?yàn)樵诮o定的蛋白質(zhì)濃度，溫度和離子強(qiáng)度對(duì)物理穩(wěn)定性具有可觀的影響。

就大部分情況而言，靶向非保守的、假定的表面暴露的氨基酸殘基。分析這些殘基的局部環(huán)境，并選擇在結(jié)構(gòu)上被視為不重要的那些進(jìn)行誘變。一種開始特異性改變的方法是通過導(dǎo)入谷氨酸殘基進(jìn)一步降低蛋白質(zhì)的pI(“谷氨酸掃描”)。帶電的取代基的導(dǎo)入可以通過電荷-電荷排斥作用抑制疏水介導(dǎo)的聚集，并潛在的改善防腐劑相容性。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到，在充分誘變的條件下，通過導(dǎo)入正電荷，有或沒有同時(shí)減少負(fù)電荷，可以將pI改變到堿性pH范圍內(nèi)，從而允許電荷-電荷排斥作用。

與野生型FGF21作為生物治療劑的治療性應(yīng)用相關(guān)的其他困難是例如其體內(nèi)半壽期非常短(在小鼠和靈長類中，分別在0.5和2h的量級(jí))。因此需要研發(fā)通過更高效價(jià)或更長半壽期而更有效的后續(xù)化合物。類似的，通過使用毒蜥外泌肽-4或抵抗DPP4切割的其他類似物，以及用于延長化合物的半壽期或減慢化合物釋放的其他修飾和制劑，已應(yīng)用了多種機(jī)制來增強(qiáng)GLP-1的血清半壽期(1-2分鐘，由于內(nèi)源性蛋白酶，特別是二肽肽酶-4(DPP4)的快速切割)。

作為這樣的方式研發(fā)本發(fā)明的蛋白質(zhì)，例如本發(fā)明的雙重FGF21受體激動(dòng)劑和GLP-1受體激動(dòng)劑蛋白質(zhì)，所述方式以更高的效價(jià)和半壽期延長的制劑實(shí)現(xiàn)FGF21和GLP-1治療的理想效果。文獻(xiàn)中，例如在專利公開WO2010/068735和WO2009/020802中已描述了共同施用GLP-1和FGF21，數(shù)據(jù)提示了共同施用GLP-1和FGF21用于治療肥胖和2型糖尿病的累加或協(xié)同效應(yīng)。然而，兩種受體激動(dòng)劑在單個(gè)分子中的共定位，例如以本發(fā)明蛋白質(zhì)的形式，讓GLP-1和FGF21更好地接近組織或細(xì)胞，并提供了與作為單獨(dú)的實(shí)體簡單共同施用相比增加的好處。將兩種激動(dòng)劑組合成單個(gè)分子比簡單共同施用每種激動(dòng)劑的這一優(yōu)點(diǎn)尤其有利于在同一組織中GLP-1和FGF21受體都表達(dá)的組織，如脂肪組織、胰腺β-細(xì)胞、肝細(xì)胞和下丘腦細(xì)胞。由于改變的受體運(yùn)輸、改變的信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)和/或熵(親合力)效應(yīng)，本發(fā)明的雙重FGF21受體激動(dòng)劑和GLP-1受體激動(dòng)劑蛋白質(zhì)和其他單個(gè)的雙活性實(shí)體具有改善的生物學(xué)特性。

因?yàn)镕GF21和GLP-1(或毒蜥外泌肽-4)通過不同的機(jī)制發(fā)揮作用，因此預(yù)期當(dāng)以例如本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)的形式同時(shí)施用時(shí)，其具有累加或協(xié)同效應(yīng)。GLP-1和毒蜥外泌肽-4主要作用于增加響應(yīng)食物攝入的胰島素分泌，同時(shí)FGF21使身體敏化以更好應(yīng)答胰島素，可以為1型和2型糖尿病提供管理血糖水平的益處。與改善的β細(xì)胞功能和胰島素靈敏度組合的β細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)即使在1型糖尿病中也有提供益處的潛力。

另一個(gè)例子是體重丟失：預(yù)期通過GLP-1或毒蜥外泌肽-4的飽食信號(hào)和減慢的胃排空將減少胃口，同時(shí)FGF21增加了脂肪組織和其他組織中的代謝，這可以增加脂肪丟失。使用組合給藥，這兩個(gè)效應(yīng)可以導(dǎo)致累加的、或者甚至協(xié)同的體重丟失。在代謝活躍的組織中FGF21和GLP-1的受體的表達(dá)提示了向這類組織同時(shí)遞送FGF21受體激動(dòng)劑和GLP-1受體激動(dòng)劑對(duì)治療代謝疾病是有益的。GLP-1和毒蜥外泌肽-4的心臟保護(hù)效應(yīng)和用FGF21可見的改善的脂類譜的組合也可以在與肥胖、2型和1型糖尿病相關(guān)的心血管疾病中導(dǎo)致累加益處。

GLP-1和FGF21雙重激動(dòng)作用的另一個(gè)可能的益處是改善的，即，降低的負(fù)面效應(yīng)譜。近期的研究(Wei等人(2012)PNAS 109,3143-48)表示，用FGF21治療膳食誘導(dǎo)的肥胖小鼠導(dǎo)致了由于減退的PPARγ失活的骨丟失(通過降低的SUMO化作用)；在FGF21治療后，在骨中存在增加的PPARγ活性的條件下，可觀察到充質(zhì)干細(xì)胞從向成骨細(xì)胞分化轉(zhuǎn)變?yōu)橄蛑炯?xì)胞分化。然而，還已經(jīng)報(bào)道了(Sanz等人(2010)Am J Physiol Endocrinol Metab 298,E634-E643)GLP-1可以通過降低PPARγ的表達(dá)，降低人充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。因此，GLP-1具有骨保護(hù)性的潛力，GLP-1-FGF21融合蛋白可能比僅用FGF21治療降低骨丟失的風(fēng)險(xiǎn)。

雖然本發(fā)明的實(shí)施方案涉及在生理學(xué)和保藏的藥物制劑條件下的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，保持本發(fā)明的蛋白質(zhì)與例如野生型FGF21相比的生物學(xué)效價(jià)也是重要的考慮因素。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物學(xué)效價(jià)由蛋白質(zhì)影響葡萄糖攝取和/或降低血漿葡萄糖水平的能力定義，如本文實(shí)施例中所示。

可以通過本領(lǐng)域已知的任何手段生成和/或分離根據(jù)本發(fā)明施用的本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽。用于生產(chǎn)變體的最優(yōu)選的方法是通過重組DNA方法，且是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知的。這類方法描述在Molecular Biology的Current Protocols中(John Wiley&Sons,Inc.)，其通過引用整合到本文中。

此外，優(yōu)選的實(shí)施方案包括源自本文所述變體的生物學(xué)活性肽。這類肽將含有所述取代中的至少一個(gè)，且變體將具有生物學(xué)活性?？梢杂杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何和所有手段生產(chǎn)肽，其例子包括但不限于酶促消化、化學(xué)合成或重組DNA方法。

本領(lǐng)域已確立某些成纖維細(xì)胞生長因子的肽的片段是生物學(xué)活性的。參見例如Baird等人，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)85:2324-2328(1988)和J.Cell.Phys.Suppl.5:101-106(1987)。因此，對(duì)變體的片段或肽的選擇是基于本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)的。例如，已知二肽肽酶IV(DPP-IV或DPP-4)是絲氨酸型蛋白酶，參與神經(jīng)肽、內(nèi)分泌肽和細(xì)胞因子的失活(Damme等人Chem.Immunol.72:42-56,(1999))。FGF21的N-末端(HisProIlePro)含有可以潛在地是DPP-IV的底物的2個(gè)二肽，導(dǎo)致在N-末端截短4個(gè)氨基酸的FGF21片段。預(yù)料不到的是，野生型FGF21的這一片段被證實(shí)保留了生物學(xué)活性，因此，在N-末端截短至多4個(gè)氨基酸的本發(fā)明的蛋白質(zhì)是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。

本發(fā)明還涵蓋了編碼上述變體的多核苷酸，可以是RNA的形式或DNA的形式，所述DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。DNA可以是雙鏈的或單鏈的。編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的編碼序列可以作為遺傳密碼冗余性或簡并性的結(jié)果而改變。

編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的多核苷酸可包括下列：僅變體的編碼序列、變體的編碼序列和額外的編碼序列，如功能性多肽，或前導(dǎo)序列或分泌序列或原蛋白質(zhì)序列；變體的編碼序列和非編碼序列，如內(nèi)含子或變體的編碼序列的5’和/或3’非編碼序列。因此，術(shù)語“編碼變體的多核苷酸”涵蓋了這樣的多核苷酸，其不僅可包括變體的編碼序列，還包括包含額外的編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

本發(fā)明還涉及所述編碼含有提示的取代的肽的片段、類似物和衍生物的多核苷酸的變體。多核苷酸的變體可以是人FGF21序列的天然存在的等位變體、上述非天然存在的變體，或截短的變體。因此，本發(fā)明還包括編碼上述變體的多核苷酸，以及這類多核苷酸的變體，所述變體編碼公開的變體的片段、衍生物或類似物。這類核苷酸變體包括缺失變體、取代變體、截短的變體，和添加或插入變體，只要存在第一或第二實(shí)施方案的提示的氨基酸取代中的至少一種。

在將序列與表達(dá)控制序列有效連接后(即，放置在確保功能的位置上)，可在宿主中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。這些表達(dá)載體通常在宿主生物體中是可復(fù)制的，是作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分。通常，表達(dá)載體將含有選擇標(biāo)志物，例如四環(huán)素、新霉素和二氫葉酸還原酶，來允許檢測用想要的DNA序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。雙功能蛋白質(zhì)或其片段可以在恰當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制下，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲、酵母、細(xì)菌或其他細(xì)胞中表達(dá)。也可以應(yīng)用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)這類蛋白質(zhì)，使用源自本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的RNA。

大腸桿菌是克隆本發(fā)明的多核苷酸的特別有用的原核宿主。其他適合使用的微生物宿主包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilus)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、和沙雷氏菌屬(Serratia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)的多個(gè)物種，但其他也可以用作選擇對(duì)象。在這些原核宿主中，還可以制備通常含有與宿主細(xì)胞相容的表達(dá)控制序列(例如，復(fù)制起點(diǎn))的表達(dá)載體。此外，可以存在多種普遍已知的啟動(dòng)子中的任一種，如乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸(Trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子系統(tǒng)或來自噬菌體λ或T7的啟動(dòng)子系統(tǒng)。啟動(dòng)子，任選地與操縱子序列，通常控制表達(dá)，并且具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列等，用于起始和完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。

蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，甲硫氨酸或甲硫氨酸-精氨酸序列可以在成熟序列(SEQ ID NO:3)的N-末端導(dǎo)入用于在大腸桿菌中表達(dá)，并考慮落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，除非另外指出，否則在大腸桿菌中表達(dá)的本發(fā)明的蛋白質(zhì)在N-末端具有導(dǎo)入的甲硫氨酸序列。

其他微生物，如酵母或真菌，也可用于表達(dá)。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和安格斯畢赤酵母(Pichia angusta)是優(yōu)選的酵母宿主的例子，其含有具有表達(dá)控制序列(如啟動(dòng)子)，需要時(shí)包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖分解酶，復(fù)制起點(diǎn)、終止序列等的合適載體。黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)；和裂褶菌(Schizophyllum commune)是真菌宿主的例子，但也可以應(yīng)用其他菌作為選擇對(duì)象。

還可以使用哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)和生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。真核細(xì)胞實(shí)際上是優(yōu)選的，因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)研發(fā)了多種能夠分泌完整的變體的合適的宿主細(xì)胞系，包括CHO細(xì)胞系、多種COS細(xì)胞系、NSO細(xì)胞、敘利亞倉鼠卵巢細(xì)胞系、HeLa細(xì)胞或人胚腎細(xì)胞系(即，HEK293、HEK293EBNA)。

用于這些細(xì)胞的表達(dá)載體可包括表達(dá)控制序列，如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和必要的加工信息位點(diǎn)，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪切位點(diǎn)、多聚腺苷酸化位點(diǎn)，和轉(zhuǎn)錄終止子序列。優(yōu)選的表達(dá)控制序列是源自SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、勞氏肉瘤病毒等的啟動(dòng)子。優(yōu)選的多聚腺苷酸化位點(diǎn)包括源自SV40和牛生長激素的序列。

可以將含有目標(biāo)多核苷酸序列(例如，本發(fā)明的蛋白質(zhì)和表達(dá)控制序列)的載體通過普遍已知的方法轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，所述方法取決于細(xì)胞宿主的類型。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)染是通常用于真核細(xì)胞的，而磷酸鈣處理或電穿孔則可用于其他細(xì)胞宿主。

可以使用多種蛋白質(zhì)純化的方法，這類方法是本領(lǐng)域已知的，描述在例如Deutscher,Methods in Enzymology 182:83-9(1990)和Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,Springer-Verlag,NY(1982)。選擇的純化步驟將取決于例如用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)過程的性質(zhì)。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽，例如本發(fā)明的雙活性融合蛋白，應(yīng)該以與良好的醫(yī)學(xué)實(shí)踐一致的方式配制和給藥，考慮患者的臨床病況、遞送蛋白質(zhì)組合物的位點(diǎn)、施用方法、施用的計(jì)劃，和實(shí)踐人員已知的其他因素。因此，通過這類考慮確定用于本文目的的本發(fā)明蛋白質(zhì)的“治療有效量”。

可以通過實(shí)現(xiàn)一般預(yù)期目的：治療1型和2型糖尿病、肥胖、代謝綜合征或危重患者的任何手段，施用本發(fā)明的蛋白質(zhì)的藥物組合物。非限制性的可允許的施用手段包括例如，通過吸入或栓劑或例如通過灌洗陰道、直腸、尿道、口腔和舌下組織，口腔、鼻、局部、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、不經(jīng)腸道、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)、通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射，淋巴管內(nèi)、間質(zhì)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、滑膜內(nèi)、經(jīng)上皮和經(jīng)皮向粘膜組織施用。在一些實(shí)施方案中，通過灌洗、口腔或動(dòng)脈內(nèi)施用藥物組合物。其他合適的導(dǎo)入方法還可以包括可充電的或可生物降解的裝置，和緩釋或持續(xù)釋放的聚合物裝置。本發(fā)明的藥物組合物還可以作為與其他已知代謝劑的組合療法的一部分施用。

施用劑量取決于接受者的年齡、健康和體重、同步治療的種類(如果有的話)、治療的頻率，和理想效應(yīng)的性質(zhì)。本發(fā)明范圍內(nèi)的組合物包括所有其中存在FGF21變體的組合物，所述FGF21變體的量有效實(shí)現(xiàn)了治療1型或2型糖尿病、肥胖或代謝綜合征的理想醫(yī)學(xué)效果。雖然個(gè)體需求在每個(gè)患者中不同，確定所有組分的有效量的最佳范圍屬于普通醫(yī)生的能力范圍內(nèi)。

可以根據(jù)已知方法配制本發(fā)明的蛋白質(zhì)，以制備制藥上有效的組合物。理想的制劑是可用高純度的恰當(dāng)稀釋劑或水性溶液重建的穩(wěn)定的凍干產(chǎn)物，任選地具有可藥用的運(yùn)載體、防腐劑、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版(1980))。可以組合本發(fā)明的蛋白質(zhì)與可藥用的緩沖劑，并且調(diào)節(jié)pH以提供可接受的穩(wěn)定性和對(duì)于施用而言可接受的pH。

對(duì)于不經(jīng)腸道的施用，在一個(gè)實(shí)施方案中，一般如下配制本發(fā)明的蛋白質(zhì)：在可注射形式(溶液、懸浮液或乳化液)的單位劑量中，以理想的純度混合一種或多種所述蛋白質(zhì)與可藥用的運(yùn)載體，即，在所應(yīng)用的劑量和濃度下對(duì)接受者無毒且與制劑的其他成分相容的運(yùn)載體。優(yōu)選的，可以添加一種或多種可藥用的抗微生物劑。苯酚、間甲酚和苯甲醇是優(yōu)選的可藥用的抗微生物劑。

任選的，可以添加一種或多種可藥用的鹽以調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度或滲透壓。可以添加一種或多種賦形劑以進(jìn)一步調(diào)節(jié)制劑的等滲性。甘油、氯化鈉和甘露醇是等滲性調(diào)節(jié)賦形劑的例子。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地優(yōu)化用于包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)的治療組合物的制藥上有效的劑量和施用方案，如由良好醫(yī)學(xué)實(shí)踐和個(gè)體患者的臨床病況所確定。本發(fā)明蛋白質(zhì)的典型劑量范圍是成人從約0.01mg/天至約1000mg/天(或約0.05mg/周至約5000mg/周，每周施用1次)。優(yōu)選的，劑量范圍是從約0.1mg/天至約100mg/天(或約0.5mg/周至約500mg/周，每周施用1次)，更優(yōu)選從約1.0mg/天至約10mg/天(或約5mg/周至約50mg/周，每周施用1次)。最優(yōu)選的，劑量是約1-5mg/天(或約5mg/周至約25mg/周，每周施用1次)。施用的FGF21變體的恰當(dāng)劑量將導(dǎo)致降低的血糖水平，增加空腹的能量消耗和更有效的葡萄糖利用，因而可用于治療1型或2型糖尿病、肥胖和代謝綜合征。

此外，由于在使用營養(yǎng)支持的危重患者中常見高血糖和胰島素抗性，一些重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)施用胰島素，來治療飼喂的危重患者的過高的高血糖。事實(shí)上，近期研究記載了使用外源性胰島素維持血糖在不超過110mg/分升的水平降低了手術(shù)重癥監(jiān)護(hù)病房中的危重患者的發(fā)病率和死亡率，不論所述患者是否具有糖尿病史(Van den Berghe等人N Engl J Med.,345(19):1359,(2001))。因而，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是獨(dú)特地適合幫助恢復(fù)代謝不穩(wěn)定的危重患者中的代謝穩(wěn)定性的。本發(fā)明的蛋白質(zhì)(如含有FGF21變體的蛋白質(zhì))是獨(dú)特的，在于其刺激葡萄糖攝取并增強(qiáng)胰島素靈敏度，且不誘導(dǎo)高血糖。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面，考慮使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)作為藥物，用于治療肥胖、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非醇型脂肪肝病(NAFLD)、非醇型脂肪性肝炎(NASH)、胰島素耐受、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖、代謝綜合征、急性心肌梗塞、與胰島素受體的嚴(yán)重失活突變相關(guān)的病況、包括HIV相關(guān)性脂肪營養(yǎng)不良在內(nèi)的脂肪營養(yǎng)不良和其他代謝病癥。

目前已經(jīng)詳細(xì)的描述了本發(fā)明，但參考下列實(shí)施例將更明確的理解本發(fā)明，所述實(shí)施例僅出于示例的目的才包括在本文中，而并非意在限制本發(fā)明。

除非另外指出，否則本發(fā)明的實(shí)踐將應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)的化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)方法。文獻(xiàn)中更全面的解釋了這類技術(shù)。參見例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan編著，Academic Press,Inc.)；和Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編著，1986,Blackwell Scientific Publications)；和Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，1989)。

位點(diǎn)特異性FGF21突變體

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包括GLP-1或毒蜥外泌肽-4的額外的突變體、GLP-1/胰高血糖素雜交肽、具有非天然氨基酸(賦予DPP-4抗性，用于PEG化或其他目的)的GLP-1類似物。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包含具有野生型FGF21的一個(gè)或多個(gè)下列額外修飾的的FGF21激動(dòng)劑：

(i)額外的二硫鍵、非天然氨基酸或修飾以促進(jìn)二聚化，如在R154C處形成二硫鍵，或在另一個(gè)位點(diǎn)導(dǎo)入半胱氨酸，或通過融合的Fc結(jié)構(gòu)域二聚化，或通過交聯(lián)劑(如雙功能PEG)形成二聚體；

(ii)FGF21的片段；

(iii)選擇的具有FGF21活性(與β-klotho結(jié)合，結(jié)合和激活FGFR)的蛋白質(zhì)；和

(iv)FGF21模擬抗體(多種模式，如Fab、unibody、svFc等)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙活性蛋白質(zhì)包含一個(gè)或多個(gè)下列接頭：簡單的酰胺鍵、短肽(特別是Ser/Gly重復(fù))、FGF21翻譯序列的額外殘基，或多至完整蛋白質(zhì)的較大接頭(如Fc結(jié)構(gòu)域、結(jié)合HAS的螺旋束，HSA等)。還可以通過其他化學(xué)手段連接兩個(gè)部分，如通過非天然氨基酸或標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)接頭(馬來酰亞胺-Cys、NHS-Lys、“點(diǎn)擊化學(xué)”等)。用于FGF21模擬抗體方式的“接頭”可包括已列舉的那些，以及環(huán)中插入片段，其之后切割以釋放GLP-1N-末端。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含在1、2或多個(gè)特異性位點(diǎn)發(fā)生的PEG化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，PEG化發(fā)生在FGF21分子或接頭中。在一些實(shí)施方案中，PEG化不在雙功能蛋白質(zhì)的N-末端的～10個(gè)氨基酸內(nèi)，優(yōu)選不在FGF21起點(diǎn)的～10個(gè)氨基酸內(nèi)。PEG化連接化學(xué)可包括NHS-Lys、馬來酰亞胺-Cys、非天然氨基酸(醛、“點(diǎn)擊化學(xué)”、Pcl等)，并可與合適的蛋白質(zhì)變體組合以控制反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量。

本發(fā)明的融合蛋白的PEG基團(tuán)可以是任何大小(例如，1、2、3、4、5、10、20、24、29、30、40kDa)，且可以是線性的、分枝的或梳狀的結(jié)構(gòu)，優(yōu)選總PEG化大于或等于40kDa。最佳的PEG化實(shí)現(xiàn)了使半壽期延長至足以進(jìn)行每周1次給藥。使用較短的PEG聚合物，蛋白質(zhì)二聚體、三聚體、四聚體等的PEG化可以導(dǎo)致充分的血清半壽期延長。分枝的和梳狀的PEG結(jié)構(gòu)對(duì)較低的粘度而言是有益的。

用于本發(fā)明的融合蛋白的優(yōu)選的半壽期延長方法包括在接頭中摻入IgG Fc結(jié)構(gòu)域或HAS，且可以不需要PEG化。此外，使用Fc結(jié)構(gòu)域融合物可導(dǎo)致二聚體化，并且除延長半壽期外，還可導(dǎo)致增強(qiáng)的效價(jià)。

本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括但不限于下列用于延長半壽期的連接：結(jié)合HAS的脂類或小分子或微團(tuán)與融合物的單體或二聚體形態(tài)連接。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽進(jìn)行其他連接，實(shí)現(xiàn)延長半壽期和其他改良的生物學(xué)特性。可包括連接PEG-膽固醇綴合物(包括微團(tuán)和脂質(zhì)體)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽，和/或連接糖類(糖基化)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽。在仍然其他的實(shí)施方案中，應(yīng)用類似的技術(shù)向蛋白質(zhì)、多肽和/或肽添加綴合物，例如，多唾液酸(PSA)、羥乙基淀粉(HES)、白蛋白結(jié)合配體，或碳水化合物盾。

HES化技術(shù)通過還原性烷基化作用，例如偶聯(lián)分枝的羥乙基淀粉(HES)鏈(60kDa或100kDa，來自玉米淀粉的高分枝的支鏈淀粉片段)與蛋白質(zhì)、多肽和/或肽。多唾液酸化作用以與PEG化相似的方式用多唾液酸(PSA)綴合目標(biāo)蛋白質(zhì)、多肽和/或肽。PSA聚合物是天然存在于體內(nèi)的帶負(fù)電的、非免疫原性的聚合物，并且可以10-50kD的分子量獲得。

在本發(fā)明的仍然其他的實(shí)施方案中，可以對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽進(jìn)行其他連接或修飾，以實(shí)現(xiàn)延長半壽期和其他改善的生物學(xué)特性。這些包括生成重組PEG(rPEG)基團(tuán)，及其與本發(fā)明的蛋白質(zhì)、多肽和/或肽的連接。如公司Amunix,Inc.研發(fā)的。rPEG技術(shù)是基于具有PEG-樣特性的蛋白質(zhì)序列，所述序列在遺傳上與生物藥劑融合，避免了額外的化學(xué)綴合步驟。rPEG是半壽期延長的艾塞那肽構(gòu)建體，其含有疏水性氨基酸的長的非結(jié)構(gòu)性尾部，并且能夠增加蛋白質(zhì)或肽的血清半壽期并減慢其吸收速率，因此顯著降低了峰-谷比。rPEG具有增加的水動(dòng)力學(xué)半徑，并且顯示了是其實(shí)際分子量約15倍的表觀分子量，模擬了PEG化實(shí)現(xiàn)長的血清半壽期的方式。XL-protein GmbH已經(jīng)研發(fā)了用于蛋白質(zhì)“PAS化”的類似重組多肽序列。

化學(xué)修飾的雙功能蛋白質(zhì)突變體

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考本文所述的公開內(nèi)容，制備本文所述的融合蛋白的化學(xué)修飾形式，包括例如本文所述的雙功能融合蛋白的截短的和變體形式。改變這類化學(xué)修飾的雙功能蛋白質(zhì)，使得化學(xué)修飾的突變體在與突變體天然連接的分子的類型或位置上不同于未修飾的突變體?；瘜W(xué)修飾的突變體可包括通過缺失一個(gè)或多個(gè)天然連接的化學(xué)基團(tuán)而形成的分子。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過共價(jià)連接一個(gè)或多個(gè)聚合物，修飾本發(fā)明的蛋白質(zhì)。例如，選擇的聚合物通常是水溶性的，使得其連接的蛋白質(zhì)在水性環(huán)境，如生理環(huán)境中不沉淀。包括在合適的聚合物的范圍內(nèi)的是聚合物的混合物。優(yōu)選的，為了終產(chǎn)物制品的治療用途，聚合物將是可藥用的。與本發(fā)明的蛋白質(zhì)綴合的不溶于水的聚合物也形成本發(fā)明的一個(gè)方面。

每種示例性聚合物可以是任何分子量，且可以是分枝的或不分枝的。每種聚合物通常具有在約2kDa至約100kDa之間的平均分子量(術(shù)語“約”表示，在水溶性聚合物的制品中，一些分子重于，而一些輕于所述分子量)。每種聚合物的平均分子量優(yōu)選在約5kDa至約50kDa之間，更優(yōu)選在約12kDa至約40kDa之間，最優(yōu)選在約20kDa至約35kDa之間。

合適的水溶性聚合物或其混合物包括但不限于N-連接或O-連接的碳水化合物、糖、磷酸鹽、聚乙二醇(PEG)(包括已經(jīng)用于衍生蛋白質(zhì)的PEG的形式，包括單-(C1-C10)、烷氧基，或芳氧基-聚乙二醇)、單甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖(如低分子量葡聚糖，例如約6kD)、纖維素或基于其他碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙基化的(polyoxyethlated)多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇。本發(fā)明還涵蓋了可用于制備共價(jià)連接的雙功能蛋白質(zhì)變體多聚體的雙功能交聯(lián)分子。本發(fā)明還涵蓋了與多唾液酸共價(jià)連接的雙功能蛋白質(zhì)變體。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，雙功能蛋白質(zhì)變體經(jīng)共價(jià)或化學(xué)修飾以包括一個(gè)或多個(gè)水溶性聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚氧乙二醇或聚丙二醇。參見例如美國專利號(hào)4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192和4,179,337。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，雙功能蛋白質(zhì)包含一個(gè)或多個(gè)聚合物，包括但不限于單甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纖維素、基于另一種碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物聚氧乙基化的多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇，或這類聚合物的混合物。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，雙功能蛋白質(zhì)是用PEG亞基共價(jià)修飾的。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)水溶性聚合物與雙功能蛋白質(zhì)突變體的一個(gè)或多個(gè)特定位置(例如，N-末端)結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)水溶性聚合物與雙功能蛋白質(zhì)突變體的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈隨機(jī)連接。在一些實(shí)施方案中，使用PEG改善雙功能蛋白質(zhì)突變體的治療能力。某些這類方法公開在例如美國專利號(hào)6,133,426中，其出于任何目的通過引用整合到本文中。

在其中聚合物是PEG的本發(fā)明的實(shí)施方案中，PEG基團(tuán)可以具有任何方便的分子量，并且可以是線性或分枝的。PEG基團(tuán)的平均分子量的范圍優(yōu)選是從約2kD至約100kDa，更優(yōu)選從約5kDa至約50kDa，例如10、20、30、40或50kDa。PEG基團(tuán)一般通過經(jīng)由PEG部分上的反應(yīng)性基團(tuán)(例如，醛基、氨基、巰基或酯基)與雙功能蛋白質(zhì)突變體上的反應(yīng)基團(tuán)(例如，醛基、氨基或酯基)的酰化作用或還原性烷基化作用與雙功能蛋白質(zhì)突變體連接。

分枝的PEG衍生物，也被稱為“Y形”PEG衍生物，含有與中央核心連接的2條線性甲氧基PEG鏈。這類“Y形”PEG衍生物的立體主結(jié)構(gòu)將促進(jìn)修飾的分子的單點(diǎn)連接。作為例子，3種類型的“Y形”PEG衍生物是Y-NHS-40K(用于胺基PEG化)；Y-MAL-40K(用于巰基PEG化)；和Y-ALD-40K(例如，Y-AALD-40K和Y-PALD-40K)(用于N-末端PEG化)。對(duì)于胺基PEG化，“Y形”NHS酯將與賴氨酸的氨基或生物學(xué)活性分子的N-末端胺基反應(yīng)，產(chǎn)生穩(wěn)定的酰胺鍵。在pH 7-8.5，該NHS酯將與靶向的分子偶聯(lián)。對(duì)于巰基PEG化，“Y形”馬來酰亞胺將與生物學(xué)活性分子的巰基反應(yīng)，生成穩(wěn)定的3-巰基琥珀酰亞胺醚鍵。該馬來酰亞胺將在存在其他官能團(tuán)的條件下，在約pH 7.4與靶向的分子偶聯(lián)。對(duì)于N-末端PEG化，“Y形”醛將在存在還原劑(如氰基硼氫化鈉)的條件下，優(yōu)選與生物學(xué)活性分子的N-末端胺基反應(yīng)，產(chǎn)生穩(wěn)定的胺鍵。該醛將在pH 5-8與靶向的分子的N-末端胺基偶聯(lián)。用于實(shí)施分枝的PEG化的試劑可自例如JenKem Technology獲得。

可以使用本領(lǐng)域已知的任何PEG化反應(yīng)，特異性地進(jìn)行多肽，包括本發(fā)明的蛋白質(zhì)的PEG化。這類反應(yīng)描述在例如下列文獻(xiàn)中：Francis等人，1992,Focus on Growth Factors 3:4-10；歐洲專利號(hào)0 154 316和0 401 384；和美國專利號(hào)4,179,337。例如，可以通過與本文所述的反應(yīng)性聚乙二醇分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)的?；磻?yīng)或烷基化反應(yīng)，進(jìn)行PEG化。對(duì)于酰化反應(yīng)，選擇的聚合物應(yīng)具有單個(gè)反應(yīng)性酯基。對(duì)于還原性烷基化，選擇的聚合物應(yīng)具有單個(gè)反應(yīng)性醛基。反應(yīng)性醛是例如水穩(wěn)定性的聚乙二醇丙醛，或其單C1-C10烷氧基或芳氧基化衍生物(參見例如美國專利號(hào)5,252,714)。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，用于連接PEG基團(tuán)與多肽的有效對(duì)策涉及通過在溶液中形成綴合物連接，組合肽和PEG部分，所述肽和PEG部分分別具有彼此相互反應(yīng)的特定官能團(tuán)。可以用常規(guī)的固相合成方便的制備肽。用恰當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)在特定位點(diǎn)“預(yù)活化”肽。純化前體，并在與PEG部分反應(yīng)前完全表征。肽和PEG的連接通常發(fā)生在水相中，并且可以通過逆相分析性HPLC方便的監(jiān)控?？梢酝ㄟ^制備性的HPLC方便的純化PEG化肽，并通過分析性HPLC、氨基酸分析和激光吸附質(zhì)譜表征。

多糖聚合物是可用于蛋白質(zhì)修飾的另一類型的水溶性聚合物。因此，與多糖聚合物融合的本發(fā)明的蛋白質(zhì)形成了本發(fā)明的實(shí)施方案。葡聚糖是包含主要通過α1-6鍵連接的單個(gè)葡萄糖亞基的多糖聚合物。葡聚糖本身可以多種分子量獲得，并可以從約1kD至約70kD的分子量方便的獲得。葡聚糖是本身適用作為載體或與另一種載體(例如Fc)組合的水溶性聚合物。參見例如國際公開號(hào)WO 96/11953。已報(bào)道了與治療性或診斷性免疫球蛋白綴合的葡聚糖的用途。參見例如歐洲專利公開號(hào)0 315 456，其通過引用整合到本文中。本發(fā)明還涵蓋了約1kD至約20kD的葡聚糖的用途。

一般而言，可以在任何適合反應(yīng)蛋白質(zhì)與活化的多聚物分子的條件下實(shí)施化學(xué)修飾。用于制備化學(xué)修飾的多肽的方法一般包括步驟：(a)在使得FGF21蛋白變體變得與一個(gè)或多個(gè)聚合物分子連接的條件下，使多肽與活化的聚合物分子(如聚合物分子的反應(yīng)性酯類或醛類衍生物)反應(yīng)，和(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物?；谝阎膮?shù)和理想的結(jié)果，確定最佳反應(yīng)條件。例如，聚合物分子與蛋白質(zhì)的比例越大，連接的聚合物分子的百分比就越大。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)修飾的FGF21突變體可以在氨基末端具有單個(gè)聚合物分子部分(參見例如美國專利號(hào)5,234,784)。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以與生物素化學(xué)偶聯(lián)。然后，本發(fā)明的生物素化的蛋白質(zhì)允許與鏈霉親和素結(jié)合，獲得三價(jià)的鏈霉親和素/生物素/本發(fā)明的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)還可以與二硝基苯酚(DNP)或三硝基苯酚(TNP)共價(jià)偶聯(lián)，并且用抗DNP或抗TNP-IgM沉淀得到的綴合物，以形成10價(jià)的十聚綴合物。

一般而言，可以通過施用本發(fā)明的化學(xué)修飾的雙功能蛋白質(zhì)突變體減輕或調(diào)節(jié)的病況包括本文所述的關(guān)于本發(fā)明的蛋白質(zhì)的那些病況。然而，本文公開的化學(xué)修飾的雙功能蛋白質(zhì)突變體可具有額外的活性、增強(qiáng)的或降低的生物學(xué)活性或其他特征，如與未修飾的雙功能蛋白質(zhì)突變體相比增加的或減少的半壽期。

雙功能蛋白質(zhì)的治療組合物及其施用

包含本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)的治療組合物落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，且在例如表現(xiàn)出增強(qiáng)的特性的若干突變雙功能蛋白質(zhì)序列的鑒別中具體考慮。這類雙功能蛋白質(zhì)突變體藥物組合物可包含治療有效量的雙功能蛋白質(zhì)變體與制藥上或生理上可接受的制劑活性劑的混合，根據(jù)與施用模式的適合性選擇所述制劑活性劑。

在應(yīng)用的劑量和濃度，可接受的制劑材料優(yōu)選對(duì)受體是無毒的。

藥物組合物可含有制劑材料，用于修飾、維持或保持例如組合物的pH、滲透壓、粘度、清澈度、顏色、等滲性、氣味、無菌、穩(wěn)定性、溶解或釋放速率、吸收或滲透。合適的制劑材料包括但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸)、抗微生物劑、抗氧化劑(如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)、緩沖劑(如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機(jī)酸)、填充劑(如甘露醇或甘氨酸)、螯合劑(如乙二胺四乙酸(EDTA))、絡(luò)合劑(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環(huán)糊精或羥丙基-β-環(huán)糊精)、填料、單糖、二糖和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白質(zhì)(如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、著色劑、芳香劑和稀釋劑、乳化劑、親水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成鹽的抗衡離子(如鈉)、防腐劑(如苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫)、溶劑(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)、懸浮劑、表面活性劑或濕潤劑(如普朗尼克(pluronic)；PEG；山梨糖酯；聚山梨醇酯類如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；triton；氨丁三醇；卵磷脂；膽固醇或tyloxapal)、穩(wěn)定性增強(qiáng)劑(如蔗糖或山梨醇)、張力增強(qiáng)劑(如堿金屬鹵化物；優(yōu)選氯化鈉或氯化鉀；或甘露醇山梨糖醇)、遞送載體、稀釋劑、賦形劑和/或藥物佐劑(參見例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版，A.R.Gennaro編著，Mack Publishing Company 1990)及其隨后版，出于任何目的通過引用整合到本文中)。

熟練的技術(shù)人員可根據(jù)例如預(yù)期的施用途徑、遞送模式和理想劑量，確定最佳的藥物組合物(參見例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，見上文)。這類組合物可以影響本發(fā)明的融合蛋白的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除速率。

藥物組合物中的主要載體或運(yùn)載體本質(zhì)上可以是水性的或非水性的。例如，用于注射的合適載體或運(yùn)載體可以是水、生理鹽溶液或人工腦脊液，可能補(bǔ)充了不經(jīng)腸道施用的其他組合物中常見的材料。中性的緩沖生理鹽水或與血清白蛋白混合的生理鹽水是另一示例性的載體。其他示例性的藥物組合物包含約pH 7.0-8.5的Tris緩沖劑，或約pH 4.0-5.5的醋酸緩沖劑，其還可包括山梨糖醇或合適的組分。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過混合處于凍干的餅或水性溶液形式的具有理想純度的選擇的組合物與任選的制劑活性劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences，見上文)，制備雙功能藥物組合物用于儲(chǔ)藏。此外，可以使用恰當(dāng)?shù)馁x形劑(如蔗糖)，將雙功能蛋白質(zhì)產(chǎn)物配制為凍干產(chǎn)物。

可以選擇含有本發(fā)明的融合蛋白的藥物組合物用于不經(jīng)腸道的遞送。備選的，可以選擇組合物用于吸入，或用于通過消化道，如口腔遞送。這類可藥用的組合物的制備是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。

制劑組分以施用位點(diǎn)可接受的濃度存在。例如，使用緩沖劑維持組合物處于生理學(xué)pH或略低的pH，通常在從約5至約8的pH范圍內(nèi)。

當(dāng)考慮不經(jīng)腸道的施用時(shí)，用于本發(fā)明的治療性組合物可以是不含致熱源的、腸道外可接受，水性溶液的形式，在可藥用的運(yùn)載體中包含理想的雙功能蛋白質(zhì)。用于不經(jīng)腸道注射的特別合適的載體是無菌蒸餾水，其中雙功能蛋白質(zhì)被配制為無菌的等滲溶液，被正確的保藏。而另一種制品可以涉及理想的分子和活性劑的制劑，所述活性劑例如可注射的微球、可生物蝕解的顆粒、多聚化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂質(zhì)體，所述活性劑提供產(chǎn)物的受控或持續(xù)的釋放，然后通過積存注射劑遞送所述產(chǎn)物。還可以使用透明質(zhì)酸，其具有促進(jìn)在循環(huán)中持續(xù)期的效果。用于導(dǎo)入理想分子的其他合適手段包括可植入的藥物遞送裝置。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可以配制用于吸入的藥物組合物。例如，可以將本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)配制為用于吸入的干燥粉末。也可以用推進(jìn)劑配制雙功能蛋白質(zhì)的吸入溶液，用于氣霧劑遞送。在仍然另一個(gè)實(shí)施方案中，溶液可以是霧化的。國際公開號(hào)WO 94/20069中進(jìn)一步描述了肺部施用，其描述了肺部遞送化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)。

還考慮某些可以口服施用的制劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以用或不用在混合固體劑型(如片劑和膠囊)中常規(guī)使用的運(yùn)載體，配制以該方式施用的本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)。例如，當(dāng)使生物利用度最大化和使前全身性降解最小化時(shí)，可以設(shè)計(jì)膠囊以在胃腸道中的點(diǎn)釋放制劑的活性部分?？梢园~外的活性劑以促進(jìn)吸收本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)。還可以應(yīng)用稀釋劑、風(fēng)味劑、低熔點(diǎn)蠟、蔬菜油、潤滑劑、懸浮劑、片劑崩解劑和粘合劑。

另一種藥物組合物可以涉及有效量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)與適用于生產(chǎn)片劑的無毒的賦形劑的混合物。通過在無菌水或另一種恰當(dāng)?shù)妮d體中溶解片劑，可以制備單位劑型的溶液。合適的賦形劑包括但不限于惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或結(jié)合劑，如淀粉、明膠或阿拉伯樹膠；或潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。

包含本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)的額外的藥物組合物對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的，包括涉及處于持續(xù)或受控遞送制劑的本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)的制劑。用于配制多種其他持續(xù)或受控遞送工具的技術(shù)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，如脂質(zhì)體運(yùn)載體、可生物蝕解的顆粒、或多孔珠和積存注射劑(參見例如，國際公開號(hào)WO 93/15722，其描述了用于遞送藥物組合物的多孔聚合物微顆粒的受控釋放，和Wischke&Schwendeman,2008,Int.J Pharm.364:298-327，和Freiberg&Zhu,2004,Int.J Pharm.282:1-18，其討論了微球/微顆粒制品及用途)。

緩釋制品的額外的例子包括作為成型物件形式的半透性聚合物基質(zhì)，例如膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)可包括聚酯、水凝膠、聚丙交酯(美國專利號(hào)3,773,919和歐洲專利號(hào)0 058 481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人,1983,Biopolymers 22:547-56)、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,1981,J.Biomed.Mater.Res.15:167-277和Langer,1982,Chem.Tech.12:98-105)、乙烯-醋酸乙烯(Langer等人，見上文)或聚-D-3-羥基丁酸(歐洲專利號(hào)0 133 988)。緩釋組合物還可包括脂質(zhì)體，其可以通過本領(lǐng)域已知的若干種方法的任一種制備。參見例如，Epstein等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3688-92；和歐洲專利號(hào)0 036 676、0 088 046和0 143 949。

用于體內(nèi)施用的本發(fā)明藥物組合物通常必須是無菌的。這可以通過無菌過濾膜過濾來實(shí)現(xiàn)。當(dāng)凍干組合物時(shí)，可以在凍干和重建之前或之后進(jìn)行利用該方法的滅菌。用于不經(jīng)腸道施用的組合物可以以凍干的形式或溶液儲(chǔ)藏。此外，不經(jīng)腸道的組合物一般放在具有無菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射針頭穿刺的塞子的靜脈輸液袋或輸液瓶。

一旦配制了藥物組合物，則可以作為溶液、懸浮液、凝膠、乳劑、固體或作為脫水的或凍干的粉末儲(chǔ)藏在無菌瓶中。這類制劑可以以即用形式，或者以需要在施用前重建的形式(例如凍干的)儲(chǔ)藏。

在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)單劑量施用單元的試劑盒。每個(gè)試劑盒可含有具有理想蛋白質(zhì)的第一容器和具有水性制劑的第二容器。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括了含有單室和多室的預(yù)填裝的注射器(例如，液體注射器和lyosyringe)的試劑盒。

雙功能蛋白質(zhì)的劑量及其施用

待應(yīng)用的本發(fā)明的藥物組合物的有效量在治療上取決于例如治療內(nèi)容和目標(biāo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，用于治療的恰當(dāng)?shù)膭┝克綄⒉糠值母鶕?jù)遞送的分子、融合蛋白變體所用于的適應(yīng)癥、施用途徑、患者的大小(體重、體表面積或器官大小)和條件(年齡和健康狀態(tài))而改變。因此，醫(yī)生可以滴定劑量，并修飾施用途徑，以獲得最佳的治療效果。典型的劑量范圍可從約0.1μg/kg至多至約100mg/kg或更高，取決于上述因素。在其他實(shí)施方案中，劑量范圍可從0.1μg/kg多至約100mg/kg；或1μg/kg多至約100mg/kg。

給藥頻率將取決于使用的制劑中的雙功能蛋白質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。通常，醫(yī)生將施用組合物直到達(dá)到實(shí)現(xiàn)理想效果的劑量。因此，組合物可以通過植入裝置或?qū)Ч茈S時(shí)間作為單次劑量、作為兩次或多次劑量(可含有或不含相同量的理想分子)，或作為連續(xù)灌注來施用。本領(lǐng)域普遍技術(shù)人員常規(guī)地對(duì)恰當(dāng)劑量進(jìn)行進(jìn)一步精細(xì)化，這屬于常規(guī)實(shí)施的任務(wù)的范圍?？梢酝ㄟ^使用恰當(dāng)?shù)膭┝?應(yīng)答數(shù)據(jù)，確定恰當(dāng)?shù)膭┝俊?/p>

藥物組合物的施用途徑與已知的方法一致，例如口服；通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)(腦實(shí)質(zhì)內(nèi))、腦室內(nèi)、肌肉內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、門靜脈內(nèi)或病損內(nèi)的途徑注射；通過緩釋系統(tǒng)(也可以注射的)；或通過植入裝置。需要時(shí)，可以通過團(tuán)注射(bolus injection)或連續(xù)灌注，或通過植入裝置，來施用組合物。

可選的或此外，可以通過植入其上已經(jīng)吸附或囊封了理想分子的膜、海綿或其他恰當(dāng)?shù)牟牧?，局部施用組合物。當(dāng)使用植入裝置時(shí)，裝置可以植入到任何合適的組織或器官中，可以通過擴(kuò)散、控制時(shí)間的快速濃注或連續(xù)施用，遞送理想的分子。

雙功能蛋白質(zhì)的治療性用途

本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用于治療、診斷、減輕或預(yù)防多種疾病、病癥或病況，包括但不限于代謝病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所治療的代謝病癥是糖尿病，例如2型糖尿病。在其他實(shí)施方案中，代謝病癥是肥胖。其他實(shí)施方案包括代謝病況或病癥，如1型糖尿病、胰腺炎、血脂異常、非醇型脂肪肝病(NAFLD)、非醇型脂肪性肝炎(NASH)、胰島素耐受、高胰島素血癥、葡萄糖不耐受、高血糖、代謝綜合征、高血壓、心血管病、急性心肌梗塞、動(dòng)脈粥樣硬化、外周動(dòng)脈病、中風(fēng)、心臟衰竭、冠心病、腎病、糖尿病并發(fā)癥、神經(jīng)病、與胰島素受體的嚴(yán)重失活突變相關(guān)的病癥、包括HIV相關(guān)性脂肪營養(yǎng)不良在內(nèi)的脂肪營養(yǎng)不良、胃輕癱和其他的代謝病癥。

在應(yīng)用中，可以通過向有需要的患者施用治療有效劑量的本文所述的雙功能蛋白質(zhì)變體，治療病癥或病況如1型或2型糖尿病或肥胖?？梢匀绫疚乃鰧?shí)施施用，如通過IV注射、腹膜內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射或以片劑形式或液體制劑口服。在大部分情況下，理想的劑量可以由醫(yī)生確定，如本文所述，并可以代表雙功能蛋白質(zhì)多肽的治療有效劑量。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，雙功能蛋白質(zhì)多肽的治療有效劑量將尤其取決于施用計(jì)劃、施用的抗原的單位劑量、核酸分子或多肽是否與其他治療劑組合施用、接受者的免疫狀態(tài)和健康。如本文使用的，術(shù)語“治療有效劑量”意指研究人員、醫(yī)學(xué)博士或其他醫(yī)生發(fā)現(xiàn)在組織系統(tǒng)、動(dòng)物或人中觸發(fā)生物學(xué)或醫(yī)學(xué)應(yīng)答的雙功能蛋白質(zhì)多肽的量，包括所治療的疾病或病癥的癥狀的減輕。

藥物組合物

本發(fā)明還提供了包含一種或多種本文所述的本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)或突變體和可藥用的運(yùn)載體的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物以作為液體溶液或懸浮液的可注射劑制備；也可以制備適合在注射前溶解或懸浮在液體載體中的固體形式。脂質(zhì)體也包括在可藥用的運(yùn)載體的定義范圍內(nèi)。藥物組合物中也可以存在可藥用的鹽，例如礦物酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等；和有機(jī)酸的鹽，如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、安息香酸鹽等。對(duì)可藥用的賦形劑的全面討論可獲得自Remington:The Science and Practice of Pharmacy(1995)Alfonso Gennaro,Lippincott,Williams,&Wilkins。

融合蛋白和肽化合物

在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的蛋白質(zhì)制備成源自本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)的氨基酸序列的融合蛋白或肽化合物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，制備這類融合蛋白和肽化合物。例如，可以使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)，通過化學(xué)合成制備肽化合物，然后通過本領(lǐng)域已知的多種用于將肽導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi)的工具(例如，脂質(zhì)體等)導(dǎo)入細(xì)胞中。

可以通過產(chǎn)生肽修飾，如在本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)中添加N-連接糖基化位點(diǎn)，或綴合本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)與聚乙二醇(PEG；PEG化作用)，例如通過賴氨酸-單PEG化或半胱氨酸-單PEG化，改善本發(fā)明的融合蛋白或肽化合物的體內(nèi)半壽期。已證實(shí)這類技術(shù)對(duì)延長治療性蛋白質(zhì)藥物的半壽期是有益的。預(yù)期對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的PEG化可以導(dǎo)致相似的制藥優(yōu)點(diǎn)。

此外，可以通過導(dǎo)入非自然氨基酸，在本發(fā)明多肽的任何部分中實(shí)現(xiàn)PEG化?？梢酝ㄟ^Deiters等人,J Am Chem Soc 125:11782-11783,2003；Wang和Schultz,Science 301:964-967,2003；Wang等人,Science 292:498-500,2001；Zhang等人,Science 303:371-373,2004或美國專利號(hào)7,083,970中描述的技術(shù)，導(dǎo)入某些非自然氨基酸。簡而言之，一些這類表達(dá)系統(tǒng)涉及定點(diǎn)誘變，向編碼本發(fā)明多肽的開放閱讀框中導(dǎo)入無義密碼子，如琥珀TAG。然后，將這類表達(dá)載體導(dǎo)入這樣的宿主中，所述宿主可利用特異性針對(duì)所導(dǎo)入的無義密碼子并裝載有選擇的非自然氨基酸的tRNA。有益于綴合部分與本發(fā)明多肽這一目的的特別的非自然氨基酸包括具有乙炔和疊氮側(cè)鏈的氨基酸。然后，可以在蛋白質(zhì)中這些選擇的位點(diǎn)，將含有這些新型氨基酸的本發(fā)明的蛋白質(zhì)PEG化。

類似的，可以通過如Ou等人所述(Proc Natl Acad Sci U S A.2011Jun 28；108(26):10437-42.Epub 2011Jun 13)導(dǎo)入吡咯賴氨酸或吡咯啉-羧基-賴氨酸，在本發(fā)明蛋白質(zhì)的任何部分實(shí)現(xiàn)PEG化。

實(shí)施例

實(shí)施例1：設(shè)計(jì)本發(fā)明的GLP-1/蛋白質(zhì)

為了測試GLP-1和FGF21在一起的功效，設(shè)計(jì)融合分子。因?yàn)镚LP-1需要游離的N-末端，而FGF21需要游離的C-末端用于受體結(jié)合和激活，按N-GLP-1-接頭-FGF21-C的順序克隆二者。用GLP-1第7-35位殘基制備初始構(gòu)建體，N-末端有或沒有用于DPP-4保護(hù)的若干修飾(討論在下文中)。測試GLP-1的其他修飾(點(diǎn)突變體或缺失)，并通過體外效價(jià)評(píng)分。

克隆3、8、10或20個(gè)氨基酸的接頭。對(duì)于FGF21，使用野生型人蛋白質(zhì)的第33-209位殘基。產(chǎn)生有或沒有PEG化位點(diǎn)的構(gòu)建體。使用與導(dǎo)入的Cys反應(yīng)的馬來酰亞胺-PEG試劑(40kDa線性和分枝的PEG)，實(shí)現(xiàn)PEG化。將Cys放在FGF21的R154和GLP-1或毒蜥外泌肽-4和接頭中若干位點(diǎn)的位置上。還通過在FGF21的R154或GLP-1的K34位置導(dǎo)入TAG(琥珀)密碼子，摻入Pcl、Pyl、Pyl類似物或反應(yīng)性非天然存在的氨基酸，設(shè)計(jì)修飾的構(gòu)建體。通過在R154或K34包括Cys，和在其他位點(diǎn)包括用于摻入Pcl、Pyl、Pyl類似物或反應(yīng)性非天然存在的氨基酸的TAG密碼子，設(shè)計(jì)兩種不同修飾的其他構(gòu)建體。制備將GLP-1和FGF21與人抗體的Fc結(jié)構(gòu)域融合的構(gòu)建體。向融合模式中導(dǎo)入FGF21的變體76(V76)序列。

融合物的表達(dá)和純化：通過將編碼特定的雙功能變體的DNA克隆到含有若干可去除結(jié)構(gòu)域(例如，NPro或NPro變體，其有或無His6標(biāo)簽、或含有TEV蛋白酶識(shí)別肽的His6標(biāo)簽、或His6-泛素或His6-Smt3)之一的編碼序列的載體中，通常在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白。載體還包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，用于起始表達(dá)蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)錄，如lac、T7或阿拉伯糖啟動(dòng)子。簡而言之，將載體轉(zhuǎn)化到源自DH10b的大腸桿菌細(xì)胞中或源自BL21(DE3)的細(xì)胞中，在標(biāo)準(zhǔn)條件下生長，并向培養(yǎng)基中添加0.2％阿拉伯糖或IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。在誘導(dǎo)3-4小時(shí)后收獲細(xì)胞，離心，并冷凍。解凍沉淀團(tuán)塊，通過超聲處理重懸裂解，通過離心分離不可溶的蛋白質(zhì)。然后，將沉淀團(tuán)塊溶解在6M胍中，并將溶解的澄清蛋白質(zhì)上樣到Ni-NTA柱上。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐，用變性緩沖劑，再用非變性緩沖劑洗滌柱，并在非變性緩沖劑中洗脫。將洗脫液進(jìn)行緩沖劑交換以去除咪唑，用特異性蛋白酶消化去除標(biāo)簽(例如，TEV蛋白酶、泛素酶Usp2或Ulp1用于特異性去除smt3)，并通過Ni-NTA純化。在PEG化前，通過尺寸排阻層析進(jìn)一步純化含有融合蛋白的級(jí)分(通常用NOF Sunbright GL2-400MA 40kDa分枝的PEG馬來酰亞胺)。通過陰離子交換層析分離PEG化的蛋白質(zhì)，放在PBS中，濃縮或儲(chǔ)藏用于多種測定。

通過N-末端突變保護(hù)GLP-1：因?yàn)橐阎狣PP-4對(duì)GLP-1的N-末端的加工使得肽對(duì)于其原發(fā)性受體失活，因此嘗試了文獻(xiàn)中報(bào)道的若干突變來減慢該過程。在基于細(xì)胞的GLP-1活性測定法中，測試了具有N-末端添加額外的甘氨酸、Glu9突變?yōu)镻ro，或Ala8突變?yōu)镚ly或Ser的所有構(gòu)建體。在具有與FGF21連接的40kDa PEG的FGF21融合物的情況下，Ala8處的突變保持了比其他N-末端修飾更好的活性(圖1a)，并在后續(xù)設(shè)計(jì)中使用A8S突變。此外，在融合物中還測試了DPP-4-抗性類似物——毒蜥外泌肽-4，作為具有延長的體內(nèi)半壽期的備選部分(圖1b)。[參見例如，J.Y.Oh等人(2009)Bulletin of the Korean Chemical Society 30,2471-2474；K.Adelhorst,(1994)JBC 269,6275；B.D.Green等人(2003)Biological Chemistry 384,1543；J.C.Parker等人(1998)Journal of Peptide Research 52,398；C.F.Deacon等人(1998)Diabetologia 41,271；R.Burcelin等人(1999)Metabolism-Clinical and Experimental 48,252；U.Ritzel等人(1998)Journal of Endocrinology 159,93.]

還比較了A8S突變與野生型GLP-1的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特性。向大鼠靜脈內(nèi)注射1mg/kg的含野生型GLP-1(V329)的融合蛋白和含GLP-1(A8S)突變(V232)的融合蛋白，并根據(jù)給藥溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線測量血清水平。當(dāng)用人FGF21-反應(yīng)性ELISA試劑盒測量時(shí)，分子似乎表現(xiàn)出彼此相似和與連接了相同大小(40kDa)PEG的單獨(dú)的FGF21相似的行為(圖2)。為了測量GLP-1活性的半壽期延長，用含有野生型GLP-1或GLP-1(A8S)的相同的兩種雙功能蛋白質(zhì)變體注射C57BL/6J小鼠。盡管兩者在給藥后都使餐后葡萄糖水平急性降低，但在給藥3天后的口服葡萄糖耐受測試(OGTT)測量中，GLP-1(A8S)變體保持了較大的活性(圖3)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，A8S突變?cè)黾恿巳诤衔锏腉LP-1部分的有效半壽期，同時(shí)FGF21部分的PK不太受添加GLP-1的影響。

設(shè)計(jì)在GLP-1和FGF21之間的肽接頭：測試3、8、10或20個(gè)氨基酸的接頭。在具有不同接頭的變體中，沒有觀察到任何顯著的活性差異，盡管在一些融合物環(huán)境下，表達(dá)產(chǎn)量存在差異。此外，用各種長度GLP-1(8至31個(gè)殘基)或毒蜥外泌肽-4(30或更多個(gè)殘基)的測試構(gòu)建體，并在基于GLP-1R細(xì)胞的測定中測試體外活性。

實(shí)施例2:在ob/ob和db/db糖尿病小鼠模型中測試融合物

FGF21已表現(xiàn)出改善2型糖尿病(T2D)的ob/ob小鼠模型的血糖水平、肝脂類水平和體重(參見例如，A.Kharitonenkov等人(2005)Journal of Clinical Investigation 115,1627；T.Coskun等人(2008)Endocrinology 149,6018；和E.D.Berglund等人(2009)Endocrinology 150,4084)。同樣的，在該遺傳性小鼠糖尿病模型中，GLP-1類似物已表現(xiàn)出改善葡萄糖控制、β細(xì)胞功能和肝臟健康(Gallwitz B.,Glucagon-like peptide-1as a treatment option for type 2diabetes and its role in restoringβ-cell mass.Diabetes Technol Ther.2005,7:651-7)。

為了確定GLP-1與FGF21的融合物是否導(dǎo)致額外的功效，測試WT GLP-1和GLP-1(A8S)形態(tài)與等價(jià)的FGF21分子，每者連接了相同的40kDa分枝的PEG。在每周給藥2次、為期2周的研究中，F(xiàn)GF21(R154C)-PEG(V238)和GLP-1-FGF21(R154C)-PEG(V239)表現(xiàn)出對(duì)血糖、體重和肝臟健康(由丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)血清水平、重量和表觀進(jìn)行評(píng)估)相似的效果(圖4)。在第一次給藥后，葡萄糖測量表現(xiàn)出融合物比單獨(dú)的FGF21更快速的改善。兩者在給藥后超過1天的時(shí)間點(diǎn)匯合，提示由GLP-1造成的額外益處比FGF21的效力存在時(shí)間短。

GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG(V235)融合物也在0.2mg/kg，而非其他化合物使用的1mg/kg表現(xiàn)出相似的效果。該化合物一般也在給藥間產(chǎn)生更一致的結(jié)果，提示了相比GLP-1-FGF21(R154C)-PEG(V239)的升降行為，DPP-4-抗性對(duì)效力的整體改善是關(guān)鍵性的。還觀察到在1mg/kg的GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG(V235)表現(xiàn)出額外地降低葡萄糖、體重、ALT/AST，和肝重量。

還繼續(xù)了其他的研究，觀察共同施用單獨(dú)的FGF21和GLP-1化合物是否可以復(fù)制改善的效力。為了使組間蛋白質(zhì)給藥相似，制備了這樣的工具化合物，其中從FGF21的C-末端去除了14個(gè)氨基酸。相比其他的融合物，該分子(V253)在FGF21受體測定法中的效價(jià)低至少1000x但在GLP-1R測定法中卻保持了相等的效價(jià)，且不能抑制野生型FGF21活性。當(dāng)通過FGF21水平評(píng)估時(shí)，該化合物在大鼠中具有與其他融合物相似的藥代動(dòng)力學(xué)(圖2)。

圖5顯示了在用FGF21(V76)-PEG、GLP-1(A8S)-PEG(V253)、兩者共同、或GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG融合物(V272)治療的ob/ob小鼠中，為期4周的研究結(jié)果。融合物比共同施用單獨(dú)的FGF21(V76)-PEG和GLP-1(A8S)-PEG分子對(duì)于餐后葡萄糖AUC、OGTT葡萄糖AUC、研究結(jié)束時(shí)的體重、肝脂質(zhì)含量和ALT測量值顯著更有效(全部p值<0.05)。

檢測末梢血清樣品中的人FGF21和GLP-1的血清暴露以驗(yàn)證多個(gè)組的暴露。在所有的治療組中都檢測到了人FGF21，并在所有用GLP-1(A8S)-PEG(V253)或GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)治療的組中都測量到了活性GLP-1的顯著增加。GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)組表現(xiàn)出與0.2mg/kg FGF21(V76)-PEG組相似的人FGF21水平，提示改善的效力不是由于融合物在動(dòng)物體內(nèi)更高的全身性積累。GLP-1(A8S)-PEG(V253)分子在體外是完全活性的(表8)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，融合物的效力取決于單個(gè)分子中的兩個(gè)部分，并且例如受益于細(xì)胞水平的協(xié)同作用。

為了進(jìn)一步測試GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)vs.共同施用，在db/db小鼠中進(jìn)行3次研究。在每次研究中，對(duì)雄性db/db小鼠(8-11周齡)i.p.給藥，每周2次。在研究的前三周，相等劑量的雙功能融合蛋白GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)與共同施用的葡萄糖降低等同并優(yōu)于單個(gè)實(shí)體給藥的功效。雙功能融合蛋白還表現(xiàn)出更優(yōu)秀的體重減輕。

在第2個(gè)為期2周的研究中，GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)表現(xiàn)出與劑量高25倍的FGF21(V76)-PEG和劑量高5倍的GLP-1(A8S)-PEG(V253)相似的葡萄糖降低。此外，GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)對(duì)HbA1c的降低和對(duì)體重的降低都顯著超過了單一療法或共同施用組的最大有效劑量(圖8，表2)。預(yù)料不到的是，將共同治療的給藥比例改變至大于1:1也沒有改善觀察到的功效(表2)。這提示，包括等量GLP-1部分和FGF21部分的雙功能蛋白質(zhì)可以在體內(nèi)治療中實(shí)現(xiàn)最佳功效。

表2.治療劑量

¹p-值vs.載體<0.05.²p-值vs.共同治療組<0.05

表2顯示了在為期2周給藥的db/db小鼠研究中，不同劑量的單一療法和共同治療相比雙功能蛋白質(zhì)的功效。報(bào)道的值是8只動(dòng)物中的測量平均值，含標(biāo)準(zhǔn)差。在為期4周的研究中，用單一療法、共同治療或雙功能融合蛋白對(duì)雄性db/db小鼠(n＝8)每周給藥2次，共計(jì)4周。在第27天，小鼠空腹，測量所有動(dòng)物的血液胰島素水平。在研究結(jié)束時(shí)，提取并測量胰腺的胰島素含量(n＝3)。GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)在從0.1-1mg/kg表現(xiàn)出強(qiáng)大的劑量應(yīng)答，對(duì)葡萄糖水平、HbA1c和體重的療效等于或優(yōu)于劑量高10倍的單獨(dú)的FGF21(V76)-PEG或GLP-1(A8S)-PEG(V253)，且改善的功效優(yōu)于共同施用的最大有效給藥。GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)還降低了血清中的空腹胰島素水平，同時(shí)使胰腺的胰島素含量增加到了大于GLP-1(A8S)-PEG(V253)和FGF21(V76)-PEG單一治療或組合治療的程度(圖7)。GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)治療的動(dòng)物在餐后葡萄糖、HbA1c和體重?cái)?shù)值上接近體重控制小鼠。

為了估計(jì)代謝速率和底物利用，使用Oxymax間接量熱系統(tǒng)(Columbus Instruments,Columbus,OH)測量了氧氣消耗和二氧化碳生產(chǎn)。小鼠飼養(yǎng)在具有12h光照/12h黑暗循環(huán)的籠中，環(huán)境溫度22–24℃。在Oxymax系統(tǒng)設(shè)置和操作程序下，確定VO₂和VCO₂速率。用標(biāo)準(zhǔn)氣體混合物校正系統(tǒng)，測量消耗的O₂(VO₂，ml/kg/h)和生成的CO₂(VCO₂，ml/kg/h)。評(píng)估72h時(shí)間段內(nèi)的代謝速率(VO₂)和呼吸交換比值(RER)(VCO₂/VO₂的比)。計(jì)算的RER值提示，相比載體或組合治療的組，用融合蛋白治療的動(dòng)物更依賴于脂類底物(RER值接近0.75-0.85)，特別是在第二次給藥后的24-72小時(shí)期間。在此時(shí)期中，載體和組合治療的組顯示RER值接近0.9，提示更多的碳水化合物底物利用用于能量和更低程度的脂質(zhì)底物利用用于能量消耗。數(shù)據(jù)提示，融合蛋白治療導(dǎo)致脂肪酸氧化增加，這可對(duì)其在db/db小鼠中的體重減輕效應(yīng)有貢獻(xiàn)。

當(dāng)與組合相比時(shí)，雙功能融合蛋白表現(xiàn)出改善的體內(nèi)β-細(xì)胞功能。在雙功能蛋白質(zhì)GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)或GLP-1(A8S)-PEG(V253)加FGF21(V76)-PEG給藥四次后，用葡萄糖和精氨酸對(duì)db/db小鼠口服給藥。雙功能蛋白質(zhì)治療組的葡萄糖波動(dòng)(低于載體72％)顯著低于組合治療的組(低于載體56％)。在實(shí)驗(yàn)過程中，雙功能蛋白質(zhì)治療的組的分泌的胰島素的量(高于載體279％)也高于組合治療的組(高于載體122％)。

綜上所述，圖、表和本文未顯示的數(shù)據(jù)證實(shí)了，相比單獨(dú)的GLP-1和FGF21的組合(例如FGF21(V76)-PEG和GLP-1(A8S)-PEG(V253))，本發(fā)明的雙功能融合蛋白(例如GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272))改善體外和體內(nèi)嚙齒類糖尿病模型中的代謝參數(shù)的能力。所述改善的參數(shù)(如本文使用的“代謝參數(shù)”)包括但不限于餐后葡萄糖(AUC)、體重、肝甘油三酯、血漿HbA1c、血清甘油三酯水平、總膽固醇水平，口服糖耐受測試的血清葡萄糖測量值(AUC)、空腹血清胰島素、胰腺胰島素含量，和體脂百分比。

實(shí)施例3：從FGF21變體設(shè)計(jì)本發(fā)明的GLP-1/蛋白質(zhì)

用下列FGF21變體序列制備融合物，所述變體在本文中被稱為“變體76”或“V76”：

FGF21(V76)-PEG的特征是通過Cys154連接的40kDa分枝的PEG，和相對(duì)于177個(gè)氨基酸的野生型蛋白質(zhì)的8個(gè)點(diǎn)突變(Q56E、D74H、Q82E、R105K、K150R、R154C、R159Q、S195A，都是相對(duì)于全長FGF21蛋白序列(NCBI參考序列號(hào)NP_061986.1)進(jìn)行的)?；趯?duì)人T細(xì)胞應(yīng)答的EpiScreen時(shí)間過程測定法，該分子的臨床免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)被認(rèn)為是低的。在每周兩次注射1mg/kg的情況下，分子在小鼠和大鼠中具有大于30h的血清半壽期，并且在ob/ob小鼠中顯著降低葡萄糖AUC。

以3種劑量(0.05、0.1和0.2mg/kg)測試GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)分子和GLP-1(A8S)-FGF21(R154C)-PEG(V235)融合物。兩種融合物在降低葡萄糖AUC、體重、食物攝入和ALT中都表現(xiàn)出劑量應(yīng)答(圖6)。在0.2mg/kg劑量時(shí)，GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)一般是相等或更好的，并且對(duì)所有參數(shù)都表現(xiàn)出更高的功效。在0.1和0.2mg/kg時(shí)，GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)也表現(xiàn)出降低血清甘油三酯和膽固醇。基于這些數(shù)據(jù)，GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)分子顯示出與初始融合物相似的或改良的特性，并且適用于進(jìn)一步的研究和開發(fā)。

在ob/ob 2周的研究中，Ex4(1-30)-L20-FGF21(V76)-PEG(V277)也表現(xiàn)出與GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)相似的葡萄糖控制、體重和脂類水平的功效。

選擇用于延長半壽期的PEG化位點(diǎn)。例如圖2所見，使用PEG化延長分子的半壽期，如在大鼠中測量的，將GLP-1的數(shù)分鐘或FGF21的少于半小時(shí)延長至大于30個(gè)小時(shí)。為了觀察融合物的兩個(gè)部分是否能受PEG放置的調(diào)控，構(gòu)建一系列構(gòu)建體，其中額外的半胱氨酸不在FGF21序列中而在GLP-1序列或接頭中。在基于細(xì)胞的測定法中，測試這些構(gòu)建體的GLP-1和FGF21活性。實(shí)驗(yàn)揭示了融合蛋白序列中的一段位置，在所述位置上的PEG化不重大地影響兩者之中每者的活性。在該段的N-末端仔細(xì)放置PEG，可用于制備具有敲低的GLP-1活性的分子，而放置在接頭中則可用于敲低FGF21活性。這類分子可用于調(diào)和融合物的效價(jià)(例如，如果高效價(jià)的GLP-1或毒蜥外泌肽-4導(dǎo)致低下的治療窗口，當(dāng)以較低效價(jià)FGF21的有效水平給藥時(shí))。

基于這些數(shù)據(jù)，用序列如下的FGF21(V76-C154R)制備在GLP-1(V273)的K34C處或毒蜥外泌肽-4(V274)的K27C處具有PEG化的融合物：

在ob/ob小鼠中為期2周的研究證實(shí)，雖然新的融合物(V273和V274)表現(xiàn)出與之前的融合物相似的體外效價(jià)，和在大鼠中相似的藥代動(dòng)力學(xué)，但其在體內(nèi)效果較差，在0.2mg/kg時(shí)，GLP-1融合物變體對(duì)葡萄糖或體重沒有表現(xiàn)出任何顯著的功效。相比載體，毒蜥外泌肽-4融合變體表現(xiàn)出顯著降低ALT和體重，和降低AST的傾向，但對(duì)血糖沒有顯著的效果。雖然這些融合物可以在更高劑量下表現(xiàn)出功效，但仍選擇在FGF21的R154C上PEG化的原始模式進(jìn)行進(jìn)一步研究。不清楚的是，這一預(yù)料之外的差異是否提示了被交替的位點(diǎn)處的PEG化阻斷的融合物的GLP-1(A8S)-FGF21(V76-154R)-PEG形態(tài)的特殊性質(zhì)，或者是否存在其他解釋，如PEG對(duì)GLP-1R相互作用的阻斷在具有天然受體水平的天然細(xì)胞上比在體外測定法中使用的轉(zhuǎn)染細(xì)胞上更高。

實(shí)施例4：進(jìn)一步表征本發(fā)明的GLP-1/FGF21蛋白

為了進(jìn)一步優(yōu)化和分級(jí)本發(fā)明的GLP-1-FGF21-PEG雙活性蛋白質(zhì)，和為了獲得對(duì)其相比共同施用模型改善的功效的更全面理解，在功效的ob/ob模型中測試融合物。這些融合物包括但不限于這樣的分子，所述分子具有改善血清穩(wěn)定性或活性的更長或更短接頭、本發(fā)明的其他蛋白質(zhì)(可包括但不限于基于變體76的突變體，或研發(fā)中的其他變體，如額外的或不同的點(diǎn)突變、插入或缺失、二聚體化分子、備選的PEG化對(duì)策、具有額外的二硫鍵的分子、在不同的表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)的分子)，和毒蜥外泌肽-4或GLP-1的變體。還通過計(jì)算機(jī)免疫原性預(yù)測、表達(dá)水平和終產(chǎn)物品質(zhì)(與溶解度、聚集作用和穩(wěn)定性相關(guān))過濾候選物。

為了進(jìn)一步表征FGF21和GLP-1用于治療糖尿病和肥胖的協(xié)同作用，定位了兩個(gè)分子的相互作用動(dòng)力學(xué)，并比較融合蛋白與單個(gè)親本分子的最大有效共同施用。在關(guān)注肥胖和體重減輕的模型(在大鼠或小鼠中膳食誘導(dǎo)的肥胖)中，和在糖尿病各方面(如高血糖、血脂異常和受損的β細(xì)胞功能)的更好的模型中(ob/ob或db/db小鼠)進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)?？梢酝ㄟ^定位各單體分子的功效、兩者以不同比例的組合，和融合物，進(jìn)一步確定本發(fā)明的雙活性蛋白質(zhì)的協(xié)同程度。

在用原代或永生化的大鼠胰島和原代人胰島的基于細(xì)胞的測定法中進(jìn)行測試，評(píng)估融合物對(duì)細(xì)胞增殖、保護(hù)免于凋亡，和功能的效果，例如以在接受的1型糖尿病模型中驗(yàn)證本發(fā)明的雙活性蛋白質(zhì)(還參見Van Belle,T.L.等人Drug Discovery today:disease models.209.第41-45頁)。優(yōu)選的體內(nèi)模型是以下模型，其特征是用鏈脲霉素(STZ)的胰腺消融；在遺傳修飾的和誘導(dǎo)型小鼠品系(RIP-DTA)中靶向的β-細(xì)胞消融，其中β-細(xì)胞被膳食中補(bǔ)充的誘導(dǎo)白喉毒素的靶向表達(dá)的強(qiáng)力霉素破壞；或具有自身免疫機(jī)制的1型糖尿病的非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型。在這些模型中，既可以進(jìn)行預(yù)防性給藥以評(píng)估β-細(xì)胞保護(hù)作用(特別是在NOD中)，也可以進(jìn)行刺激后給藥以評(píng)估β-細(xì)胞刺激作用和增殖(特別是在STZ和RIP-DTA中)。

進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)，以更全面的認(rèn)識(shí)相比共同施用方案由本發(fā)明的雙活性蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)的功效協(xié)同機(jī)制：可以使用用兩種受體(GLP-1R；FGFR1(IIIc)、2(IIIc)、3(IIIc)或4；和β-klotho)共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，確定受體是否能夠加強(qiáng)細(xì)胞表面的對(duì)立信號(hào)。在天然表達(dá)兩種受體的細(xì)胞(例如β細(xì)胞)中，可以檢測到下游信號(hào)之間的交流。在動(dòng)物中，可以更深入的研究食物攝入(用成對(duì)喂食組研究)、增加的代謝速率(在膜片鉗和代謝房實(shí)驗(yàn)中研究)和其他機(jī)制的貢獻(xiàn)，以闡述兩種信號(hào)的協(xié)同效應(yīng)的作用模式。為了闡述融合蛋白的獨(dú)特的信號(hào)傳遞，潛在地解釋其改善的功效，還可以進(jìn)行關(guān)鍵組織(肝、胰腺、脂肪、腸、心臟、主動(dòng)脈、腦等)的基因表達(dá)制譜。

進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)以理解本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)控制或修飾充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分化的活性：可以僅用本發(fā)明的蛋白質(zhì)，或用已知誘導(dǎo)骨生成的化合物或化合物的混合物，或用已知誘導(dǎo)脂肪生成的化合物或化合物的混合物處理MSC，并可以測量所獲得的成骨細(xì)胞樣細(xì)胞或脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞的分化速率。

實(shí)施例5：從Fc-融合物FGF21變體設(shè)計(jì)本發(fā)明的含有GLP-1和毒蜥外泌肽-4的蛋白質(zhì)

用備選的接頭(例如，SGGGGSGGGGSGGGGSA(SEQ ID NO:138)、GGGGS(SEQ ID NO:173)、GG和GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:174))、FGF21變體和GLP-1-相關(guān)的肽制備構(gòu)建體。通常在HEK293細(xì)胞中表達(dá)含有Fc結(jié)構(gòu)域的雙功能蛋白質(zhì)。將這些融合物的DNA編碼序列克隆到載體中，所述載體含有編碼指導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌的前導(dǎo)肽的序列，并且還含有促進(jìn)理想產(chǎn)物的mRNA合成和蛋白質(zhì)表達(dá)所必需的序列。用載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。收集來自這些細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基，過濾，并通過蛋白A親和層析純化。使洗脫液成為中性pH，并通過尺寸排阻層析進(jìn)一步純化。然后濃縮和儲(chǔ)藏產(chǎn)物，用于多種測定法。在四種測定法中測試變體的體外活性：在用GLP-1R轉(zhuǎn)染的HEK293中CRE-熒光素酶表達(dá)誘導(dǎo)(表3)和在INS1E細(xì)胞中葡萄糖刺激的胰島素分泌(表6)以通過GLP-1R測量活性；在用β-klotho轉(zhuǎn)染的HEK293中ERK磷酸化誘導(dǎo)(表4)和3T3L1細(xì)胞的2-脫氧葡萄糖攝入(表5)以測量FGF21活性。具有GLP-1(A8S)和15個(gè)氨基酸接頭的變體比具有GLP-1和較短接頭的變體更有活性。測試的具有所有接頭的毒蜥外泌肽-4(1-39)變體都是有活性的。含有毒蜥外泌肽-4(1-30)的變體與含有毒蜥外泌肽-4(1-39)的構(gòu)建體具有相似的體外效價(jià)。具有串聯(lián)重復(fù)的毒蜥外泌肽-4(1-39)的變體不如具有單拷貝的GLP-1-相關(guān)肽的變體有效力。

表3.在HEK293-GLP-1R-CRE-熒光素酶報(bào)告子細(xì)胞中的GLP-1R活化

表4.在HEK293-KLB細(xì)胞的FGF21活性的ERK磷酸化測定法中測量的活性

表5.在3T3L1小鼠脂肪細(xì)胞的2-脫氧葡萄糖攝入中測量的活性

表6.在INS1E大鼠胰島素瘤細(xì)胞中通過葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)測量的活性

用0.5mg/kg變體給藥8只ob/ob小鼠，每周2次，共計(jì)2周。在研究過程中，測量血糖和體重，在研究結(jié)束時(shí)，測量肝脂類。如下表可見(表7)，在整個(gè)研究中，相比載體處理的年齡匹配的動(dòng)物，治療的動(dòng)物具有降低的血糖、較低的體重和較低的肝脂類。

表7. 0.5mg/kg治療ob/ob小鼠，每周2次，共計(jì)2周的結(jié)果概述

^*p-值vs.載體<0.05

實(shí)施例6：在受體藥理學(xué)測定法中進(jìn)一步表征本發(fā)明的蛋白質(zhì)

例如圖9可見，在用β-klotho轉(zhuǎn)染的HEK293中，比較本發(fā)明的雙重激動(dòng)劑蛋白質(zhì)與多種形式的FGF21和艾塞那肽誘導(dǎo)ERK磷酸化的能力。在10分鐘，當(dāng)與用FGF21(V76)-PEG加艾塞那肽處理的細(xì)胞相比時(shí)，用GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)處理的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的效價(jià)和更高的磷酸-ERK比總ERK的最大比例。更高的最大磷酸-ERK信號(hào)顯示出相比FGF21(V76)-PEG分子，雙功能蛋白質(zhì)V272是用于經(jīng)過FGFR1c/β-klotho信號(hào)傳遞的更優(yōu)秀的激動(dòng)劑，可能是由于與受體更好的相互作用(例如，N-末端延伸導(dǎo)致雙功能蛋白質(zhì)獲得了更有利的用于受體結(jié)合或激活的結(jié)構(gòu))。

測試選擇的雙功能蛋白質(zhì)在人脂肪細(xì)胞中誘導(dǎo)磷酸-ERK信號(hào)傳遞的能力。相比單功能FGF21分子(V101)，雙功能蛋白質(zhì)V208、V209、V211、V14和V272更有效地刺激ERK的磷酸化。因?yàn)槭侨思?xì)胞，因此還可以提示相比包括其他FGF21模擬物的治療，本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)在人類疾病的治療中是高活性的，與迄今為止在嚙齒類中證實(shí)的活性相似。

例如表8和圖10可見，比較本發(fā)明的雙重激動(dòng)劑蛋白質(zhì)與艾塞那肽、GLP-1肽、毒蜥外泌肽-4(1-39)-L5-Fc(V201)，和GLP-1(A8S)-PEG(V253)在用GLP-1R轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞或用GLP-1R、β-klotho和FGFR1c共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中通過GLP-1R傳遞信號(hào)的能力。用化合物處理細(xì)胞30分鐘，測量cAMP水平。表8顯示，在含有GLP-1R和FGF21受體復(fù)合物的細(xì)胞中，雙重激動(dòng)劑蛋白質(zhì)(V272和V211)表現(xiàn)出比單獨(dú)的單個(gè)激動(dòng)劑(V253和V101)或與毒蜥外泌肽-4的組合更高的效價(jià)。在僅含GLP-1R的細(xì)胞中，單獨(dú)的單個(gè)激動(dòng)劑或與毒蜥外泌肽-4的組合的效價(jià)等于雙重激動(dòng)劑蛋白質(zhì)。在測定法中，單獨(dú)的FGF21變體是失活的。

表8.用本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)處理的細(xì)胞中的cAMP誘導(dǎo)測定

在Discoverx的PathHunder測定模式中生成兩個(gè)額外的HEK293細(xì)胞系，所述細(xì)胞系利用β-半乳糖苷酶片段對(duì)β-抑制蛋白和GLP-1R的C-末端的互補(bǔ)作用以在受體激活后測量對(duì)抑制蛋白的招募。圖10a-10d顯示，用蛋白質(zhì)或肽孵育細(xì)胞1小時(shí)，GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)、毒蜥外泌肽-4(1-39)-L15-Fc-L15-FGF21(V103)(V211)、GLP-1(A8S)-PEG(V253)和毒蜥外泌肽-4(1-39)-L5-Fc(V201)不如艾塞那肽有效招募β-抑制蛋白，且不論細(xì)胞含有GLP-1R/FGFR1c/β-klotho或單獨(dú)的GLP-1R，注意到行為并無差異。

此處展示的受體藥理學(xué)研究提示，本發(fā)明的雙功能蛋白質(zhì)的活性和功效比常規(guī)FGF21和GLP-1/艾塞那肽分子的組合或共同治療更優(yōu)秀。PEG化的雙功能蛋白質(zhì)GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)令人驚訝的表現(xiàn)出比FGF21(V76)-PEG分子更高的磷酸-ERK誘導(dǎo)效價(jià)和最大信號(hào)。這些數(shù)據(jù)顯示，相比其他FGF21變體，雙功能蛋白質(zhì)的FGF21信號(hào)傳遞相等或更優(yōu)秀。同樣的，當(dāng)細(xì)胞表達(dá)GLP-1和FGF21受體時(shí)，雙功能蛋白質(zhì)對(duì)GLP-1R下游的cAMP信號(hào)傳遞表現(xiàn)出更高的效價(jià)。這些特性可以反映在受體之間的直接相互作用或間接效應(yīng)，如通過對(duì)兩種受體的親合力增強(qiáng)局部濃度。這些觀察結(jié)果提示了雙功能蛋白質(zhì)的改善的活性的機(jī)制，所述機(jī)制可以解釋為何單獨(dú)的GLP-1和FGF21變體的共同治療不足以匹配雙功能蛋白質(zhì)的體內(nèi)功效，如本發(fā)明的其他實(shí)例中所示。

實(shí)施例7：在1型糖尿病(T1D)模型中表征本發(fā)明的蛋白質(zhì)

用強(qiáng)力霉素治療RIP-DTA轉(zhuǎn)基因小鼠(9-10周齡)3天以誘導(dǎo)受控的β-細(xì)胞消融(與Thorel等人,Nature 2010(464)1149-1154相似)。然后，用FGF21(V76)-PEG,FGF21(V76)-PEG+GLP-1(A8S)-PEG(V253)，或GLP-1(A8S)-FGF21(V76)-PEG(V272)治療小鼠3周，每周2次。在所有3組中，治療的動(dòng)物在研究過程中都表現(xiàn)出降低的餐后葡萄糖水平。雙功能蛋白質(zhì)治療(比載體降低64％)比組合治療(比載體降低55％)導(dǎo)致顯著更低的葡萄糖AUC?？崭购?，對(duì)小鼠給予葡萄糖團(tuán)，并測量血糖波動(dòng)。與載體治療的動(dòng)物相比，所有3組治療降低了血糖水平，其中雙功能蛋白質(zhì)治療導(dǎo)致76％降低，與之相比組合治療導(dǎo)致66％降低。所有的治療組都具有比載體增加的胰腺胰島素含量，其中雙功能蛋白質(zhì)治療導(dǎo)致比組合治療高76％的胰島素含量。

用GLP-1(A8S)-FGF21(154C)-PEG(V235)或GLP-1(A8S)-PEG(V253)+FGF21(154C)-PEG(V238)治療NOD小鼠3周，每周2次。在2周后，使小鼠空腹，并給與葡萄糖團(tuán)用于OGTT。雙功能蛋白質(zhì)治療的小鼠表現(xiàn)出與載體相比顯著更低的空腹葡萄糖(載體的～60％)和在刺激過程中的葡萄糖波動(dòng)(～45％)，而組合治療的動(dòng)物具有與載體相比不顯著不同的空腹葡萄糖水平(～70％)和在刺激過程中相似的葡萄糖波動(dòng)。在研究結(jié)束時(shí)，雙功能蛋白質(zhì)治療的動(dòng)物具有比載體顯著更低的基礎(chǔ)胰高血糖素水平(～50％)，而組合治療的動(dòng)物具有與載體相似的水平。

實(shí)施例8、預(yù)測性的免疫原性結(jié)果——MHC-相關(guān)肽蛋白組學(xué)(MAPP)和T細(xì)胞測定法結(jié)果

mAb和其他治療性蛋白質(zhì)的抗藥抗體(ADA)的形成可以潛在地導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫毒性反應(yīng)，如IgE-介導(dǎo)的過敏反應(yīng)(Chung等人(2008)N Eng J Med,358,1109-17)或免疫復(fù)合物病，例如，血管炎、腎小球腎炎(Descotes和Gouraud(2008)Expert Opin Drug Metab Toxicol 4,1537-49)以及喪失臨床暴露和功效。一些用治療性蛋白質(zhì)PEG化的巨核細(xì)胞生長和發(fā)育因子(PEG-MGDF)和紅細(xì)胞生成素(EPO；Eprex)治療的患者出現(xiàn)了與其各自內(nèi)源性對(duì)應(yīng)物交叉反應(yīng)的中和性ADA，導(dǎo)致使用PEG-MGDF時(shí)嚴(yán)重的血小板減少癥，和使用Eprex時(shí)純紅細(xì)胞發(fā)育不全(Li等人(2007)Blood 98,3241-8；Casadevall等人(2002)N Engl J Med 346,469-75)。因此，重要的是在人體測試前評(píng)估免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。為臨床研發(fā)階段評(píng)估免疫原性風(fēng)險(xiǎn)和安排固相免疫原性風(fēng)險(xiǎn)緩解計(jì)劃對(duì)含有修飾性的，非人序列的治療性蛋白質(zhì)是特別重要的，如本發(fā)明主題的FGF21變體。

可以以至少2種方式誘導(dǎo)形成ADA。已描述了用于B細(xì)胞活化的T細(xì)胞依賴性和非依賴性途徑。強(qiáng)大的，高親和力IgG應(yīng)答是T細(xì)胞依賴性的并且需要涉及CD4+T輔助細(xì)胞(TH細(xì)胞)。免疫應(yīng)答與對(duì)外源抗原的應(yīng)答類似：新生的TH細(xì)胞被專門的抗原呈遞細(xì)胞(APC)(如樹突狀細(xì)胞(DC))特異性激活，并反過來誘導(dǎo)藥物特異性的B細(xì)胞活化。

MHC-相關(guān)性肽蛋白組學(xué)(MAPP)測定法涉及體外鑒別II型HLA相關(guān)肽，所述肽是專門的抗原呈遞細(xì)胞(APC)(如樹突狀細(xì)胞)所具有的?？紤]抗原攝入、加工和呈遞過程。在該方法中，在存在激活刺激的條件下，用不同的生物治療性藥物候選物孵育不同的健康血液供體的未成熟的人單核細(xì)胞來源的DC。通過液相色譜-質(zhì)譜(Kropshofer和Spindeldreher(2005)于Antigen Presenting Cells:From Mechanisms to Drug Development,編者.Kropshofer和Vogt,Wiley-VCH,Weinheim,159-98)鑒別源自生物治療性蛋白質(zhì)的天然加工的II型HLA相關(guān)肽。

T細(xì)胞測定法提供了可以評(píng)估整個(gè)蛋白質(zhì)治療劑的潛在免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的模式。T細(xì)胞測定法評(píng)估了治療性蛋白質(zhì)誘導(dǎo)CD4⁺T細(xì)胞應(yīng)答的能力。使用覆蓋了廣泛的II型HLA單體型組的健康血液供體組，測試純化的治療性蛋白質(zhì)的體外T細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞因子分泌。該技術(shù)已成功地用于比較蛋白質(zhì)變體誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答的潛力(Jones等人(2004)J Interferon Cytokine Res.24,560-72.；Jones等人(2005)J Thromb Haemost.3,991-1000)，且對(duì)目前批準(zhǔn)的單克隆抗體的這一評(píng)估確實(shí)顯示了在體外觀察到的T細(xì)胞激活和臨床免疫原性之間一定程度的相關(guān)性(Perry等人(2008)Drugs R D 9,385-96)。在本發(fā)明的上下文中，將來自代表世界群體(基于HLA的同種異型)的50名健康供體的組的外周血單核細(xì)胞(PBMC)與FGF21變體孵育，并使用增殖測定法([³H]-胸苷攝取)和IL-2細(xì)胞因子分泌(ELISpot)測量T細(xì)胞應(yīng)答。之后，分析CD4⁺T細(xì)胞應(yīng)答的頻率和幅度，以評(píng)估臨床免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。

組合使用T細(xì)胞和MAPP測定法為使用人細(xì)胞的臨床免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了有效的方法。對(duì)治療性蛋白質(zhì)候選物的這樣的修飾是有利的，所述修飾導(dǎo)致樹突細(xì)胞呈遞降低數(shù)量的肽和在T細(xì)胞測定中有應(yīng)答的供體的數(shù)量降低，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)具有較低的出現(xiàn)臨床免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。已描述降低免疫原性的蛋白質(zhì)修飾的例子是PEG化。然而，降低的免疫原性不總是隨PEG化發(fā)生(Li等人(2007)Blood 98,3241-8)。

在MAPP測定法中，所有測試的PEG化的GLP-1(A8S)和毒蜥外泌肽-4FGF21-融合物分子，包括V272(PEG化的)和V277(PEG化的)和含有Q55C、G148C突變的非PEG化的Fc-FGF21變體(V101、V103和V188)顯示了低數(shù)量的簇、和可與V76(PEG化的)相比較的和低于野生型FGF21或V76(非PEG化的)的肽長度變體。在T細(xì)胞測定法中，對(duì)于V272(PEG化的)和V277(PEG化的)和含有Q55C、G148C突變的非PEG化的Fc-FGF21變體(V101、V103和V188)而言，研究組的T細(xì)胞應(yīng)答的頻率<10％，且應(yīng)答幅度低(表10)。缺少PEG部分或缺少Q(mào)55C、G148C處的額外的二硫鍵可以對(duì)野生型FGF21和V76(非PEG化的)中所見的增加的MAPP和T細(xì)胞測定法應(yīng)答有貢獻(xiàn)(表9和10)?；贛APP和T細(xì)胞測定法的結(jié)果，可以認(rèn)為在臨床中出現(xiàn)免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)對(duì)于V76(PEG化的)、V272(PEG化的)、V277(PEG化的)和含有Q55C、G148C突變的非PEG化的Fc-FGF21變體(V101、V103、V188)而言是低的。已知向蛋白質(zhì)添加二硫鍵可以增強(qiáng)它的蛋白水解穩(wěn)定性且含有Q55C、G148C突變的Fc-FGF21變體的這一特征可以對(duì)MAPP測定法中由負(fù)載抗原的成熟樹突細(xì)胞所展示的肽的數(shù)量降低有貢獻(xiàn)。

此外，可以用導(dǎo)致分子二聚化并從而影響抗原加工和呈遞的游離半胱氨酸解釋測定法中對(duì)非PEG化的V76增加的MAPP應(yīng)答。這與具有導(dǎo)入的游離半胱氨酸的野生型FGF21表現(xiàn)出相同的二聚化傾向并導(dǎo)致增加的肽呈遞的觀察結(jié)果是一致的。額外的PEG化的雙功能蛋白質(zhì)，和含有Q55C、G148C突變的GLP-1(A8S)-Fc-FGF21變體(V202、V203、V212、V213、V214、V215、V216、V218等)和毒蜥外泌肽-4-Fc-FGF21變體(V196、V197、V198、V199、V206、V207、V208、V209、V210、V211等)可能也表現(xiàn)出與臨床中出現(xiàn)免疫原性的低風(fēng)險(xiǎn)相一致的MAPP和T細(xì)胞測定應(yīng)答。

表9.用野生型FGF21、V76(非PEG化的)和V76(PEG化的)實(shí)驗(yàn)的T細(xì)胞測定法概述

表10.用V76(PEG化的)、V272(PEG化的)、V277(PEG化的)、V101、V103和V188實(shí)驗(yàn)的T細(xì)胞測定法概述