本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種人類circRNA過表達(dá)載體框架、過表達(dá)載體及其制備方法。

背景技術(shù)：

環(huán)狀RNA(circRNA)廣泛且多樣地存在于多種生物細(xì)胞中，是具有調(diào)控基因表達(dá)作用的一類內(nèi)源性ncRNA分子。最早于20世紀(jì)70年代在RNA病毒中被發(fā)現(xiàn)。之后幾十年，人們在一些轉(zhuǎn)錄本中也發(fā)現(xiàn)了一些由外顯子構(gòu)成的circRNA，如結(jié)腸直腸癌缺失基因轉(zhuǎn)錄本、人類Ets-1基因轉(zhuǎn)錄本等，但當(dāng)時它們被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄的“噪音”，未引起人們太多的關(guān)注。而近年來，隨著生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，Salzman等、Jeck等、Memczak等及Guo等分別在人類和小鼠的多種細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了成千上萬種circRNA。目前發(fā)現(xiàn)的circRNA，根據(jù)其在基因組中的來源及其構(gòu)成序列的不同，可以分為3類：外顯子來源的環(huán)形RNA分子，內(nèi)含子來源的環(huán)形RNA分子和由外顯子和內(nèi)含子共同組成的環(huán)形RNA分子。

CircRNA具有以下特征：表達(dá)水平差異較大；具有序列保守性；偏好于細(xì)胞漿中；不易被核酸外切酶RNase R降解；外顯子來源為主；屬于ncRNA；可充當(dāng)ceRNA的角色調(diào)控靶基因的表達(dá)；在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用。這些特征使得circRNA在研究疾病發(fā)生機(jī)制、干預(yù)靶點(diǎn)和生物學(xué)標(biāo)志物等方面顯示顯著優(yōu)勢。

研究表明，circRNA在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平具有以下非常重要的基因表達(dá)調(diào)控作用。(1)miRNA海綿作用：小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(antisense to the cerebellar degeneration-related protin 1transcript，CDR1as)是一種circRNA，擁有至少60個與微小RNA-7(microRNA-7，miR-7)相結(jié)合的保守結(jié)合位點(diǎn)，從而充當(dāng)miR-7海綿，有效影響miR-7靶基因活性。此外，研究發(fā)現(xiàn)，睪丸特異性基因Sry的circRNA具有16個微小RNA-138的靶位點(diǎn)，可與miR-138相互作用，充當(dāng)miR-138海綿。(2)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄：Zhang等鑒定出一種來源于基因內(nèi)含子區(qū)域的circRNA，發(fā)現(xiàn)這種circRNA分子在細(xì)胞核內(nèi)含量豐富，可參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。(3)調(diào)控RNA結(jié)合蛋白：Bohjanen等設(shè)計了一種能夠特異地結(jié)合反式激活調(diào)控蛋白(transactivating regulatory protein，Tat)的circRNA分子，從而抑制I型人類免疫缺陷病毒1(HIV-1)基因的表達(dá)。(4)參與部分蛋白質(zhì)翻譯：丁型肝炎病毒(hepatitis D virus antigen，HDAg)在疾病發(fā)展中起到重要的作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)，人頭骨瘤細(xì)胞U2OS中，circRNA具有翻譯功能，盡管其翻譯效率非常低。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)及基因芯片技術(shù)的高速發(fā)展，研究者們在真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了越來越多的circRNA。如Salzman等發(fā)現(xiàn)了數(shù)以百計的與人類基因表達(dá)相關(guān)的circRNA。Jeck等在人類成纖維細(xì)胞中檢測到了高達(dá)25000多種circRNA。Danan等又發(fā)現(xiàn)了生物體內(nèi)circRNA的各種特性。同時，人們在認(rèn)識circRNA的結(jié)構(gòu)時候，發(fā)現(xiàn)它們在疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。如circRNA與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、動脈粥樣硬化、糖尿病及病毒性肝炎等有關(guān)，因此，circRNA作為分子標(biāo)記物的診斷價值在疾病的發(fā)現(xiàn)和治療中發(fā)揮著巨大作用。然而，circRNA在生物體內(nèi)發(fā)揮的功能及分子作用機(jī)制的研究卻非常少。目前的研究中，僅僅明確了circRNA具有吸附miRNA的海綿作用、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄等作用。

研究發(fā)現(xiàn)，在敲除或干擾調(diào)控circRNA相關(guān)基因時，機(jī)體內(nèi)circRNA的表達(dá)水平受到不同程度的抑制。Agnieszka等(2015)研究發(fā)現(xiàn)，隨著人和小鼠大腦神經(jīng)元的分化，機(jī)體內(nèi)circRNA水平均能上調(diào)。同時，敲除了circRNA負(fù)調(diào)控基因ADAR1能提高circRNA的表達(dá)量。Xu等(2015)利用毛喉素和PMA較長時間誘導(dǎo)處理人和小鼠胰島細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Cdr1as呈現(xiàn)不同程度的高表達(dá)，相反，用高糖溶液處理卻使Cdr1as表達(dá)水平降低。同時，在機(jī)體內(nèi)加入pCDNA3-CIRS-7重組載體過表達(dá)Cdr1as能顯著提高胰島素的含量及分泌水平。Kramer等(2015)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子重復(fù)序列和反式拼接因子能提高果蠅laccase2環(huán)化水平，同時在人和小鼠細(xì)胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)laccase 2側(cè)翼內(nèi)含子序列能夠增加不同外顯子的環(huán)化效率。雖然pCDNA3-CIRS-7外源表達(dá)載體已成功地運(yùn)用到科學(xué)研究中，且Kramer等(2015)也初步闡述了circRNA環(huán)化的分子機(jī)制，但是想要進(jìn)一步明確circRNA在生物體內(nèi)的形成機(jī)制及發(fā)揮的功能仍需要更多的其他circRNA相關(guān)數(shù)據(jù)來佐證。

因此，circRNA過表達(dá)載體是研究circRNA功能機(jī)制的必不可少的工具。現(xiàn)有pCDNA3-CIRS-7過表達(dá)載體、laccase 2基因的過表達(dá)載體等，僅能用于一種circRNA的過表達(dá)，現(xiàn)有技術(shù)中并沒有一個通用載體能表達(dá)人類的所有circRNA。因此，提供一種能過表達(dá)人類circRNA的通用載體有利于circRNA功能機(jī)制的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種人類circRNA過表達(dá)載體框架、過表達(dá)載體及其制備方法。

一種人類circRNA過表達(dá)載體框架，包含啟動子-反向互補(bǔ)反應(yīng)上游元件-多克隆位點(diǎn)-反向互補(bǔ)反應(yīng)下游元件-終止子，所述反向互補(bǔ)反應(yīng)上游元件的序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向互補(bǔ)反應(yīng)下游元件的序列如SEQ ID NO：2所示。

優(yōu)選地，所述啟動子為pCMV，所述終止子為BGH pA。

優(yōu)選地，所述多克隆位點(diǎn)依次包含第一酶切位點(diǎn)、填充序列和第二酶切位點(diǎn)。

優(yōu)選地，第一酶切位點(diǎn)為BamHⅠ，第二酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ。

一種人類circRNA過表達(dá)載體，以目的circRNA的基因序列替換上述人類circRNA過表達(dá)載體中的填充序列。

優(yōu)選地，所述目的circRNA的基因序列的長度為100-5000bp。

所述人類circRNA過表達(dá)載體框架的制備方法，包含以下步驟：

S1、采用基因合成的方式直接合成反向互補(bǔ)反應(yīng)上游元件-含第一、第二酶切位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)-反向互補(bǔ)反應(yīng)下游元件，得到核心元件，在其上游添加第三酶切位點(diǎn)，在其下游添加第四酶切位點(diǎn)；

S2、雙酶切pCDA 3.1載體和含有第三、四酶切位點(diǎn)的核心元件，用連接酶將核心元件連入pCDA 3.1載體中CMV啟動子下游，測序驗(yàn)證正確得到人類circRNA過表達(dá)載體框架。

優(yōu)選地，所述第三酶切位點(diǎn)為HindIII，所述第四酶切位點(diǎn)為Xhol。

所述人類circRNA過表達(dá)載體的制備方法，包含以下步驟：使用含有第一酶切位點(diǎn)、內(nèi)含子AG受體的上游引物以及含有第二酶切位點(diǎn)、內(nèi)含子GT供體的下游引物，PCR擴(kuò)增目的circRNA的基因序列，雙酶切人類circRNA過表達(dá)載體框架和目的circRNA的基因序列，用連接酶將目的circRNA的基因序列連入人類circRNA過表達(dá)載體框架。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明中構(gòu)建的人類circRNA過表達(dá)載體，可以通用表達(dá)所有人類circRNA。本發(fā)明中通過反向互補(bǔ)反應(yīng)上、下游元件的反向互補(bǔ)環(huán)化，反向互補(bǔ)上、反向互補(bǔ)反應(yīng)下游元件各有多個ALU序列，更能保證環(huán)化效率，提高circRNA表達(dá)效率。

附圖說明

圖1為circRNA過表達(dá)載體框架模式圖。

圖2為circRNA_100146基因結(jié)構(gòu)模式圖。

圖3為circRNA_100146基因上下游ALU重復(fù)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖4為實(shí)施例2中擴(kuò)增后circRNA_2371的PCR產(chǎn)物電泳圖。其中，maker采用1kb Plus DNA marker；a為circRNA_2371。

圖5為實(shí)施例2中菌落PCR鑒定電泳圖。其中，maker為DL500maker，a、b、c、d均為pcircRNA 1.1-circRNA_2371。

圖6為實(shí)施例2中pcircRNA 1.1-circRNA_2371的qPCR相對定量圖。

圖7為實(shí)施例2中pcircRNA 1.1-circRNA_2371表達(dá)的circRNA_2371測序結(jié)果圖。

圖8為實(shí)施例3中擴(kuò)增后circRNA_2373的PCR產(chǎn)物電泳圖。其中，maker采用DL2000 DNA marker；a為circRNA_2373。

圖9為實(shí)施例3中菌落PCR鑒定電泳圖。其中，maker為DL500maker，a、b、c、d均為pcircRNA 1.1-circRNA_2373。

圖10為實(shí)施例3中pcircRNA 1.1-circRNA_2373的qPCR相對定量圖。

圖11為實(shí)施例3中pcircRNA 1.1-circRNA_2373表達(dá)的circRNA_2373測序結(jié)果圖。

圖12為實(shí)施例4中擴(kuò)增后circRNA T的PCR產(chǎn)物電泳圖。其中，maker采用DL5000DNA marker；a為circRNA_T。

圖13為實(shí)施例4中菌落PCR鑒定電泳圖。其中，maker為DL5000maker，a、b、c、d、e均為pcircRNA 1.1-circRNA_T。

圖14為實(shí)施例4中pcircRNA 1.1-circRNA_T的qPCR相對定量圖。

圖15為實(shí)施例4中pcircRNA 1.1-circRNA_T表達(dá)的circRNA_T測序結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為了更好的說明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式做進(jìn)一步說明。本發(fā)明中所用試劑或儀器均可由市場購得，使用的檢測方法等都是本領(lǐng)域所熟知的，在此不再贅述。

實(shí)施例1、人類circRNA過表達(dá)載體框架及其制備方法

一種人類circRNA過表達(dá)載體框架，以pcDNA3.1為骨架構(gòu)建，其結(jié)構(gòu)如圖1所示，包含pCMV(啟動子)-反向互補(bǔ)反應(yīng)上游元件-多克隆位點(diǎn)-反向互補(bǔ)反應(yīng)下游元件-BGH pA(終止子)。所述反向互補(bǔ)反應(yīng)上游元件的序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向互補(bǔ)反應(yīng)下游元件的序列如SEQ ID NO：2所示。

本實(shí)施例中反向互補(bǔ)反應(yīng)上、下游元件是以hsa_circRNA_100146為研究目標(biāo)開展，該circRNA宿主基因?yàn)镋ukaryotic translation initiation factor 3subunit I(EIF3I)；EIF3I是EIF3復(fù)合物的一種亞基。EIF3是最大的真核起始因子，也是最復(fù)雜的起始因子。在哺乳動物細(xì)胞中，EIF3是一個多亞基復(fù)合物，哺乳動物中存在13種不同的亞基(a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l和m)，其分子量超過了600KDa，真核翻譯起始進(jìn)程中起著核心作用。

circRNA_100146是一個雙外顯子circRNA，對其兩翼內(nèi)含子序列分析共發(fā)現(xiàn)9個ALU重復(fù)序列(上游5個，下游4個)，如圖2所示。對9個ALU重復(fù)序列(上游5個，下游4個)開展序列比對分析發(fā)現(xiàn)ALU上游-2、-1與下游+1、+2序列(具體序列分別如SEQ ID NO：3-6所示)同源性較高，具備RNA前體并形成circRNA環(huán)化反應(yīng)元件，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。因此，本實(shí)施例在circRNA_100146ALU上游-1、-2與下游+1、+2序列的基礎(chǔ)上設(shè)計得到本發(fā)明SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列作為反向互補(bǔ)反應(yīng)上、下游元件。

所述多克隆位點(diǎn)依次包含第一酶切位點(diǎn)、填充序列和第二酶切位點(diǎn)。第一酶切位點(diǎn)和第二酶切位點(diǎn)為pcDNA3.1中不含有的酶切位點(diǎn)。優(yōu)選地，本實(shí)施例中第一酶切位點(diǎn)為BamHⅠ，第二酶切位點(diǎn)為EcoRⅠ。所示填充序列由任意核苷酸組成，后續(xù)被目的circRNA的基因序列所替換。所述填充序列不宜過短或過長，過短不利于酶切，過長會增加擴(kuò)增時間。因此，本實(shí)施例中多克隆位點(diǎn)的具體序列如SEQ ID NO：7所示，具體為GGATCC(BamH I)GCG CAGGA CCG GAATTC(EcoR I)。

本實(shí)施例中circRNA過表達(dá)載體框架的制備方法，包含以下步驟：

S1、采用基因合成的方式直接合成反向互補(bǔ)反應(yīng)上游元件-多克隆位點(diǎn)(含BamH I、EcoR I)-反向互補(bǔ)反應(yīng)下游元件，得到核心元件，在其上游添加第三酶切位點(diǎn)，在其下游添加第四酶切位點(diǎn)；所述第三、四酶切位點(diǎn)為pCDA 3.1載體含有的多克隆位點(diǎn)，本實(shí)施例中優(yōu)選為HindIII和Xhol；

S2、雙酶切pCDA 3.1載體和含有第三、四酶切位點(diǎn)的核心元件，用連接酶將核心元件連入pCDA 3.1載體中CMV啟動子下游，經(jīng)測序鑒定成功，將構(gòu)建的過表達(dá)載體框架命名為pcircRNA1.1。制得的pcircRNA1.1于大腸桿菌中保藏并擴(kuò)增。

實(shí)施例2、pcircRNA1.1-circRNA_2371過表達(dá)載體及其制備方法

CircRNA_2371對應(yīng)的基因序列如SEQ ID NO：8所示，采用傳統(tǒng)酶切結(jié)合連接的方式將circRNA片段連接入pcircRNA1.1過表達(dá)載體中，即使用含有第一酶切位點(diǎn)(GCATCC)、內(nèi)含子AG受體(TCCAG)、特異性基因序列的上游引物以及含有第二酶切位點(diǎn)(GAATTC)、內(nèi)含子GT供體(GTAAGT)、特異性基因序列的下游引物，PCR擴(kuò)增目的circRNA的基因序列，雙酶切人類circRNA過表達(dá)載體框架和目的circRNA的基因序列，用連接酶將目的circRNA的基因序列連入人類circRNA過表達(dá)載體框架，便可得到pcircRNA1.1-circRNA_2371過表達(dá)載體。

具體制備方法如下：

(1)設(shè)計合成circRNA引物，擴(kuò)增circRNA_2371

擴(kuò)增體系如表1所示。

表1、擴(kuò)增體系

擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

預(yù)變性：94℃5min。變性：94℃10sec；退火：根據(jù)引物設(shè)定溫度，30sec；延伸：72℃1kb/1min；共35循環(huán)。延伸：72℃10min。保存：12℃。

擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，目標(biāo)條帶約360bp，結(jié)果如圖4所示。擴(kuò)增產(chǎn)物回收、純化按照上海美吉生物醫(yī)藥有限公司膠中DNA回收試劑盒(AE-HSCH)操作說明回收PCR產(chǎn)物。

(2)提取pcircRNA1.1過表達(dá)載體

按照生工生物工程有限公司SanPrep無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(B518161)操作說明從大腸桿菌提取pcircRNA1.1過表達(dá)載體。

(3)將擴(kuò)增產(chǎn)物連接入pcircRNA1.1過表達(dá)載體中

將擴(kuò)增產(chǎn)物連接入pcircRNA1.1過表達(dá)載體分別雙酶切，酶切體系如表2所示。

表2、酶切體系

按照上海美吉生物醫(yī)藥有限公司膠中DNA回收試劑盒(AE-HSCH)操作說明回收雙酶切產(chǎn)物。

連接擴(kuò)增產(chǎn)物酶切片段及pcircRNA1.1-circRNA表達(dá)載體酶切片段，16℃連接1小時，連接體系如表3所示。

表3、連接體系

連接產(chǎn)物與50μL感受態(tài)細(xì)胞混合，冰上孵育30分鐘；42℃熱激45秒；瞬間轉(zhuǎn)移至冰上孵育5分鐘；將感受態(tài)細(xì)胞與1mL SOC培養(yǎng)基混合后37℃震蕩培養(yǎng)1小時；涂板。挑取培養(yǎng)板上的單菌落(5個)，溶于20μL的無菌水中，取4μL作為模板進(jìn)行PCR。此外，分別設(shè)置一個陰性對照(加入感受態(tài)細(xì)胞)和陽性對照(加入目的基因片段)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，目標(biāo)條帶約360bp，電泳結(jié)果如圖5所示。按照生工生物工程有限公司SanPrep無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(B518161)操作說明提取陽性克隆菌內(nèi)的過表達(dá)載體，得到pcircRNA 1.1-circRNA_2371過表達(dá)載體(pCMV啟動子-反向互補(bǔ)反應(yīng)上游元件-circRNA_2371-反向互補(bǔ)反應(yīng)下游元件-BGH pA)。

將構(gòu)建成功的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后使用qPCR技術(shù)以GAPDH為內(nèi)參，以空載轉(zhuǎn)染組為空白對照檢測circRNA_2371表達(dá)上調(diào)比例。CircRNA qPCR引物為：上游引物AAACCTCGGACTTTGCTGAA(SEQ ID NO：9)，下游引物ACAGTTTTGGTGCTGCTGTG(SEQ ID NO：10)；內(nèi)參基因GAPDH qPCR引物為：上游引物AACGGATTTGGTCGTATTGGG(SEQ ID NO：11)，下游引物CCTGGAAGATGGTGATGGGAT(SEQ ID NO：12)。然后對qPCR擴(kuò)增片段結(jié)果測序驗(yàn)證circRNA_2371表達(dá)定量分析及序列拼接定性分析的正確性，結(jié)果如圖6和圖7所示。由圖6和圖7可知，pcircRNA 1.1-circRNA_2371可以過表達(dá)circRNA，上調(diào)倍數(shù)為19.6，測序驗(yàn)證序列拼接定性分析正確。

實(shí)施例3、pcircRNA1.1-circRNA_2373過表達(dá)載體及其制備方法

CircRNA_2373對應(yīng)的基因序列如SEQ ID NO：13所示，采用傳統(tǒng)酶切結(jié)合連接的方式將circRNA片段連接入pcircRNA1.1過表達(dá)載體中，便可得到pcircRNA1.1-circRNA_2373過表達(dá)載體，具體方法與實(shí)施例2相同。擴(kuò)增后及菌落鑒定的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖如圖8和圖9所示，目的片段約129bp。

將構(gòu)建成功的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后使用qPCR技術(shù)以GAPDH為內(nèi)參，以空載轉(zhuǎn)染組為空白對照檢測circRNA_2373表達(dá)上調(diào)比例。CircRNA qPCR引物為：上游引物CCACCATCCCAGCTCAG(SEQ ID NO：14)，下游引物ACAGTGCTGGTATCCGGTTC(SEQ ID NO：15)；內(nèi)參基因GAPDH qPCR引物為：上游引物AACGGATTTGGTCGTATTGGG(SEQ ID NO：11)，下游引物CCTGGAAGATGGTGATGGGAT(SEQ ID NO：12)。然后對qPCR擴(kuò)增片段結(jié)果測序驗(yàn)證circRNA_2373表達(dá)定量分析及序列拼接定性分析的正確性，結(jié)果如圖10和圖11所示。由圖10和圖11可知，pcircRNA 1.1-circRNA_2373可以過表達(dá)circRNA，上調(diào)倍數(shù)為32.2，測序驗(yàn)證序列拼接定性分析正確。

實(shí)施例4、pcircRNA1.1-circRNA_T過表達(dá)載體及其制備方法

CircRNA_T對應(yīng)的基因序列如SEQ ID NO：16所示，采用傳統(tǒng)酶切結(jié)合連接的方式將circRNA片段連接入pcircRNA1.1過表達(dá)載體中，便可得到pcircRNA1.1-circRNA_T過表達(dá)載體，具體方法與實(shí)施例2相同。擴(kuò)增后及菌落鑒定的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖如圖12和圖13所示，目的片段約766bp，其中含有載體344bp。

將構(gòu)建成功的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后使用qPCR技術(shù)以GAPDH為內(nèi)參，以空載轉(zhuǎn)染組為空白對照檢測circRNA_T表達(dá)上調(diào)比例。然后對qPCR擴(kuò)增片段結(jié)果測序驗(yàn)證circRNA_T表達(dá)定量分析及序列拼接定性分析的正確性，結(jié)果如圖14和圖15所示。由圖14和圖15可知，pcircRNA 1.1-circRNA_T可以過表達(dá)circRNA，上調(diào)倍數(shù)為29.3，測序驗(yàn)證序列拼接定性分析正確。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。