本申請是2011年5月11日提交的申請?zhí)枮?01180023543.x(pct申請?zhí)枮閜ct/us2011/036118)、發(fā)明名稱為“褐色中脈3基因特異性標志物在玉米中用于性狀基因滲入的用途”的發(fā)明專利申請的分案申請。

優(yōu)先權(quán)要求

本申請要求2010年5月12日提交的美國臨時專利申請流水號61/334,07的關(guān)于“useofbrownmidrib-3genespecificmarkersinmaizefortraitintrogression”的提交日的權(quán)益。

發(fā)明領(lǐng)域

一般而言，本公開內(nèi)容涉及植物育種。提供了用于測定含有褐色中脈3(bm3)突變的植物的接合性(zygosity)的方法。公開內(nèi)容的方法進一步可用于增強含有bmr的植物系的育種過程。

發(fā)明背景

木質(zhì)素是植物中與碳水化合物，諸如細胞壁中的半纖維素形成交聯(lián)的通用組分。木質(zhì)素聚合物在反芻類中降低纖維消化，并且木質(zhì)化的程度可以與飼料作物消化率(digestibility)成反比。cherney等(1991)adv.agron.46:157-98。含有褐色中脈(bmr)突變的玉蜀黍展現(xiàn)出與顯著降低的木質(zhì)素含量、改變的木質(zhì)素組成和改善的消化率有關(guān)的葉中脈的微紅褐色色素沉著。已經(jīng)在玉米中鑒定出至少四處獨立的bmr突變。kuc等(1968)phytochemistry7:1435-6。在與對照玉米相比時，這些突變(稱作“bm1、bm2、bm3和bm4”)都展現(xiàn)出降低的木質(zhì)素含量。bm3突變包括咖啡酸o-甲基轉(zhuǎn)移酶(comt，例如，genbank登錄號m73235)基因內(nèi)的插入(bm3-1)、缺失(bm3-2)和插入/缺失(bm3-3)。morrow等(1997)mol.breeding3:351-7；vignols等(1995)plantcell7:407-16。

comt基因控制木質(zhì)素生物合成中牽涉的酶活性。comt利用s-腺苷甲硫氨酸(adenylsylmethionine)對咖啡酸進行轉(zhuǎn)甲基化，這導致生成阿魏酸。最終，自阿魏酸生成松柏醇和芥子醇。在存在自由基的情況中松柏醇、阿魏酸和芥子醇的組合導致木質(zhì)素生成。bm3突變已經(jīng)得到表征，并且認為其通過基因滅活抑制咖啡酸的轉(zhuǎn)甲基化。guilletclaude等(2004)theor.appl.genet.110:126-35；piquemal等(2002)plantphysiology130:1-11；he等(2003)cropsci.43:2240-51；morrow等(1997)mol.breeding3:351-7；vignols等(1995)plantcell7:407-16。然而，尚未開發(fā)出特異性檢測并測試特定植物在bm3基因座處的接合性的快速方法。

發(fā)明概述

本文中公開了用于bmr玉米品種(例如，bm3突變體)的基于高通量pcr的分子表征的方法，其可以極大地增強含有bmr的品系的育種過程。公開了用于測定植物組織樣品，并且因此制備樣品的植物的接合性的方法，其通過測定bm3突變體和野生型comt等位基因的存在或缺乏進行。如此，提供了基于端點水解探針pcr的接合性測定法(其在本文中稱為測定法)，其特異性檢測并測試bm3基因座處的接合性狀態(tài)。公開了利用同一測定法對中bm3突變體和相應的野生型序列特異性的寡核苷酸的雙重性(biplex)的測定法。

具體地，本公開涉及如下各項：

1.一種使用玉米植物組織確定等位基因的接合性和/或存在/缺乏的方法，該方法包括：

自所述玉米植物組織獲得分離的基因組dna的樣品；

使所述分離的基因組dna與至少一種包含能夠在高嚴格性條件下與seqidno:10雜交的核苷酸序列的核酸分子和至少一種能夠在高嚴格性條件下與seqidno:11雜交的核酸分子接觸；并

確定所述分離的基因組dna中bm3突變的接合性。

2.項1的方法，其進一步包括：

使所述分離的基因組dna與兩種各包含能夠在高嚴格性條件下與seqidno:10雜交的核苷酸序列的核酸分子，和兩種能夠在高嚴格性條件下與seqidno:11雜交的核酸分子接觸；

擴增所述分離的基因組dna的在所述分離的基因組dna中與如下兩種核酸分子雜交的核苷酸序列間的核苷酸序列，所述核酸分子各包含能夠在高嚴格性條件下與seqidno:10雜交的核苷酸序列；

擴增所述分離的基因組dna的在所述分離的基因組dna中與如下兩種核酸分子雜交的核苷酸序列間的核苷酸序列，所述核酸分子各包含能夠在高嚴格性條件下與seqidno:11雜交的核苷酸序列；

擴增反應中包括包含能夠在高嚴格性條件下與seqidno:10雜交的核苷酸序列且用第一報告物標記的至少一種核酸分子，和能夠在高嚴格性條件下與seqidno:11雜交且用第二報告物標記的至少一種核酸分子；并

檢測所述第一和第二報告物的水平。

3.項2的方法，其中所述第一報告物和所述第二報告物是具有可區(qū)別的激發(fā)/發(fā)射光譜的熒光染料。

4.項3的方法，其中所述第一報告物是fam，且所述第二報告物是vic。

5.項1的方法，其中所述至少一種包含能夠與seqidno:10雜交的核苷酸序列的核酸分子的長度是10-35個核苷酸。

6.項5的方法，其中所述至少一種包含能夠與seqidno:10雜交的核苷酸序列的核酸分子的長度是15-30個核苷酸。

7.項5的方法，其中所述至少一種包含能夠與seqidno:10雜交的核苷酸序列的核酸分子之一與seqidno:10的10-35個連續(xù)的核苷酸是至少95％相同的。

8.項7的方法，其中所述至少一種包含能夠與seqidno:10雜交的核苷酸序列的核酸分子選自下組：seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6。

9.項1的方法，其中至少一種包含能夠在高嚴格性條件下與seqidno:10雜交的核苷酸序列的核酸分子用熒光染料標記，而至少一種能夠在高嚴格性條件下與seqidno:11雜交的核酸分子用具有可區(qū)別的激發(fā)/發(fā)射光譜的第二熒光染料標記。

10.項9的方法，其中至少一種包含能夠在高嚴格性條件下與seqidno:10雜交的核苷酸序列的核酸分子用fam標記，而至少一種能夠在高嚴格性條件下與seqidno:11雜交的核酸分子用vic標記。

11.項1的方法，其中擴增所述核苷酸序列包括在pcr反應中擴增。

12.項1的方法，其中擴增所述核苷酸序列包括在基于非pcr的反應中擴增。

13.一種用于鑒定玉蜀黍中comt突變的方法，該方法包括將玉蜀黍核酸暴露于包含seqidno:6的核酸分子。

14.一種用于可靠且可預測地將低木質(zhì)素含量的性狀基因滲入植物種質(zhì)中的方法，所述方法包括：

將在comt基因中具有突變的植物與另一種植物雜交；

自通過所述雜交生成的后代植物獲得分離的基因組dna的樣品；

使所述分離的核酸與至少一種核酸分子接觸，所述核酸分子具有能夠在高嚴格性條件下與seqidno:10雜交的核苷酸序列；并

通過繁殖獲得樣品的植物自所述雜交選擇在所述comt基因中包含突變的后代，所述樣品以高嚴格性結(jié)合所述至少一種核酸分子，由此生成遺傳工程化植物，其中低木質(zhì)素含量的性狀已經(jīng)基因滲入所述遺傳工程化植物的種質(zhì)中。

15.一種具有通過項1的方法確定的接合性的玉米植物。

16.一種具有通過項2的方法確定的接合性的玉米植物。

17.一種通過項14的方法生成的遺傳工程化植物，其展現(xiàn)出低木質(zhì)素含量。

18.一種通過項14的方法確定的玉米植物，其用特異性等位基因檢測測試得到。

19.一種通過項14的方法確定的玉米植物，其用特異性等位基因檢測測試得到。

附圖簡述

圖1包括具有bm3突變的comt基因和為comt基因的部分擴增(約1.8kbp)設計的寡核苷酸的圖示。

圖2包括來自12種bm3系和3種非bm3系(野生型系)的部分comt基因序列的擴增的描繪。將pcr產(chǎn)物在2％e上顯現(xiàn)，然后經(jīng)由0.8％eclonewell提取，隨后克隆入pcr4載體中。

圖3包括來自bm3突變體和野生型comt基因的共有序列的比對。三處先前描述的缺失/插入突變加下劃線。

圖4包括comt基因及對bm3突變和完整的comt基因特異性的引物的圖示。(a)具有點線的comt基因代表bm3缺失。comt基因特異性引物在缺失位點內(nèi)。(b)bm3突變體基因。bm3特異性寡核苷酸在缺失位點側(cè)翼的正向和反向寡核苷酸和探針跨越缺失區(qū)的接合中。

圖5a和5b包括實時pcr擴增圖，其中對具有fam的bm3(a)和(b)具有vic(由于實時pcr儀的限制而用hex替換)的野生型comt顯示相對熒光單位(rfu)。對于bm3和野生型comt基因兩者，從循環(huán)22至36觀察到指數(shù)擴增期。

圖6包括使用基于第30個循環(huán)時fam作為等位基因1(純合bm3)和vic(由于儀器限制而用hex替換)作為等位基因2(純合野生型comt)的相對熒光單位的等位辨別測定法進行的基因型測定。

圖7包括用端點測定法進行的bm3接合性測定。在完成pcr和熒光閱讀后，產(chǎn)生分布圖，如下文所描述的：sob1＝fam的高于背景的信號(高于535nm的背景信號平均值的樣品信號)，sob2＝vic的高于背景的信號(高于560nm的背景信號平均值的樣品信號)。用對數(shù)尺度以sob1/sob2<1(對于野生型)、1<sob1/sob2<5(對于半合子)、和sob1/sob2>5(對于純合子)進行基因型測定。

圖8包括用端點測定法進行的bm3接合性測定。在klims(kbioscience實驗室信息管理系統(tǒng))中分析直接來自讀板儀的原始熒光強度數(shù)據(jù)。產(chǎn)生具有在x軸上繪圖的fam和在y周上繪圖的vic的rfu(相對熒光單位)的圖。基于簇視圖中的簇分離進行接合性測定。

序列表

使用如37c.f.r.§1.822中定義的核苷酸堿基的標準字母縮寫顯示所附序列表中列出的核酸序列。僅顯示每種核酸序列的一條鏈，但是互補鏈理解為通過對展示鏈的任意引用而包括在內(nèi)。在所附序列表中：

seqidno:1顯示用于擴增玉米comt部分基因的正向引物序列(bm35_f)：tactctactggctgcggctagc。

seqidno:2顯示用于擴增玉米comt部分基因的反向引物序列(bm35_r)：taaccttgattgttattactcgcacatgg。

seqidno:3顯示用于對玉米comt部分基因測序的來自comt基因的寡核苷酸序列(bm1234r)：atcagcatcagccaggcagg。

seqidno:4顯示用于鑒定突變體bm3等位基因的正向引物序列(bm3_f)：aaaaagaacgaggttgcaaaagata。

seqidno:5顯示用于鑒定突變體bm3等位基因的反向引物序列(bm3_r)：ttagaatccacgacatgcaagag。

seqidno:6顯示具有在5’端的fam和3’端的mgbnfq的用于鑒定突變體bm3等位基因的探針序列(bm3_探針)：fam-acaaaccaaaggatgtcg-mgbnfq。

seqidno:7顯示用于鑒定野生型comt等位基因的正向引物序列(comt_f)：cgcactcgacgacgatgac。

seqidno:8顯示用于鑒定野生型comt等位基因的反向引物序列(comt_r)：cacgctgctcaagaactgcta。

seqidno:9顯示具有5’端的vic和3’端的mgbnfq的用于鑒定野生型comt等位基因的探針序列(comt_探針)：vic-cattttccggcagcgc-mgbnfq。

seqidno:10顯示bm3核苷酸序列。

seqidno:11顯示部分comt核苷酸序列。

發(fā)明詳述

i.幾個實施方案的概述

本文中公開了用于bm3玉米品種的基于高通量pcr的分子表征的方法，其可以極大地增強含有bmr的植物系的育種過程。在具體的實施方案中，該方法可以包括自玉米植物獲得分離的基因組dna的樣品，使分離的基因組dna與至少一種包含能夠在高嚴格性條件下與seqidno:10雜交的核苷酸序列的核酸分子和至少一種包含能夠在高嚴格性條件下與seqidno:11雜交的核苷酸序列的核酸分子接觸，并測定來自玉米植物的分離的基因組dna中bm3突變的接合性。在具體的實施方案中，至少一種包含能夠在高嚴格性條件下與seqidno:10雜交的核苷酸序列的核酸分子和至少一種包含能夠在高嚴格性條件下與seqidno:11雜交的核苷酸序列的核酸分子的長度是10-35個核苷酸。在一些實施方案中，至少一種包含能夠在高嚴格性條件下與seqidno:10雜交的核苷酸序列的核酸分子與seqidno:10的10-35個連續(xù)的核苷酸是至少95％相同的。在一些實施方案中，至少一種包含能夠在高嚴格性條件下與seqidno:11雜交的核苷酸序列的核酸分子與seqidno:11的10-35個連續(xù)的核苷酸是至少95％相同的。在一些實施方案中，能夠在高嚴格性條件下與seqidno:11雜交的核苷酸序列不能夠在高嚴格性條件下與seqidno:10雜交。在某些實施方案中，至少一種包含能夠與seqidno:10或seqidno:11雜交的核苷酸序列的核酸分子選自下組：seqidno:1-9。

還公開了用于鑒定玉米植物中bmr突變的方法。在一些實施方案中，該方法可以包括將來自玉米植物的基因組dna暴露于能夠在高嚴格性條件下與seqidno:10雜交的核酸分子。在具體的實施方案中，能夠在高嚴格性條件下與seqidno:10雜交的核酸分子可以選自下組：seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6。

進一步公開了用于可靠且可預測地將低木質(zhì)素含量的性狀基因滲入(例如，經(jīng)由將bm3等位基因基因滲入)植物種質(zhì)中的方法。在一些實施方案中，該方法可以包括將在comt基因中具有突變的植物與另一種植物回交，自通過雜交生成的后代獲得分離的基因組dna的樣品，使分離的基因組dna的樣品與至少一種包含能夠在高嚴格性條件下與seqidno:11雜交的核苷酸序列的核酸分子接觸，并通過繁殖獲得分離的基因組dna的樣品的植物自所述雜交選擇在所述comt基因中包含突變的后代，所述分離的基因組dna的樣品在高嚴格性的情況中結(jié)合至少一種包含能夠在高嚴格性條件下與seqidno:11雜交的核苷酸序列的核酸分子，由此生成遺傳工程化植物，其中低木質(zhì)素含量的性狀已經(jīng)基因滲入所述遺傳工程化植物的種質(zhì)中

還公開了具有依照公開內(nèi)容的基于高通量pcr的分子方法測定的基因型和/或接合性的玉米植物，及依照公開內(nèi)容的用于可靠且可預測地將低木質(zhì)素含量的性狀基因滲入玉米植物種質(zhì)中的方法生成的展現(xiàn)出低木質(zhì)素含量性狀的遺傳工程化玉米植物。

ii.縮寫

bmr褐色中脈

mgbnfq小溝結(jié)合非熒光淬滅劑^tmi

fam6-羧基熒光素

pcr聚合酶鏈式反應

rfu相對熒光單位

vic6-羧基羅丹明

iii.術(shù)語

在以下的描述和表中，使用許多術(shù)語。為了提供說明書和權(quán)利要求書(包括此類術(shù)語要給予的范圍)的清楚且一致的理解，提供了下列定義：

回交：回交是育種者將雜種后代返回與親本之一，例如具有f1雜種的親本基因型之一的第一代雜種f1重復雜交的方法。

bmr玉米：如本文中所使用的，術(shù)語“bmr玉米”指含有褐色中脈突變，諸如以bm1、bm2、bm3和bm4表征的突變的玉米品種。bmr玉米品種通常展現(xiàn)出葉中脈的微紅褐色色素沉著。bmr玉米通常還以較低的木質(zhì)素含量、較高的纖維消化率和較高的干物質(zhì)攝取為特征。bmr玉米品種的非限制性例子包括f2f297、f2f383、f2f488、f2f449、f2f566、f2f610、f2f622、f2f665、f2f633、f2f682、f2f721、f2f700和f2f797。

雜交：寡核苷酸及其類似物通過互補堿基間的氫鍵合(其包括沃森-克里克、hoogsteen或反hoogsteen氫鍵合)雜交。一般地，核酸分子由作為嘧啶(胞嘧啶(c)、尿嘧啶(u)和胸腺嘧啶(t))或嘌呤(腺嘌呤(a)和鳥嘌呤(g))的含氮堿基組成。這些含氮堿基在嘧啶與嘌呤間形成氫鍵，并且嘧啶與嘌呤的鍵合稱為“堿基配對”。更具體地，a會與t或u氫鍵鍵合，而g會與c鍵合?！盎パa的”指兩種獨特的核酸序列或同一核酸序列的兩個獨特區(qū)間發(fā)生的堿基配對。

“特異性可雜交的”和“特異性互補的”是指示足夠的互補性程度，使得寡核苷酸和dna或rna靶物間發(fā)生穩(wěn)定的且特異性的結(jié)合的術(shù)語。寡核苷酸與要特異性可雜交的其靶序列不需要是100％互補的。在寡核苷酸與靶dna或rna分子的結(jié)合干擾靶dna或rna的正常功能，并且有足夠的互補性程度，從而避免寡核苷酸與非靶序列在期望特異性結(jié)合的條件下，例如在生理學條件下(在體內(nèi)測定法或系統(tǒng)的情況中)非特異性結(jié)合時，寡核苷酸是特異性可雜交的。此類結(jié)合稱為特異性雜交。

導致特定嚴格性程度的雜交條件會隨選擇的雜交方法的性質(zhì)和雜交核酸序列的組成和程度而有所變化。一般地，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強度(尤其是na⁺和/或mg²⁺濃度)會促成雜交的嚴格性，盡管清洗次數(shù)也影響嚴格性。關(guān)于獲得特定的嚴格性程度需要的雜交條件的計算在sambrook等(編),molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,第1-3卷,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989,第9章和第11章中討論。

出于本公開內(nèi)容的目的，“嚴格條件”涵蓋若雜交分子與靶序列間存在有小于25％錯配會發(fā)生雜交的條件?！皣栏駰l件”可以進一步限定成特定的嚴格性水平。如此，如本文中所使用的，“中等嚴格性”條件是具有超過25％錯配的分子不會雜交的條件；“中間嚴格性”條件是具有超過15％錯配的分子不會雜交的條件，而“高嚴格性”條件是具有超過10％錯配的序列不會雜交的條件?！皹O高嚴格性”條件是具有超過6％錯配的序列不會雜交的條件。

在具體的實施方案中，嚴格條件可以包括于60℃在依照制造商的用法說明書稀釋的基因型分型master混合物(appliedbiosystems,fostercity,ca,產(chǎn)品目錄編號#4371355)中雜交。

分離的：“分離的”生物組分(諸如核酸或蛋白質(zhì))已經(jīng)與該組分天然存在的生物體細胞中的其它生物組分，即，其它染色體和染色體外dna和rna及蛋白質(zhì)基本上分開、離開其生成、遠離其純化。已經(jīng)“分離的”核酸分子和蛋白質(zhì)包括通過標準純化方法純化的核酸分子和蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括通過宿主細胞中的重組表達制備的核酸和蛋白質(zhì)以及化學合成的核酸分子、蛋白質(zhì)和肽。

寡核苷酸：寡核苷酸是短的核酸聚合物。寡核苷酸可以通過切割較長的核酸區(qū)段，或者通過聚合單個核苷酸前體來形成。自動化的合成儀容許合成長度多達幾百個堿基對的寡核苷酸。因為寡核苷酸可以結(jié)合互補的核苷酸序列，所以它們可以作為探針用于檢測dna或rna。由dna(寡脫氧核糖核苷酸)構(gòu)成的寡核苷酸可以在pcr(即一種用于擴增小dna序列的技術(shù))中使用。在pcr中，寡核苷酸通常稱為“引物”，其容許dna聚合酶延伸寡核苷酸并復制互補鏈。

接合性：如本文中所使用的，術(shù)語“接合性”指生物體中遺傳性狀的基因的等位基因的相似性或其缺乏。若兩種等位基因都是相同的，則生物體在性狀方面是“純合的”。若兩種等位基因是不同的，則生物體在所述性狀方面是“雜合的”。若一種等位基因是缺少的，則它是“半合子的”。若兩種等位基因是缺少的，則它是“失效合子的”。

除非另有明確解釋，本文中使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語與本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。分子生物學中的常見術(shù)語的定義可以參見例如lewinb.,genesv,oxforduniversitypress,1994(isbn0-19-8542879)；kendrew等(編),theencyclopediaofmolecularbiology,blackwellscienceltd.,1994(isbn0-632-02182-9)；及meyersr.a.(編),molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,vchpublishers,inc.,1995(isbn1-56081-569-8)。

iv.用于bmr玉米的基因型和接合性測定的高通量方法

a.概述

本文中描述了一種基因特異性端點pcr測定法，其一般可用于bmr玉米或推定的bmr玉米的接合性分析。具體的例子利用同一測定法中對bm3缺失和對相應的野生型序列特異性的寡核苷酸的雙重性。在這些例子中，可以通過bm3突變體和野生型comt等位基因的存在/缺乏測定接合性。該測定法已經(jīng)提交給高通量基因組分析組以進一步執(zhí)行，并且可以極大地增強bmr基因滲入項目的育種過程。

b.褐色中脈玉米

褐色中脈(bmr)玉米植物以在v4至v6階段時葉中脈中褐色色素沉著和抽穗后木髓的淺褐色著色為特征。褐色中脈雜種玉米含有在玉米植物組織中引起較低木質(zhì)素含量的基因突變，例如，bm2突變，或bm3突變。褐色中脈3基因位于染色體4的短臂上，且bm3等位基因是隱性的。褐色中脈2基因位于染色體1的長臂上，且bm2等位基因也是隱性的。木質(zhì)素聚合物限制玉米植物中纖維的消化率。褐色中脈玉米中降低的木質(zhì)素導致比正常玉米具有更可消化的纖維的青貯飼料。動物喂養(yǎng)試驗已經(jīng)顯示了與正常青貯飼料相比，在bmr玉米青貯飼料的情況中大大約10％的攝取和升高的乳產(chǎn)量。

提供了鑒定bm3突變的方法。公開內(nèi)容的方法可用于例如將特定玉米植物，或特定玉米品種鑒定為bmr玉米。公開的方法還可用于bmr性狀對玉米種質(zhì)的可靠的且可預測的基因滲入，其通過將bmr玉米與其它玉米品種雜交，或者通過將含有第一bmr突變的bmr玉米與含有第二bmr突變的bmr玉米雜交(例如，將bm1玉米品種與bm3玉米品種雜交)來進行。許多bmr突變是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且一些bmr突變已經(jīng)得到表征(例如，定位并測序)?？梢允褂霉_內(nèi)容的方法鑒定bmr突變，測定bmr玉米植物或品種的基因型和/或接合性，以及將任何bmr突變基因滲入玉米種質(zhì)中。

c.端點pcr檢測測定法

本文中描述了一種基因特異性端點pcr測定法，其一般可用于bmr玉米或推定的bmr玉米的接合性分析。在具體的實施方案中，可以使用基因特異性端點pcr測定法來分析玉米在bm3突變方面的接合性。

在基因特異性端點pcr測定法中使用的引物和探針可以基于感興趣的基因中已知的突變設計。例如，可以基于在咖啡酸o-甲基轉(zhuǎn)移酶(comt)基因3’端的978bp缺失設計用于bm3特異性測定法的引物和探針。在雙重性反應(其中在同一測定法中使用對突變(例如，bm3)和未破壞的野生型基因(例如，comt)特異性的寡核苷酸)中，特異性寡核苷酸會自存在于基因組dna樣品中的突變基因和/或野生型基因之任一或兩者選擇性擴增序列。

在一些實施方案中，bm3特異性測定法擴增長度為71bp的片段，其對于自野生型comt基因刪除978bp核苷酸序列的接合位點而言是獨特的。在某些實施方案中，靶物特異性寡核苷酸探針(例如，bm3_探針(seqidno:6))在高嚴格性條件下與基因組dna樣品中在兩種pcr引物(例如，bm3_f(seqidno:4)和bm3_r(seqidno:5))間的靶序列雜交。

在一些實施方案中，野生型comt基因特異性測定法擴增長度為65bp且位于外顯子2(bm3突變體中缺失)內(nèi)的comt基因片段，使得不能擴增comt基因座處的非bm3序列。在某些實施方案中，靶物特異性寡核苷酸探針(例如，comt_探針(seqidno:9))在高嚴格性條件下與基因組dna樣品中在兩種pcr引物(例如,comt_f(seqidno:7)和comt_r(seqidno:8))間的靶序列雜交。

可以例如用熒光染料(例如，fam、vic和mgbnfq)標記靶物特異性寡核苷酸，所述熒光染料可以容許靶物特異性熒光信號的快速量化。可以在預先確定的循環(huán)數(shù)目后，例如，在反應處于早期指數(shù)期時測量pcr產(chǎn)物。陰性對照樣品可以包含例如沒有bm3突變的來自任何玉米品種的基因組dna。陽性對照樣品可以包含具有bmr突變，諸如comt基因中的bm3缺失突變的來自玉米品種的基因組dna。對照半合子樣品可以包含預先測定為在bm3突變方面半合子的來自玉米品種的基因組dna；或者半合子樣品可以包含等比例的陰性對照dna與預先測定為在bm3方面純合的來自玉米品種的dna。

可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法自玉米植物組織分離(例如，提取并純化)dna。用于dna分離的商業(yè)試劑盒可購自例如qiagen,inc。在一些實施方案中，將來自特定植物的葉盤沖孔并轉(zhuǎn)移入收集管中?？梢詫_孔器在每次取樣后用70％酒精清洗，在水中漂洗，并干燥?？梢砸勒罩圃焐痰耐扑]制備dna提取緩沖液。然后，可以依照制造商的用法說明書使用試劑盒分離dna。最后，可以使用例如quantit^tm量化試劑盒(invitrogen,carlsbad,ca)和分光光度計，或者通過任何其它合適的技術(shù)測定分離的dna的濃度。

一旦已經(jīng)制備或以其它方式獲得引物、探針和基因組dna樣品，可以進行pcr反應以鑒定基因組dna樣品中感興趣的核酸序列(例如，對于bmr突變特殊的序列)。在具體的實施方案中，制備單獨的pcr反應混合物，其含有所有反應組分，除了基因組dna樣品外。對于包含bm3突變體和野生型comt玉米的引物和基因特異性探針的雙重反應，反應混合物可以包含酶、反應緩沖液、bm3突變的正向和反向引物、野生型comt基因的正向和反向引物、bm3突變的基因特異性探針、comt基因的基因特異性探針和水。在一些pcr測定系統(tǒng)(例如，pcr測定法)中，酶和緩沖液可以存在于單一試劑盒組分(例如，基因型分型master混合物；appliedbiosystems,fostercity,ca,產(chǎn)品目錄編號#4371355)中。

一旦以其它方式制備反應混合物，可以添加基因組dna樣品，并開始反應。不必要標準化樣品中基因組dna的量。然而，熟練技術(shù)人員可以通過使用具有相對相等濃度的基因組dna樣品獲得最好的結(jié)果。

在一些實施方案中，可以用合適的對照建立pcr測定法(例如，pcr測定法)。例如，多孔板中的反應可以在對照孔的情況下實施，所述對照孔包含：(1)具有試劑但沒有dna樣品的陰性對照；(2)包含bm3玉米基因組dna的純合陽性對照；(3)和半合子陽性對照，如上文所描述的。然后，在合適的循環(huán)條件下通過pcr擴增dna。例如，在使用pcr系統(tǒng)9700的一些實施方案中，可以存在著于95℃持續(xù)15分鐘的單一初始變性循環(huán)，接著是30個循環(huán)的變性(92℃持續(xù)15秒)和變性/延伸(60℃持續(xù)60秒)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，pcr循環(huán)條件可以隨從業(yè)人員的判斷而有所變化，并且獲得相當?shù)慕Y(jié)果。

d.基因型和/或接合性的測定

可以使用pcr測定法(例如，端點pcr測定法)進行bmr玉米或推定的bmr玉米的基因型和/或接合性分析。在一些實施方案中，可以用報告物(例如，熒光模塊)標記基因特異性寡核苷酸探針。對于使用熒光測定檢測的測定法，可以使用適合于檢測探針的激發(fā)和發(fā)射波長設置在分光熒光計(例如，tecangenios^tm；switzerland)中分析pcr反應產(chǎn)物。例如，可以用485nm的激發(fā)波長和535nm的發(fā)射波長測量熒光染料fam?；蛘撸梢杂?25nm的激發(fā)波長和560nm的發(fā)射波長測量熒光染料vic。

在完成pcr反應和探針檢測后，可以使用例如任何合適的計算機制圖學軟件產(chǎn)生表和分布圖。用相似基因型背景的野生型、半合子和純合dna獲得的結(jié)果可以充當陰性和陽性對照。在一個分離的群體中，可以獲得數(shù)據(jù)點的三個簇，其容許將樣品結(jié)果視覺測定為可能屬于分離簇之一?；蛘撸梢允褂脭?shù)據(jù)分析計算機軟件來計算如下的可能性，即樣品結(jié)果屬于每個分離簇，其中最可能的簇充當樣品名稱。在進行視覺測定時，每個簇的邊界可以是任意的，例如在數(shù)據(jù)點的三個簇是明顯可見的時。

也可以使用合適的分析包，諸如klims(kbioscience實驗室信息管理系統(tǒng))自讀板儀直接分析原始熒光強度數(shù)據(jù)?？梢援a(chǎn)生具有在一條軸上繪圖的由突變體等位基因的特異性探針產(chǎn)生的熒光信號的相對熒光單位(rfu)和在另一條軸上繪圖的由野生型等位基因的特異性探針產(chǎn)生的熒光信號的rfu的圖。然后，接合性測定可以基于數(shù)據(jù)圖形顯示中的簇分離進行。

不含突變體基因組dna(例如，bmr突變)的樣品僅可以產(chǎn)生野生型pcr產(chǎn)物的熒光讀數(shù)。含有半合子或純合突變體基因組dna的樣品可以產(chǎn)生比陰性背景對照的讀數(shù)高的突變體特異性探針的rfu讀數(shù)。若樣品不產(chǎn)生足夠的結(jié)果，則樣品中的基因組dna可能不是足夠質(zhì)量和/或數(shù)量的，并且應當實施新的dna制備和/或新的pcr反應。優(yōu)選地，不含dna樣品的陰性對照樣品顯示基因特異性探針的非常低的檢出。還優(yōu)選的是，已知的純合對照僅僅顯示對照中突變體或野生型dna的高檢出，而已知的半合子對照顯示突變體和野生型dna兩者的高檢出。

pcr方法和基因型和/或接合性測定的“測試運行”可以在篩選樣品前在所有合適的對照的情況中實施。方法的進一步優(yōu)化對于可以在各次使用間有所不同的組分(例如，基因組dna制備的方法、taqdna聚合酶、寡核苷酸、實驗室設備等)可以是想要的。可以建立pcr和熱循環(huán)條件，其以可接受的探針檢測水平(例如，對于經(jīng)熒光標記的寡核苷酸探針為可接受的rfu)擴增已知基因組dna模板中突變體和/或野生型序列兩者。

e.低木質(zhì)素含量的性狀對植物種質(zhì)的基因滲入

本文中描述了經(jīng)由牽涉有性生殖的常規(guī)植物育種生成具有低木質(zhì)素含量的玉米植物(例如，bmr玉米)的方法。方法可以包括將在其基因組中包含至少一個拷貝的bmr突變(例如，bm3、bm3-1、bm3-2)的第一親本玉米植物與第二親本玉米植物雜交，從而生成f1后代。第一植物可以是任何bmr玉米植物，包括例如bmr玉米品種f2f297、f2f383、f2f488、f2f449、f2f566、f2f610、f2f622、f2f665、f2f633、f2f682、f2f721、f2f700和f2f797。第二親本玉米植物可以是在與第一玉米植物雜交時能夠生成能活的后代玉米植物(即，種子)的任何玉米植物。第一和第二親本玉米植物可以是相同玉米物種(例如，玉蜀黍(zeamays,maize))的。所述方法可以進一步牽涉將f1后代自交以生成f2后代。方法可以進一步牽涉將f1或f2后代植物與作為第一或第二親本玉米植物的相同系或基因型的植物回交的一個或多個世代?；蛘?，可以將第一次雜交或任何隨后的雜交的f1后代與第三玉米植物雜交，所述第三玉米植物與第一或第二植物是不同系或基因型的。

在一些實施方案中，將后代植物進行公開內(nèi)容的基因型和/或接合性測定。一旦已經(jīng)將后代植物基因型分型，和/或已經(jīng)測定其接合性，則熟練技術(shù)人員可以選擇那些具有期望的遺傳組成的后代植物。此類選定的后代植物可以進一步的雜交、自交或培養(yǎng)中使用。依照公開內(nèi)容的方法指導的bmr突變的基因滲入的方法降低或消除沒有期望的遺傳組成的植物的培養(yǎng)和/或生殖，并且由此提供期望的可靠性和可預測性(經(jīng)由預期的孟德爾遺傳方式)。

提供了以下實施例以例示某些具體的特征和/或?qū)嵤┓桨浮Ｒ韵聦嵤├粦忉尀閷⒐_內(nèi)容限制成所描述的具體特征或?qū)嵤┓桨浮?/p>

實施例

實施例1：材料和方法

植物和遺傳材料。提供了含有純合bm3等位基因和純合野生型comt等位基因的玉米葉樣品。

總基因組dna的分離和量化。每份樣品沖孔8個葉盤，并使用2000將其研磨成細粉末。用qiagendneasy^tm96孔試劑盒(valencia,ca)提取dna。在pcr前，使用制造商的用法說明書用quantit^tm量化試劑盒(invitrogen,carlsbad,ca)量化dna樣品。

部分comt基因的克隆和測序。在含有2.5個單位的takaralataq^tm(takarabioinc.,shiga,japan)、400nmdntp、200nm正向(bm35_f)和反向引物(bm34_r)和30ng基因組dna的反應中使用abipcr系統(tǒng)9700(appliedbiosystems,fostercity,ca)用寡聚物bm35_f(5’-tactctactggctgcggctagc-3’；seqidno:1)和bm34_r(5’-taaccttgattgttattactcgcacatgg-3’；seqidno:2)自12種bm3系和3種非bm3樣品(見表1)擴增部分comt基因的玉米基因組dna片段。pcr程序以于94℃變性2分鐘開始，接著是94℃持續(xù)45秒，55℃持續(xù)45秒和72℃持續(xù)2分鐘的30個循環(huán)。將pcr產(chǎn)物在2％e(invitrogen,carlsbad,ca)上顯現(xiàn)，然后在0.8％eclonewells^tm上提取。然后，依照制造商的用法說明書將純化的pcr產(chǎn)物克隆入pcr4載體(invitrogen,carlsbad,ca)中。將選定的菌落在含有2.5％lb(對于1llb培養(yǎng)基為10g胰蛋白胨、10gnacl和5g酵母提取物)、36mmk2hpo4、13mmkh2po4、1.7mm檸檬酸鈉、6.8mm(nh4)2so4、4.4％甘油、0.4mmmgso4·7h2o、12.5μg/ml氯霉素(使用前立即添加)和50μg/ml卡那霉素的1x冰箱培養(yǎng)基(freezermedia)中培養(yǎng)過夜。然后，將選定的菌落送到(houston,tx)，以用t7和t3啟動子及bm1234r(5’-atcagcatcagccaggcagg-3’；seqidno:3)(其位于comt基因內(nèi))測序。使用4.8軟件分析序列。通過比較來自bm3系與野生型comt樣品的共有序列鑒定bm3突變。

表1：用于comt基因的克隆和測序的12種bm3和3種非bm3近交系的表。

pcr測定法設計和確認?；趤碜詁m3系的dna共有序列，設計用于鑒定突變體等位基因的對刪除3’端的來自comt基因的部分序列的接合特異性的引物(bm3_f；seqidno:4和bm3_r；seqidno:5)和探針(bm3_探針；seqidno:6)；用于鑒定野生型等位基因的在缺失區(qū)內(nèi)的引物(comt_f和comt_r)和探針(comt_探針)。使用primerexpress3.0進行測定法設計。所有引物及用fam或vic和小溝接合非熒光淬滅劑^tmi(mgbnfq)染料的雙重標記探針由appliedbiosystems(fostercity,ca)合成。將所有引物和探針在1xtrisedta中以100μm溶解。對所有pcr反應使用基因型分型master混合物(appliedbiosystems,fostercity,ca,產(chǎn)品目錄編號#4371355)。

在光學系統(tǒng)(biorad,hercules,ca)上使用96孔板依照表2設立20μl體積中的實時pcr反應，以于95℃變性15分鐘開始，接著是92℃持續(xù)15秒和60℃持續(xù)1分鐘的50個循環(huán)。在每次循環(huán)結(jié)束時記錄熒光信號。

表2：在20μl終體積的情況中每次雙重性反應的pcr混合物。

使用384孔板依照表3設立10μl體積中的端點pcr測定法。使用abipcr系統(tǒng)9700(appliedbiosystems,fostercity,ca)進行擴增，以于95℃變性15分鐘開始，接著是92℃持續(xù)15秒和60℃持續(xù)1分鐘的30個循環(huán)。在最佳循環(huán)數(shù)目后在反應處于早期指示期時用推薦的儀器設置(fam(bm3突變體)：激發(fā)485nm、發(fā)射535nm；vic(野生型comt)：激發(fā)525nm，發(fā)射560nm)通過分光熒光計(tecangenios^tm,switzerland)測量pcr產(chǎn)物。

表3：在10μl終體積的情況中每次雙重性反應的pcr混合物。

數(shù)據(jù)分析。對于實時pcr，通過軟件自動計算熒光閾值，其數(shù)值略高于背景。通過產(chǎn)生高于建立的閾值的熒光需要的循環(huán)數(shù)目確定閾值循環(huán)(ct值)。然后，使用等位辨別測定法來測定基因型。

在完成端點pcr和熒光閱讀后，計算報告染料1的高于背景的信號(sob1)和報告染料2的高于背景的信號(sob2)。產(chǎn)生樣品數(shù)目與對數(shù)尺度的sob1/sob2的絕對比率間的分布圖。使用相似基因型背景的野生型、半合子和純合植物的樣品作為對照?；诖胤蛛x進行基因型測定。

還使用klims(kbioscience實驗室信息管理系統(tǒng))分析直接來自讀板儀的原始熒光強度數(shù)據(jù)。產(chǎn)生具有在x軸上繪圖的fam和在y周上繪圖的vic的rfu(相對熒光單位)的圖?；诖匾晥D中的簇分離進行接合性測定。

實施例2：對comt基因的部分bm3突變的序列分析

為了設計bm3突變體的基因特異性測定法，需要精確的序列信息。因此，設計兩種寡核苷酸以自來自12種bm3和3種非bm3系的基因組dna擴增部分comt基因(圖1)。圖2。將這些片段克隆入pcr4載體中，并送到cogenics,inc.，以用t7和t3啟動子及bm1234r(seqidno:3)測序。bm1234r位于comt基因中間，并且用于實現(xiàn)全長序列信息。使用4.8分析并比對來自9種bm3系的高質(zhì)量序列。將來自bm3系的共有序列與野生型樣品比較。鑒定在comt基因3’端的多處缺失/插入突變。例如，將三處突變確認并加下劃線。圖3。

基因特異性測定法設計和確認。我們已經(jīng)測試的所有bm3系都含有comt基因3’外顯子處的大缺失突變。然后，使用此突變進行基因特異性測定法設計。圖4包括顯示寡核苷酸位置的圖示。野生型comt基因特異性引物和探針位于978bp缺失位點內(nèi)。bm3特異性引物和探針位于在缺失位點側(cè)翼的正向和反向寡核苷酸和探針跨越缺失區(qū)的接合中。

使用12種已知的bm3系和3種非bm3系來測試基因特異性測定法。通過組合相等量的來自bm3系與非bm3系的dna生成6份半合子樣品。使用實時pcr來測試測定法的效率。在同一測定法中組合對bm3突變體和對相應的野生型序列特異性的寡核苷酸。使用fam來監(jiān)測bm3的擴增子，而使用vic來監(jiān)測野生型comt的擴增子。對bm3和野生型comt基因兩者自循環(huán)22至36觀察到指數(shù)擴增期。圖5a和5b。使用基于第30個循環(huán)時fam作為等位基因1和vic作為等位基因2的等位辨別測定法產(chǎn)生正確的基因型測定。圖6。

端點接合性分析的確認。使用含有以純合、半合子、和無效(野生型)分離的bm3群體的dna樣品的一塊96孔板來測試并確認端點pcr測定法。端點pcr的一項優(yōu)點是容易使用。端點pcr不需要更昂貴的實時pcr儀。任何平常的pcr儀適合于96或384孔板，并且能夠閱讀相關(guān)熒光信號的讀板儀足以實施測定法。

基于來自實時pcr的結(jié)果，30個循環(huán)的pcr反應可以有效分開bm3基因與野生型comt基因。在第30個循環(huán)時終止pcr反應。在完成pcr和熒光閱讀后，計算高于背景(h2o)的fam(bm3)熒光信號(作為高于背景的信號1(sob1)；和高于背景的vic(野生型comt)熒光信號2(sob2)。以對數(shù)尺度使用sob1/sob2產(chǎn)生分布圖。圖7。相似基因型背景的野生型、半合子和純合對照充當陰性和陽性對照。在分離的群體中，獲得數(shù)據(jù)點的三個簇，容許視覺確定截留點。對于圖7中的例子，數(shù)據(jù)點的三個簇是明顯可見的。野生型的數(shù)據(jù)點小于1，半合子樣品的數(shù)據(jù)點的范圍為1至5，而純合樣品的數(shù)據(jù)點高于5。

還在klims(kbioscience實驗室信息管理系統(tǒng))中分析直接來自讀板儀的原始熒光強度數(shù)據(jù)。產(chǎn)生具有在x軸上繪圖的fam和在y周上繪圖的vic的rfu(相對熒光單位)的圖。基于簇視圖中的簇分離進行接合性測定。圖8。因為使用fam來監(jiān)測bm3的擴增，且使用vic來監(jiān)測野生型comt的擴增，所以具有強fam信號，且很少或沒有vic信號的樣品是純合的bm3；具有強vic信號，且很少或沒有fam的樣品是野生型comt(無效)；而具有fam和vic兩者的強信號的樣品是半合子的。

來自此bm3基因特異性端點pcr測定法的基因型和接合性測定與田間收集的表型數(shù)據(jù)100％匹配。此測定法提供了以高通量方式表征bm3接合性狀態(tài)的容易且準確的方式。

實施例3：bm3突變的基因滲入

測定玉米植物就bm3突變而言的接合性，如上文所描述的。測定的是，玉米植物在bm3突變方面是純合的。經(jīng)由常規(guī)的植物育種將植物與已知在野生型comt基因方面純合的玉米植物和在bm3突變方面純合的玉米植物雜交。生成雜交的f1后代。然后，將雜交的f1后代自交以生成f2后代。制備f2后代的基因組dna的樣品，并測定f2后代植物的接合性，如上文所描述的。

選擇在bm3突變方面純合的f2后代植物。然后，對選定的后代測定低木質(zhì)素含量，并且通過雜交和自交進一步繁殖展現(xiàn)出低得想要的木質(zhì)素水平的那些后代，并將所得的后代栽培。

雖然本發(fā)明在本文中已經(jīng)就某些優(yōu)選的實施方案進行過描述，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應當認可并領(lǐng)會，它不是如此限制的。取而代之，可以在不背離如要求保護的本發(fā)明的范圍的前提下做出對優(yōu)選實施方案的許多添加、刪除和修飾。另外，可以組合來自一個實施方案的特征與另一實施方案的特征，而仍涵蓋在如發(fā)明人設想的本發(fā)明的范圍內(nèi)。