本發(fā)明屬于遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及一種大銀魚與太湖新銀魚的分子鑒別方法。

背景技術(shù)：

中國是世界銀魚的起源地和主要分布區(qū)，在中國東部各大水系及湖泊中廣泛分布。銀魚營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值均很高，是重要的經(jīng)濟魚類，呈創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟效益。銀魚生活周期短、世代離散、生殖力和定居能力強。作為典型的r-對策者,銀魚對環(huán)境變化敏感且反應(yīng)迅速,種群消長快。然而我國的銀魚天然資源卻因圍湖造田、過度捕撈、環(huán)境污染和生境破碎化等多種因素的影響而持續(xù)衰退,各種銀魚的天然資源都不同程度地下降,物種分布范圍顯著縮小,個別物種漸危，開展銀魚資源調(diào)查和保護工作迫在眉睫。大銀魚和太湖新銀魚是兩種常見的銀魚種類，兩者體色及形態(tài)相似，很難區(qū)分和鑒別。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對形態(tài)區(qū)分的困難，提供一種大銀魚與太湖新銀魚的分子遺傳鑒別方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種大銀魚與太湖新銀魚的分子遺傳鑒別方法，包含以下步驟：

(1)分別提取待鑒定的大銀魚與太湖新銀魚基因組DNA；

(2)以提取的基因組DNA為模板，PCR擴增大銀魚與太湖新銀魚的細(xì)胞色素b基因(Ctyb)；

(3)擴增產(chǎn)物純化后，直接測序，Cytb基因第45位點堿基是T的為大銀魚，若該位點是C的為太湖新銀魚。

所述的用于PCR擴增大銀魚與太湖新銀魚的細(xì)胞色素b基因的上游引物為L14321：SEQ ID NO.1，下游引物為H15634：SEQ ID NO.2。

所述的PCR反應(yīng)體系為50μL：100ng/μL的模板DNA 1μL，PCR緩沖液5μL，dNTP混合液4μL，每種dNTP 0.1mmol/L，10μmol/L的上、下游引物各1μL，2μL 2.5IU的Taq酶；雙蒸水36μL；所述的PCR緩沖液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl₂，0.01％(g/100ml)明膠組成；PCR擴增反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性4min，94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸90s，經(jīng)35個循環(huán)后再72℃延伸10min。

一種用于大銀魚與太湖新銀魚的分子遺傳鑒別的引物對，上游引物為L14321：SEQ ID NO.1，下游引物為H15634：SEQ ID NO.2。

本發(fā)明所述的引物對在分子遺傳鑒別大銀魚與太湖新銀魚中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的引物對在制備大銀魚與太湖新銀魚分子遺傳鑒別試劑中的應(yīng)用。

一種大銀魚與太湖新銀魚分子遺傳鑒別試劑，包含本發(fā)明所述的引物對。

所述的大銀魚與太湖新銀魚分子遺傳鑒別試劑，還優(yōu)選包括PCR緩沖液和dNTP混合液，所述的PCR緩沖液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl₂，0.01％明膠組成。

有益效果：

本發(fā)明針對大銀魚與太湖新銀魚細(xì)胞色素b(Cytochrome b，Cytb)基因序列差異，首次以大銀魚與太湖新銀魚的細(xì)胞色素b基因全長序列作為依據(jù)，從而定性鑒別大銀魚和太湖新銀魚。該方法可以快速、簡便、準(zhǔn)確、有效地鑒別大銀魚與太湖新銀魚，結(jié)果穩(wěn)定性好，重復(fù)率高，填補了目前國內(nèi)分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)鑒別大銀魚與太湖新銀魚的空白，也有利于銀魚資源保護。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中Cytb基因測序序列比對結(jié)果，星號標(biāo)明的是從第45位點(Cytb-45)開始的堿基序列差異。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明做任何形式的限定，僅僅作示例說明。

實施例1

1、引物設(shè)計

設(shè)計一對特異性PCR擴增引物，引物序列為：L14321：5'-CCAGTGA-CTTGAAAAACCACCG-3'(SEQ ID NO.1)，下游引物為H15634：5'-CTTAGCTTTGGGAGT-TAAGGGT-3'(SEQ ID NO.2)。

2、樣本采集

取待鑒定的大銀魚和太湖新銀魚個體各30尾。

3、基因組DNA提取

取每尾魚的尾鰭組織約30mg，用濾紙吸干表面水分，裝入1.5ml離心管，加入420μL STE緩沖液(30mmol/L Tris-HCl，pH8.0，200mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl)?；靹蚝笤偌尤霛舛葹?0％的SDS 80μL和20mg/mL的蛋白酶K 10μL，56℃消化8-10h；加入等體積酚：氯仿：異戊醇(體積比25:24:1)抽提兩次，12000r離心10min，取上清液；加入等體積氯仿：異戊醇(體積比24:1)抽提一次，12000r離心10min，取上清液；加入等體積預(yù)冷無水乙醇，12000r離心10min，棄清液；加入600mL 70％的乙醇洗滌沉淀，8000r離心10min，倒掉乙醇，干燥；加入200μL雙蒸水溶解，紫外分光光度計測其OD值并稀釋至100ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、PCR擴增與檢測

已提取的DNA為模板，用上述引物(L14321和H15634)進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為50μL：1μL模板DNA(100ng/μL)；PCR緩沖液5μL(10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/LKCl，30mmol/L MgCl₂，0.01％明膠)；dNTP混合液4μL(每種dNTP 0.1mmol/L)；上、下游引物(10μmol/L)各1μL，2μL Taq酶(2.5IU)；雙蒸水36μL。擴增反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性4min，94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸90s，經(jīng)35個循環(huán)后再72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠電泳中檢測分離，120V電壓下電泳30min之后，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)確定PCR擴增產(chǎn)物的大小及純度。

5、測序比對

檢測后的PCR擴增產(chǎn)物直接送至生物公司純化測序，獲得1141bp序列，比對后可以發(fā)現(xiàn)Cytb基因從第45位點(Cytb-45)的堿基序列存在差異：30尾大銀魚第45位點(Cytb-45)堿基是T，30尾太湖新銀魚第45位點(Cytb-45)是C。

實施例2

按照實施例1方法，將樣本擴大到大銀魚和太湖新銀魚個體各80尾，結(jié)果依然顯示大銀魚細(xì)胞色素b基因第45位點(Cytb-45)堿基是T，太湖新銀魚第45位點(Cytb-45)堿基是C。