本發(fā)明屬于基因檢測(cè)試劑盒領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的探針組及試劑盒。
背景技術(shù)：
先天性白內(nèi)障是出生即存在或出生后才逐漸形成的先天遺傳或發(fā)育障礙引起的晶狀體混濁，是導(dǎo)致兒童盲和視力損害的首要疾病，約占兒童盲(最佳矯正視力低于0.05)及中重度視力損害(最佳矯正視力低于0.3，不低于0.05)兒童總數(shù)的50％，其有效防治一直是備受關(guān)注和亟待解決的國(guó)際性難題。
先天性白內(nèi)障約30％患兒有較明顯的家族遺傳傾向，有三種遺傳模式，包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳及X連鎖遺傳。其中，常染色體顯性遺傳是最常見的遺傳形式?；诠铝⒓蚁档倪B鎖研究及疾病遺傳相關(guān)候選基因的測(cè)序，據(jù)報(bào)道至少已鑒定出先天性白內(nèi)障相關(guān)的22個(gè)疾病位點(diǎn)和17個(gè)致病基因，先天性白內(nèi)障致病基因的深入全面探索是其發(fā)病機(jī)制研究中最重要的突破點(diǎn)。
近年來隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，已報(bào)道的先天性白內(nèi)障患病基因與日俱增，至少已包括120個(gè)基因的250個(gè)突變位點(diǎn)，但目前市場(chǎng)上仍沒有較為全面的先天性白內(nèi)障相關(guān)基因區(qū)域捕獲探針組合及試劑盒。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中沒有較為全面的先天性白內(nèi)障相關(guān)基因檢測(cè)探針組及試劑盒的不足，提供一種用于檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的探針組及試劑盒，利用其能全面、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因。
一種用于檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的探針組，包含能特異性識(shí)別人類先天性白內(nèi)障相關(guān)基因外顯子非重復(fù)區(qū)域的多個(gè)DNA序列；
所述的先天性白內(nèi)障相關(guān)基因如下所示：
PEX10,PEX14,EPHA2,HSPG2,POMGNT1,FOXE3,RPE65,CRYZ,DNASE2B,ABCD3,COL11A1,GJA8,ADAMTSL4,GPR161,PROX1,RAB3GAP2,GNPAT,PXDN,PEX13,RAB3GAP1,LCT,FIGN,LRP2,AGPS,CRYGD,CRYGC,CRYGB,CRYGA,CYP27A1,CRYBA2,KCNJ13,FYCO1,COL7A1,LAMB2,FLNB,GPX1,PVRL3,CPOX,CASR,CNBP,BFSP2,SOX2,CRYGS,WFS1,HMX1,CC2D2A,SRD5A3,CLOCK,AFF1,ANK2,ETFDH,CTNND2,ERCC8,VCAN,EFNA5,TGFBI,SIL1,SPARC,TFAP2A,GCNT2,GCM2,NEU1,PEX6,LGSN,LCA5,GJA1,PEX7,IFNGR1,PEX3,EZR,FAM126A,GTF2IRD1,HIP1,NRCAM,AGK,FDFT1,BIN3,DOCK5,ESCO2,WRN,ADAM9,EYA1,CNGB3,NBN,RECQL4,VLDLR,CDKN2A,GALT,ALDH1A1,PTCH1,TDRD7,LMX1B,POMT1,VIM,ITGB1,ERCC6,ATOH7,PCBD1,PTEN,SLC16A12,ALDH18A1,PITX3,OAT,HRAS,USH1C,LGR4,PAX6,CAT,PEX16,DHCR7,BEST1,LRP5,MYO7A,FZD4,MMP1,ATM,CRYAB,APOA1,JAM3,PEX5,COL2A1,MIP,MVK,GJA3,GJB6,B3GALTL,SLC25A15,ITM2B,COL4A1,SEC23A,OTX2,SIX6,VSX2,TGFB3,POMT2,DICER1,BUB1B,SORD,FBN1,NR2E3,LOXL1,MIR184,POLG,GFER,TMEM114,NOD2,HSF4,ADAMTS18,MAF,YWHAE+,GUCY2D,CRYBA1,UNC45B,PEX12,WNT3,NOG,GALK1,PYCR1,EPG5,CTDP1,ADAMTS10,SMARCA4,MAN2B1,SIPA1L3,OPA3,SIX5,DMPK,FKRP,FTL,LIM2,TBC1D20,BFSP1,PHARC,CHMP4B,NCOA6,SALL4,GNAS,CRYAA,COL18A1,LSS,PEX26,CRYBB3,CRYBB2,CRYBB1,CRYBA4,NF2,LARGE,ARSE,HCCS,NHS,BCOR,NDP,RP2,PORCN,PQBP1,EBP,GLA,COL4A6,COL4A5,LAMP2,OCRL,ABCD1+,IKBKG,AKR1E2,CYP51A1,FOXC1,MFSD6L,MYH9,PEX1,PEX2,PEX19,PITX2,RAB18,RNLS,SOX2,TMEM70,TMEM114,CBS,ERCC2,ERCC3,FKTN,FOXD3,PEX5L,PEX11β,SLC2A1。
所述的探針組，其每個(gè)DNA序列長(zhǎng)度為78bp。每個(gè)DNA序列所匹配的先天性白內(nèi)障相關(guān)基因外顯子非重復(fù)區(qū)域的區(qū)段分別如表1所示。
所述的用于檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的探針組在檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因中的應(yīng)用。
一種用于檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的試劑盒，包括所述的用于檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的探針組。
所述的用于檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的試劑盒在檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的探針組及試劑盒可一次性對(duì)先天性白內(nèi)障已發(fā)現(xiàn)的225個(gè)相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，提高了分子診斷的覆蓋率及效率，特異性好，靈敏度高，對(duì)先天性白內(nèi)障產(chǎn)前篩查、早期診斷、精準(zhǔn)防治具有重要意義。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1：用于檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的探針組
1、先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的篩選確定
以“congenital cataract”，“inherited cataract”，“pediatric cataract”，“infantile cataract”，“childhood cataract”等為檢索詞，在PubMed，Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)及National Center for Biotechnology Information(NCBI)相關(guān)子網(wǎng)站中搜索已報(bào)導(dǎo)的，通過家族連鎖分析、人群關(guān)聯(lián)分析、散發(fā)病例基因檢測(cè)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的不同證據(jù)等級(jí)的先天性白內(nèi)障相關(guān)基因。通過進(jìn)一步對(duì)臨床表型及遺傳背景的篩選，最終納入225個(gè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因，進(jìn)行產(chǎn)品設(shè)計(jì)及檢測(cè)。
篩選的先天性白內(nèi)障相關(guān)基因如下所示：
PEX10(5192),PEX14(5195),EPHA2(1969),HSPG2(3339),POMGNT1(55624),FOXE3(2301),RPE65(6121),CRYZ(1429),DNASE2B(58511),ABCD3(5825),COL11A1(1301),GJA8(2703),ADAMTSL4(54507),GPR161(23432),PROX1(5629),RAB3GAP2(25782),GNPAT(8443),PXDN(7837),PEX13(5194),RAB3GAP1(22930),LCT(3938),FIGN(55137),LRP2(4036),AGPS(8540),CRYGD(1421),CRYGC(1420),CRYGB(1419),CRYGA(1418),CYP27A1(1593),CRYBA2(1412),KCNJ13(3769),FYCO1(79443),COL7A1(1294),LAMB2(3913),FLNB(2317),GPX1(2876),PVRL3(25945),CPOX(1371),CASR(846),CNBP(7555),BFSP2(8419),SOX2(6657),CRYGS(1427),WFS1(7466),HMX1(3166),CC2D2A(57545),SRD5A3(79644),CLOCK(9575),AFF1(4299),ANK2(287),ETFDH(2110),CTNND2(1501),ERCC8(1161),VCAN(1462),EFNA5(1946),TGFBI(7045),SIL1(64374),SPARC(6678),TFAP2A(7020),GCNT2(2651),GCM2(9247),NEU1(4758),PEX6(5190),LGSN(51557),LCA5(167691),GJA1(2697),PEX7(5191),IFNGR1(3459),PEX3(8504),EZR(7430),FAM126A(84668),GTF2IRD1(9569),HIP1(3092),NRCAM(4897),AGK(55750),FDFT1(2222),BIN3(55909),DOCK5(80005),ESCO2(157570),WRN(7486),ADAM9(8754),EYA1(2138),CNGB3(54714),NBN(4683),RECQL4(9401),VLDLR(7436),CDKN2A(1029),GALT(2592),ALDH1A1(216),PTCH1(5727),TDRD7(23424),LMX1B(4010),POMT1(10585),VIM(7431),ITGB1(3688),ERCC6(2074),ATOH7(220202),PCBD1(5092),PTEN(5728),SLC16A12(387700),ALDH18A1(5832),PITX3(5309),OAT(4942),HRAS(3265),USH1C(10083),LGR4(55366),PAX6(5080),CAT(12359),PEX16(9409),DHCR7(1717),BEST1(7439),LRP5(4041),MYO7A(4647),FZD4(8322),MMP1(4312),ATM(472),CRYAB(1410),APOA1(335),JAM3(83700),PEX5(5830),COL2A1(1280),MIP(4284),MVK(4598),GJA3(2700),GJB6(10804),B3GALTL(145173),SLC25A15(10166),ITM2B(9445),COL4A1(1282),SEC23A(10484),OTX2(5015),SIX6(4990),VSX2(338917),TGFB3(7043),POMT2(29954),DICER1(23405),BUB1B(701),SORD(6652),FBN1(2200),NR2E3(10002),LOXL1(4016),MIR184(406960),POLG(5428),GFER(2671),TMEM114(283953),NOD2(64127),HSF4(3299),ADAMTS18(170692),MAF(4094),YWHAE+(7531),GUCY2D(3000),CRYBA1(1411),UNC45B(146862),PEX12(5193),WNT3(7473),NOG(9241),GALK1(2584),PYCR1(5831),EPG5(57724),CTDP1(9150),ADAMTS10(81794),SMARCA4(6597),MAN2B1(4125),SIPA1L3(23094),OPA3(80207),SIX5(147912),DMPK(1760),FKRP(79147),FTL(2512),LIM2(3982),TBC1D20(128637),BFSP1(631),PHARC(100272226),CHMP4B(128866),NCOA6(23054),SALL4(57167),GNAS(2778),CRYAA(1409),COL18A1(80781),LSS(4047),PEX26(55670),CRYBB3(1417),CRYBB2(1415),CRYBB1(1414),CRYBA4(1413),NF2(4771),LARGE(9215),ARSE(415),HCCS(3052),NHS(4810),BCOR(54880),NDP(4693),RP2(6102),PORCN(64840),PQBP1(10084),EBP(10682),GLA(2717),COL4A6(1288),COL4A5(1287),LAMP2(3920),OCRL(4952),ABCD1+(215),IKBKG(8517),AKR1E2(83592),CYP51A1(1595),FOXC1(2296),MFSD6L(162387),MYH9(4627),PEX1(5189),PEX2(5828),PEX19(5824),PITX2(5308),RAB18(22931),RNLS(55328),SOX2(6657),TMEM70(54968),TMEM114(283953),CBS(875),ERCC2(2068),ERCC3(2071),FKTN(2218),FOXD3(27022),PEX5L(51555),PEX11β(8799),SLC2A1(6513)；共225個(gè)基因，其中，括號(hào)中對(duì)應(yīng)為該基因的Gene ID。
2、用于檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的探針的設(shè)計(jì)和制備
根據(jù)Genebank中公開的人類基因組HG19的上述先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的全外顯子序列，對(duì)每個(gè)外顯子的非重復(fù)區(qū)域根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則設(shè)計(jì)78bp的探針序列(即探針序列與對(duì)應(yīng)的先天性白內(nèi)障相關(guān)基因外顯子序列是嚴(yán)格互補(bǔ)匹配的)，每個(gè)探針序列沿著基因外顯子位置挪動(dòng)設(shè)計(jì)，由此得到與先天性白內(nèi)障相關(guān)基因外顯子非重復(fù)區(qū)域匹配的探針組。利用原位合成技術(shù)，大量合成設(shè)計(jì)的探針，并利用PCR的方法擴(kuò)增出大量的帶有生物素標(biāo)記的探針組。
具體地說，單個(gè)探針序列所匹配的先天性白內(nèi)障相關(guān)基因外顯子的區(qū)段如表1所示。表1中所列的探針序列所匹配的先天性白內(nèi)障相關(guān)基因外顯子的區(qū)段的順序?yàn)榱?由上至下，列2由上至下，列3由上至下。如列1中第3行表示PITX3基因的chr10:103990252-103990330(算頭不算尾，即從該區(qū)段的第一個(gè)堿基位開始、但不包含該區(qū)段的最后一個(gè)堿基位，下同)的外顯子區(qū)域，共78bp，對(duì)應(yīng)該區(qū)域的探針序列為5’-GGATGATCTACGGGCGGGGCCGCTCATACGGGCCTTTCCACGGCGTACTGGCACGGACTAAGGTTGGCTGCCGGGGGC-3’；列1中第4行表示PITX3基因的chr10:103990330-103990408的外顯子區(qū)域，共78bp，對(duì)應(yīng)該區(qū)域的探針序列為5’-GGCCCGTGCACAGCGGGGTAGCTGAAGGAGGCGTGCTGTTTGGCTTTGAGCCGCAGGCTGGCCAGGCTCGAGTTACAC-3’；列2中第2行表示FKRP基因的chr19:47261713-47261791的外顯子區(qū)域，共78bp，對(duì)應(yīng)該區(qū)域的探針序列為5’-GTAATAAAGCTTAAATTATTCCATTTTAAAATTATGAATATGAATAGGGTTTTTTTTATGTTTCTTGCCTCATCCCAA-3’。
表1探針序列所匹配的先天性白內(nèi)障相關(guān)基因外顯子的區(qū)段
實(shí)施例2：用于檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的試劑盒
本實(shí)施例的用于檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的試劑盒，是通過檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因外顯子的突變來進(jìn)行分子遺傳學(xué)檢測(cè)的試劑盒。
本實(shí)施例的用于檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的試劑盒包括：實(shí)施例1得到的探針組，還包括PCR離子擴(kuò)增mix(PCR緩沖液、dNTPs、Taq酶等)，96孔板和96孔板封口模以及QIAGEN Purification kit(Cat.No.159992)、Qiagen PCR kit(Cat.No.28104)、Qiagen MinElute kit(Cat.No.28004)和Ampure beads XP(Cat.No.4471250)等。
實(shí)施例3：用于檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的試劑盒的應(yīng)用
將質(zhì)檢合格的基因組DNA使用Covaris破碎儀隨機(jī)打斷成長(zhǎng)度為180-280bp的片段，末端修復(fù)和尾端加A-tailing后在片段兩端分別連接上接頭制備DNA文庫(kù)。將帶有特異index的DNA文庫(kù)polling后與帶有生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行液相雜交，再使用帶鏈霉親和素的磁珠將目標(biāo)基因(先天性白內(nèi)障相關(guān)基因)的外顯子區(qū)域捕獲下來，經(jīng)PCR線性擴(kuò)增后進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，合格后進(jìn)行測(cè)序。
1.樣本要求
基因組DNA樣本(總DNA樣品，OD260/280值介于1.8-2.0之間，濃度≧100ng/μL，總量≧50μL/樣品，并確保DNA無(wú)污染，無(wú)降解)
2.基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建
2.1基因組DNA打斷
2.1.1將溶于TE buffer的80μL基因組DNA加入到Covaris microtube。
2.1.2按照以下設(shè)置打斷程序：
2.1.3打斷的樣本用QIAGEN Purification kit(Qiagen PCR kit或Qiagen MinElute kit或Ampure beads XP)純化。
2.2片斷末端修復(fù)
2.2.1取1.5ml離心管或200μL PCR管，根據(jù)以下配制反應(yīng)體系
DNA and H2O： 37.5μL
End Repair Reaction Buffer(紅色)： 7μL
End Repair Enzyme(橙色)： 5.5μL
Total volume 50μL，20℃孵育30分鐘
2.2.2反應(yīng)產(chǎn)物用Ampure beads按照以下步驟純化
1)將Ampure beads從冰箱里取出，上下顛倒使beads充分懸浮。
2)向產(chǎn)物中加入1.8倍體積充分懸浮的Ampure beads(如產(chǎn)物體積50μL，則加入90μL的Ampure beads)，用槍頭抽吸混勻至少十次。
3)將混合液放在室溫下5分鐘，使DNA充分被吸附在beads上。
4)在磁鐵上室溫放置2分鐘(不要旋轉(zhuǎn)tube)。
5)2分鐘或是溶液變得清澈以后，用移液器將澄清的液體移棄(注意：槍頭不要碰到磁珠)。
6)Tube置于磁力架上，加入750μL(200μL PCR管中加入200μL)80％的酒精(酒精配置時(shí)間在兩周以內(nèi)，并確保封閉好)，關(guān)上管蓋，室溫放置30秒。
7)移棄澄清液。
8)重復(fù)步驟6，7一次。
9)用200μL的槍頭將管底的殘留液體徹底吸干。
10)將tube從磁鐵上移開，打開管蓋，室溫放置2分鐘(此步驟是為了揮發(fā)掉殘留的酒精，以免影響后續(xù)反應(yīng))。
11)加入35μL的無(wú)酶水(RNase water)，充分混勻，室溫放置2分鐘。
12)將tube放到磁鐵上，室溫放置兩分鐘(或是待溶液完全清澈)，轉(zhuǎn)移33.5μL的澄清液(DNA在澄清液中)于一個(gè)新的離心管或PCR管中，以備下步使用。
2.3片段的尾端加A(A—Tailing)
2.3.1根據(jù)以下組分配制反應(yīng)體系
DNA in H2O: 33.5μL
A-Tailing Reaction Buffer(黃色): 15μL
A-Tailing Enzyme(綠色): 1.5μL
Total volume 50μL，37℃孵育30min
2.3.2反應(yīng)產(chǎn)物用Ampure beads按照以下步驟純化
1)將Ampure beads從冰箱里取出，上下顛倒使beads充分懸浮。
2)向產(chǎn)物中加入1.8倍體積充分懸浮的Ampure beads(如產(chǎn)物體積50μL，則加入90μL的Ampure beads)，用槍頭抽吸混勻至少十次。
3)將混合液放在室溫下5分鐘，使DNA充分被吸附在beads上。
4)在磁鐵上室溫放置2分鐘(不要旋轉(zhuǎn)tube)。
5)2分鐘或是溶液變得清澈以后，用移液器將澄清的液體移棄(注意：槍頭不要碰到磁珠)。
6)Tube置于磁力架上，加入750μL(200μL PCR管中加入200μL)80％的酒精(酒精配置時(shí)間在兩周以內(nèi)，并確保封閉好)，關(guān)上管蓋，室溫放置30秒。
7)移棄澄清液。
8)重復(fù)步驟6，7一次。
9)用200μL的槍頭將管底的殘留液體徹底吸干。
10)將tube從磁鐵上移開，打開管蓋，室溫放置2分鐘(此步驟是為了揮發(fā)掉殘留的酒精，以免影響后續(xù)反應(yīng))。
11)加入30μL的無(wú)酶水(RNase water)，充分混勻，室溫放置2分鐘。
12)將tube放到磁鐵上，室溫放置兩分鐘(或是待溶液完全清澈)，轉(zhuǎn)移27μL的澄清液(DNA在澄清液中)于一個(gè)新的離心管或PCR管中，以備下步使用。
2.4連接illumina adaptor
2.4.1根據(jù)以下組分配制反應(yīng)體系
DNA in EB: 27μL(來自A-tailing)
Ligation Reaction Buffer(白色): 30μL
Ligation Enzyme(紫色)3μL: 3μL
Total volume 70μL，25℃孵育10min。
2.4.2反應(yīng)產(chǎn)物用Ampure beads按照以下步驟純化
1)將Ampure beads從冰箱里取出，上下顛倒使beads充分懸浮。
2)向產(chǎn)物中加入1.5倍體積充分懸浮的Ampure beads(如產(chǎn)物體積70μL，則加入105μL的Ampure beads)，用槍頭抽吸混勻至少十次。
3)將混合液放在室溫下5分鐘，使DNA充分被吸附在beads上。
4)在磁鐵上室溫放置2分鐘(不要旋轉(zhuǎn)tube)。
5)2分鐘或是溶液變得清澈以后，用移液器將澄清的液體移棄(注意：槍頭不要碰到磁珠)。
6)Tube置于磁力架上，加入750μL(200μL PCR管中加入200μL)80％的酒精(酒精配置時(shí)間在兩周以內(nèi)，并確保封閉好)，關(guān)上管蓋，室溫放置30秒。
7)移棄澄清液。
8)重復(fù)步驟6，7一次。
9)用200μL的槍頭將管底的殘留液體徹底吸干。
10)將tube從磁鐵上移開，打開管蓋，室溫放置2分鐘(此步驟是為了揮發(fā)掉殘留的酒精，以免影響后續(xù)反應(yīng))。
11)加入32μL的無(wú)酶水(RNase water)，充分混勻，室溫放置2分鐘。
12)將tube放到磁鐵上，室溫放置兩分鐘(或是待溶液完全清澈)，轉(zhuǎn)移30μL的澄清液(DNA在澄清液中)于一個(gè)新的PCR管中，進(jìn)行以下PCR反應(yīng)。
2.5PCR
2.5.1按照以下組分配制PCR反應(yīng)體系
2.5.2PCR程序設(shè)置如下：
Stage1：98℃2min
Stage2：9x(98℃,30sec；65℃,30sec；72℃,30sec)
Stage3：72℃5min，4℃10s
2.5.3PCR反應(yīng)產(chǎn)物用Ampure beads按照以下步驟純化(先純化一半的PCR產(chǎn)物，若產(chǎn)量低，根據(jù)其要求將另一半產(chǎn)物加擴(kuò)相應(yīng)循環(huán)數(shù))
1)將Ampure beads從冰箱里取出，上下顛倒使beads充分懸浮。從反應(yīng)產(chǎn)物中取出50μL至一個(gè)新的PCR管中(吸取時(shí)先用吸頭上下混勻數(shù)次后再吸取)。
2)向產(chǎn)物中加入1.5倍體積充分懸浮的Ampure beads(如產(chǎn)物體積50μL，則加入75μL的Ampure beads)，用槍頭抽吸混勻至少十次。
3)將混合液放在室溫下5分鐘，使DNA充分被吸附在beads上。
4)在磁鐵上室溫放置2分鐘(不要旋轉(zhuǎn)tube)。
5)2分鐘或是溶液變得清澈以后，用移液器將澄清的液體移棄(注意：槍頭不要碰到磁珠)。
6)Tube置于磁力架上，加入750μL(200μL PCR管中加入200μL)80％的酒精(酒精配置時(shí)間在兩周以內(nèi)，并確保封閉好)，關(guān)上管蓋，室溫放置30秒。
7)移棄澄清液。
8)重復(fù)步驟6，7一次。
9)用200μL的槍頭將管底的殘留液體徹底吸干。
10)將tube從磁鐵上移開，打開管蓋，室溫放置2分鐘(此步驟是為了揮發(fā)掉殘留的酒精，以免影響后續(xù)反應(yīng))。
11)加入35μL的無(wú)酶水(RNase water)，充分混勻，室溫放置2分鐘。
12)將tube放到磁鐵上，室溫放置兩分鐘(或是待溶液完全清澈)，轉(zhuǎn)移33μL的澄清液(DNA在澄清液中)于一個(gè)新的作好標(biāo)記的離心管中，PCR管中剩余3μL樣本用于凝膠電泳。
2.6文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè)
1)取1μL制備好的文庫(kù)樣本，用Nanodrop 2000測(cè)試其OD值，取3μL制備好的文庫(kù)樣本，做1％的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，電泳結(jié)果片段大小在300bp到500bp之間。
2)制備好的文庫(kù)樣本短時(shí)間可以存放在4℃，長(zhǎng)時(shí)間保存則保存在-20℃。
3.目標(biāo)區(qū)域捕獲及測(cè)序
取制備好的基因組DNA文庫(kù)與實(shí)施例1制備的帶有生物素標(biāo)記的用于檢測(cè)先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的探針組進(jìn)行液相雜交，再使用帶鏈霉親和素的磁珠將與探針結(jié)合的先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的外顯子序列捕獲下來，經(jīng)PCR線性擴(kuò)增后進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)檢，合格后進(jìn)行二代測(cè)序。
實(shí)施例4：采用本發(fā)明的檢測(cè)探針及試劑盒進(jìn)行臨床先天性白內(nèi)障標(biāo)本檢測(cè)
選取先天性白內(nèi)障家系中的三人(父親不患病，兒子與母親患病)進(jìn)行檢測(cè)，依實(shí)施例3的具體流程進(jìn)行樣本制備及序列檢測(cè)。
以上述先天性白內(nèi)障家系中的母親樣本為例，測(cè)序原始數(shù)據(jù)量為1022Mb，目標(biāo)區(qū)域的測(cè)序覆蓋度達(dá)99.91％，目標(biāo)區(qū)域的平均測(cè)序深度達(dá)1401.99，目標(biāo)區(qū)域堿基測(cè)序深度大于20x的比例達(dá)99.31％。將去除接頭序列和低質(zhì)量堿基的測(cè)序數(shù)據(jù)(clean data)用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)比對(duì)到人類基因組上；用GATK軟件對(duì)SNP和InDel進(jìn)行變異檢測(cè)，用ANNOVAR軟件同時(shí)關(guān)聯(lián)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)(如dbsnp，1000g，ESP等)對(duì)變異結(jié)果進(jìn)行注釋。對(duì)得到的變異結(jié)果進(jìn)行必要的過濾后再進(jìn)行先天性白內(nèi)障相關(guān)基因的分析。
根據(jù)一般疾病的遺傳方式，按照顯性遺傳(AD：Autosomal Dominant)、隱性遺傳(AR：Autosomal Recessive)進(jìn)行分析。1)顯性遺傳：患者和母親有相同的雜合突變，而父親沒有該突變位點(diǎn)；2)隱性遺傳：患者和母親有相同的純合突變，同時(shí)父親在該位點(diǎn)為雜合突變。篩選得到的先天性白內(nèi)障顯性遺傳方式相關(guān)突變基因結(jié)果如表2，列出突變均為未報(bào)道過的突變位點(diǎn)。以上結(jié)果證明本發(fā)明的探針組及試劑盒較之前的白內(nèi)障基因檢測(cè)產(chǎn)品具有更為廣泛、高效的基因突變檢出率。
表2先天性白內(nèi)障顯性遺傳和隱性遺傳方式相關(guān)突變基因
注：Gene：基因名稱；Chr：染色體；Begin：起始位置；End：終止位置；MutPosition：突變的氨基酸位點(diǎn)。
其中，檢測(cè)到COL18A1的A1203V突變的探針(對(duì)應(yīng)的外顯子區(qū)段chr21:46925269-46925347)序列為：5’-CCTGCAGCTATCAGCGTTCCCGGCCCTCCGGGCCCCCCTGGGCCCCCTGGGCCCCCTGGAACCATGGGCGCCTCCTCA-3’；檢測(cè)到HIP1的L994M突變的探針(對(duì)應(yīng)的外顯子區(qū)段chr7:75168697-75168775)序列為：5’-GCTCTCCCAGTTTTTGACGCTCCTTCTGCAATTCATTTTCTAGCTCTAGCACCCTAACCTGTAAGGGAAAGTAAGTGG-3’；檢測(cè)到MIP的G196fs突變的探針(對(duì)應(yīng)的外顯子區(qū)段chr12:56846818-56846896)序列為：5’-TCCAGAAGGGCTTCAGGATCTTGCCCCTCTCCCTTCACTCACCCAGTGGTTAGTGAAGTTCCCAGTGAGAATGGCAGG-3’；檢測(cè)到SORD的P96S突變的探針(對(duì)應(yīng)的外顯子區(qū)段chr15:45353227-45353305)序列為：5’-TCCCACCCTCGGACATGGTGCCATCTTTGTTTTCCTCTCCAGGTGATCGTGTTGCCATCGAGCCTGGTGCTCCCCGAG-3’；檢測(cè)到VCAN的R3092P突變的(對(duì)應(yīng)的外顯子區(qū)段chr5:82841334-82841412)探針序列為：5’-TTTCTTACTTTCCTGAATATGGTAGGACCTGATCGCTGCAAAATGAACCCGTGCCTTAACGGAGGCACCTGTTATCCT-3’；檢測(cè)到VCAN的P1872L突變的探針(對(duì)應(yīng)的外顯子區(qū)段chr5:82834364-82834442)序列為：5’-ACCACTGTTTCTTCATTTTCATTAAACGTAGAGTATGCAATTCAAGCCGAAAAGGAAGTAGCTGGCACTTTGTCTCCG-3’。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。