本發(fā)明涉及喜樹堿，特別涉及到一種高喜樹堿化合物及其合成方法。
背景技術(shù)：
喜樹堿(Camptothecin, CPT, 1)是一種天然的生物堿，是一個(gè)五環(huán)的稠環(huán)體系。它的(20S)-絕對(duì)構(gòu)型化合物，最早報(bào)道于1966年，是美國科學(xué)家Wall從喜樹(Camptotheca acuminata)的樹皮中提取出來的。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，它對(duì)大鼠的白血病細(xì)胞（leukemia L1210）有很好的致死性，并且有顯著的抗腫瘤活性（Monroe E. Wall, M. C. Wani, C. E. Cook, et al. J. Am. Chem. Soc.1966, 88, 3888-3889.）。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道（K. Mross1, H. Richly, N. Schleucher, et al., Annals of Oncology, 2004, 15, 1284-1294.），他能阻止拓?fù)洚悩?gòu)酶I與DNA直接的相互結(jié)合，從而阻礙了病毒細(xì)胞的DNA復(fù)制而凋亡。
但是，喜樹堿(Camptothecin, CPT, 1)由于其在水中很差的溶解度，使得其在體內(nèi)吸收很差，大大限制了其在藥物的臨床應(yīng)用。后來發(fā)現(xiàn)，10-羥基喜樹堿(2)對(duì)肝癌、白血病、腦癌、食道癌和甲狀腺癌活性很好，特別是對(duì)P-388和白血病癌細(xì)胞（leukemia L1210）表現(xiàn)出了10倍于喜樹堿(Camptothecin, CPT, 1)的藥效，而且毒性更低。目前已經(jīng)上市的藥物就是基于喜樹堿10-羥基喜樹堿(2)作為母體而開發(fā)出來的，相對(duì)于喜樹堿母體而言，它們的水溶性大大改善了。如已經(jīng)于上世紀(jì)90年代由FDA批準(zhǔn)上市的拓?fù)涮婵?Topotecan, 3)和伊立替康(Irinotecan，CPT-11, 5)，前者用于治療卵巢癌、肺癌和其它類型的癌癥，后者主要用于結(jié)腸癌。而倍羅替康(Belotecan, CKD-602, 6)，已于2005年批準(zhǔn)在韓國上市，主要用于治療前列腺癌。海正藥業(yè)于2012年從Enzon Pharmaceuticals購入的PNG-SN-38 (10)，于2014年被作為1.1類新藥通過中國藥監(jiān)局審批，據(jù)說抗腫瘤活性是伊立替康的10倍以上，但是它的血液毒性卻比伊立替康大很多(來源：http://blog.sina.com.cn/s/blog_98c597a00101e9lr.html)。而另外一些可能的藥物，如SB-38，它是伊立替康的代謝產(chǎn)物，雖然比伊立替康的藥物活性高出1000倍，但是它的毒性也很大，在體內(nèi)是伊立替康的100-1000倍，因此不能成藥。BNP-1350 (7) (WO9835940)還處于臨床前或是臨床階段，由于它引入的是疏水基團(tuán)，水溶性很難有多少改善。上面述及喜樹堿和高喜樹堿化合物如下：
據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(A. E. Gabarda, et al., Tetrahedron, 2002, 58, 6329-6341)，在動(dòng)物和人體組織內(nèi)，喜樹堿的內(nèi)酯E環(huán)很容易開環(huán)，酯與羧酸之間存在一個(gè)可逆的平衡，而開環(huán)的產(chǎn)物是沒有任何活性的。因此，提高E環(huán)的穩(wěn)定性，將會(huì)在很大程度上提高藥物的活性，從而減少藥物的使用量，減少藥物的血液毒性。如下所示：
為此，合成更加穩(wěn)定的E環(huán)，一些化學(xué)家們?cè)趯?shí)驗(yàn)室內(nèi)孜孜以求，通過擴(kuò)環(huán)得到高喜樹堿或是在酯基之間引入亞甲基。研究發(fā)現(xiàn)，引入亞甲基的alfa-酮醚活性很差，而高喜樹堿活性基本不變，而它的溶解度也稍微提高了些，最矚目的是七元環(huán)的內(nèi)酯，它比六元環(huán)的內(nèi)酯要穩(wěn)定。目前，高喜樹堿候選藥物BN-80915 (8)和BN-80927 (9)已處于(D. Demarquay, M. Huchet, H. Coulomb, AntiCancer Drugs, 2001, 12, 9-19; O. Lavergne, L. Lesueur-Ginot, et al., J. Med. Chem.1998, 41, 5410-5419.)已處于臨床階段。
但我們認(rèn)為，候選藥物BN-80915 (8)在A環(huán)上引入兩個(gè)氟原子，只會(huì)增加藥物分子的疏水性，完全抵消了E環(huán)擴(kuò)環(huán)后增加的親水性。而BN-80927 (9)，仿造拓?fù)涮婵?Topotecan, 3)，在B環(huán)引入了親水基團(tuán)，但A環(huán)也有兩個(gè)疏水基團(tuán)，總體而言，在水中的溶解度也不一定提高多少，而且9-位上引入的甲基，其在體內(nèi)的代謝穩(wěn)定性還值得商榷。
基于當(dāng)前研究現(xiàn)狀，我司創(chuàng)造性地提出合成一系列高喜樹堿化合物，希望在提高藥物分子體內(nèi)溶解度的同時(shí)，其活性以及E環(huán)的穩(wěn)定性也能相應(yīng)提高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種溶解度和生物利用度同時(shí)提高的高喜樹堿化合物及其合成方法，主要解決現(xiàn)有的高喜樹堿溶解度和生物利用度欠佳的技術(shù)問題。提出了一條新的合成路線，該路線既不需要全合成方法擴(kuò)環(huán)，又不需要保護(hù)和去保護(hù)。
本發(fā)明技術(shù)方案：為了便于對(duì)化合物命名和定位，根據(jù)文獻(xiàn)，定義喜樹堿和高喜樹堿各原子的位置如下：
為達(dá)到上述目的，我們合成出來了式(I)和式()兩類高喜樹堿，所對(duì)應(yīng)的消旋化合物，以及它們對(duì)應(yīng)的(S)-和(R)-構(gòu)型的立體異構(gòu)體。
式(I)和()中，R1，R2，R3為任意金屬鹽（如鈉鉀鈣鎂等），氫，含碳原子數(shù)為2 ~ 20的烷基（如甲基、乙基，異丙基等），含碳原子數(shù)為2 ~ 20的醇類，含碳原子數(shù)為2 ~ 20的醚類，含碳原子數(shù)為2 ~ 20的胺類（含伯胺、仲胺和叔胺）或其它含有碳原子數(shù)為2 ~ 20碳鏈鏈接的任意官能團(tuán)/或分子片段。
這些官能團(tuán)包括而不局限于單一的羥基、醚、硫醚、酯、羧酸、腈基/或氰基、胺、酰胺、硝基、砜、亞砜、磺酸、磺酰胺、磷酸酯、磷酸中的一種，或是這些基團(tuán)任意2個(gè)或2個(gè)以上，通過烷烴或芳烴組合而成。
這些分子片段，包括而不局限于生物素、親和素、熒光素等具有生物標(biāo)記功能的分子，以及包括而不局限于具有其它活性成分的藥物分子。
對(duì)于式()中的R2和R3，可以同時(shí)為氫，也可以一個(gè)是氫，一個(gè)是烷基，或是通過碳鏈連接的其它官能團(tuán)，具體見上面。另外，R2和R3也可以是以環(huán)的形式組成的仲胺，如環(huán)丙胺，環(huán)丁胺，包括2 ~ 10 個(gè)碳組成的環(huán)，也可以是以哌嗪形式連接，具體結(jié)構(gòu)式為，這里n2 大于或等于2，小于或等于10。R4為氫，含碳原子數(shù)為2 ~ 20的烷基（如甲基、乙基，異丙基等），含碳原子數(shù)為2 ~ 20的醇類，含碳原子數(shù)為2 ~ 20的醚類，含碳原子數(shù)為2 ~ 20的胺類（含伯胺、仲胺和叔胺）或其它含有碳原子數(shù)為2 ~ 20的任意官能團(tuán)/或分子片段。這里的任意官能團(tuán)/或分子片段，說明同上。
對(duì)于式(I)和()中的n，n大于或等于1，小于或等于20，這個(gè)鏈接的羧酸片段中，包括而不限于都是碳，中間可以都是碳，也可以含有硫醚、亞砜、砜、胺以及氧醚鍵，具體結(jié)構(gòu)如下面所示：
式()中，A為碳，硫，亞砜，砜，氧或胺（如NH, NMe, NEt等NAlk），n4和n5是大于或等于1，小于或等于20。在此，我們優(yōu)先需要保護(hù)n4和n5之和為5及其以內(nèi)的烷基片段。
上述化合物式(I)和()，含消旋體，(S)-和(R)-單一異構(gòu)體，包括而不局限于它們的游離形式，鹽酸鹽，硫酸鹽，磷酸鹽，三氟乙酸鹽，乙酸鹽，草酸鹽，馬來酸鹽，富貴酸鹽等等。
本發(fā)明優(yōu)選的化合物結(jié)構(gòu)式如下：
一種高喜樹堿化合物的合成方法，其特征在于包括以下步驟：第一步是在四氫呋喃和水的混合溶劑中，使用堿性化合物進(jìn)行了皂化反應(yīng)，溶劑通采用四氫呋喃、甲醇和水中兩種或是三種混配；第二步進(jìn)行成醚反應(yīng)，試劑為酯化物，溶劑為非質(zhì)子性極性溶劑；第三步用鋁試劑或硼試劑還原內(nèi)酯；第四步用氧化試劑進(jìn)行氧化反應(yīng)；第五步是用加成試劑進(jìn)行加成反應(yīng)；第六步強(qiáng)酸脫除叔丁醇，從而得到羧酸；羧酸在醇和無機(jī)酸的混合體系中加熱，或是醇與二氯亞砜、三甲基氯硅烷、乙酰氯、草酰氯作用，均可得到相應(yīng)的酯；酰氯與胺反應(yīng)，或是將羧酸制成混酐，再與胺反應(yīng)，或是用縮合劑縮合，得到酰胺化合物；反應(yīng)式如下
R1，R2，R3同前面對(duì)式(I)和()的限定；這里，R5和R6包括而不僅僅限于氫，它還包括甲基、乙基等烷基，烷氧基甲基，氨基甲基和烷基氨基甲基，以及氟、氯、溴等鹵素原子，三氟甲基，烷氧基，腈基，酯基，羧基，酰胺基等等。
第一步所述的堿性化合物為氫氧化鈉、碳酸鉀、氫氧化鋰、氫氧化鉀或氫氧化鋇中的一種，溶劑通采用四氫呋喃、甲醇和水中兩種混配，第二步所述酯化物為甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯、對(duì)甲苯磺酸酯或鹵代烷基酯中的一種，所述的鹵代烷基酯中的酯為甲酯、乙酯、叔丁酯或芐基酯中的一種，所述的非質(zhì)子性極性溶劑為乙腈、丙酮或N,N-二甲基甲酰胺中的一種；第三步第三步所述的鋁試劑為四氫鋁鋰、紅鋁或二異丁基氫化鋁中的一種，硼試劑為硼氫化鋰或三乙基硼氫化鋰；第四步所述的氧化試劑為高碘酸鈉、臭氧、高錳酸鉀或鉻試劑中的一種；第五步所述的加成試劑為雷福爾馬斯基或格氏試劑；第六步所述的強(qiáng)酸為三氟乙酸、鹽酸或甲磺酸中的一種。
本發(fā)明的有益效果：從溶解度實(shí)驗(yàn)來看(見表)，我們合成出來的10-羥基高喜樹堿，它的溶解度是10-羥基喜樹堿的17倍，高喜樹堿S60624是10-羥基喜樹堿的16倍，從實(shí)踐上證明，提高高喜樹堿的溶解度是行之有效的。高喜樹堿化合物的合成，文獻(xiàn)絕大多數(shù)都是全合成方法合成，該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不經(jīng)濟(jì)。有一篇文獻(xiàn)是用磷酸酯保護(hù)，再進(jìn)行擴(kuò)環(huán)反應(yīng)。由于磷酸酯的不穩(wěn)定性，耐不住強(qiáng)還原劑和親核試劑，故反應(yīng)較亂，收率很低，用層析柱都不容易找到產(chǎn)品點(diǎn)。從原子經(jīng)濟(jì)學(xué)來講，保護(hù)和去保護(hù)就是不經(jīng)濟(jì)的。我們提出的路線，沒有保護(hù)去保護(hù)，關(guān)鍵兩步反應(yīng)，收率適中。后面還可以繼續(xù)優(yōu)化。這個(gè)路線，也是本發(fā)明的亮點(diǎn)所在。
附圖說明
圖1為本發(fā)明化合物對(duì)TOPO I酶的作用情況。
具體實(shí)施方式
以下是具體的實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不能據(jù)此而理解為對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍的限制。
本發(fā)明10-羥基高喜樹堿的合成，按如下路線進(jìn)行：
實(shí)施例1：(S)-10-((二丁氧磷酸酯)氧代)喜樹堿的合成 (2)
在冰浴下，往溶有亞磷酸三丁酯(94.0 g, 0.38 mol)的二氯甲烷溶液 (200 mL)中, 慢慢加入單質(zhì)碘(75.0 g, 0.30 mol), 反應(yīng)體系在該溫度下攪拌半個(gè)小時(shí)，接著撤除冰浴，逐漸升到室溫。 往上述反應(yīng)體系中，慢慢滴加溶有10-羥基喜樹堿(1，50.0 g, 0.14 mol)和4-二甲氨基吡啶(42.0 g, 0.34 mol)的二氯甲烷溶液(600 mL)。 反應(yīng)物室溫?cái)嚢柽^夜. 有機(jī)相用1M的鹽酸(200 mL x3), 食鹽水(200 mL x3)連續(xù)洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，濃縮至干。剩余物用柱層析(DCM: CH3OH = 200:1-60:1)純化，得到47.0 g (收率： 60%) (S)-10-((二丁氧磷酸酯)氧代)喜樹堿(1)，呈黃色固體。
實(shí)施例2：二丁基(4-乙基-3,4-二羥基-14-氧-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃 并吲哚鄰并[1,2-b]喹啉-9-基)磷酸酯的合成(3)
向溶有 (S)-10-((二丁氧磷酸酯)氧代)喜樹堿(2，47.0 g, 84.5 mmol) 的無水甲醇溶液 (300 mL)中，冰浴下，于10分鐘內(nèi)分批加入固體硼氫化鈉(3.2 g, 84.5 mmol)。反應(yīng)物在室溫下反應(yīng)半個(gè)小時(shí)，然后用飽和的氯化銨水溶液(200 mL)淬滅反應(yīng)，并濃縮至干。殘留物用乙酸乙酯溶解(300 mL), 接著用飽和的食鹽水(100 mLx3)洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，濃縮至干，得到37.7 g (收率：80.0%)二丁基(4-乙基-3,4-二羥基-14-氧-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃 并吲哚鄰并[1,2-b]喹啉-9-基)磷酸酯的合成 ( 3),呈淡黃色固體。
實(shí)施例3：{3-[1-(4-氯-芐基)-3-(2-腈基-噻吩-3-基)-1H-吲哚-2-基]-苯氧基}-乙酸 (4)的合成
在冰浴下，向二丁基(4-乙基-3,4-二羥基-14-氧-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃并吲哚鄰并[1,2-b]喹啉-9-基)磷酸酯(3，2.00 g, 3.58 mmol)的丙酮 (30 mL)懸浮液體，慢慢滴加高碘酸鈉的水溶液(1.5 g, 11.7 mmol，6 mL)。滴加完畢后，反應(yīng)液升到50 oC，攪拌5小時(shí)。反應(yīng)液濃縮至干，殘余物用乙酸乙酯溶解(50 mL), 用飽和的食鹽水洗滌(30mLx3), 用無水的硫酸鈉干燥后濃縮至干. 粗品用柱層析純化(DCM: CH3OH=100:1-40:1)，得到1.50 g (收率：75%){3-[1-(4-氯-芐基)-3-(2-腈基-噻吩-3-基)-1H-吲哚-2-基]-苯氧基}-乙酸 (4)，呈淡黃色固體。
實(shí)施例4：3-[2-(二丁氧磷酯)-8-羥甲基-9-氧-9,11-二氫-吲哚啉并[1,2-b]喹啉-7-基]-3-羥基-戊酸叔丁酯(5)的合成
在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，三甲基氯硅烷滴加到四氫呋喃(30 mL)的鋅粉(2.70 g, 41.4 mmol)懸浮液中，接著回流半個(gè)小時(shí)。撤除油浴鍋，滴加溴乙酸叔丁酯(1.21 g, 6.21 mmol)，滴加速度，以保持反應(yīng)液輕微回流為準(zhǔn)。 溶有{3-[1-(4-氯-芐基)-3-(2-腈基-噻吩-3-基)-1H-吲哚-2-基]-苯氧基}-乙酸(4，2.3 g, 4.14 mmol) 的無水四氫呋喃溶液(30 mL)慢慢滴加到上述反應(yīng)液中，滴加完畢后，繼續(xù)保持回流1個(gè)小時(shí)。反應(yīng)液冷卻到室溫，用飽和的氯化銨(30 mL)淬滅反應(yīng), 水相用二氯甲烷萃取 (100 mL x3)。合并后的萃取液用無水硫酸鈉干燥，濃縮至干。殘余物用層析柱純化(1.25–2% MeOH/CH2Cl2)，得到0.5 g (收率:18.7%)）3-[2-(二丁氧磷酯)-8-羥甲基-9-氧-9,11-二氫-吲哚啉并[1,2-b]喹啉-7-基]-3-羥基-戊酸叔丁酯(5)，呈黃色固體。
實(shí)施例5：二丁基 (5-乙基-5-羥基-3,15-二氧-1,3,4,5,13,15-六氫氧卓[3',4':6,7]吲哚鄰并[1,2-b]喹啉-10-基)磷酸酯 (6) 的合成
向三氟乙酸(15 mL)和二氯甲烷(15 mL)的混合溶液中加入3-[2-(二丁氧磷酯)-8-羥甲基-9-氧-9,11-二氫-吲哚啉并[1,2-b]喹啉-7-基]-3-羥基-戊酸叔丁酯(5，1.00 g, 1.55 mmol)，該體系在室溫 攪拌10小時(shí)，然后把反應(yīng)液倒入冰水中，水相用二氯甲烷萃取(50 mL x3)。合并后的有機(jī)相用飽和的食鹽水洗滌(30 mL x3), 用無水硫酸鈉干燥，接著濃縮至干。殘余物用柱層析純化 (1.25–2%MeOH/CH2Cl2) ，得到0.35 g (收率：40%)二丁基 (5-乙基-5-羥基-3,15-二氧-1,3,4,5,13,15-六氫氧卓[3',4':6,7]吲哚鄰并[1,2-b]喹啉-10-基)磷酸酯 (6)，呈黃色固體。
實(shí)施例6：10-羥基喜樹堿的合成
向溶有二丁基 (5-乙基-5-羥基-3,15-二氧-1,3,4,5,13,15-六氫氧卓[3',4':6,7]吲哚鄰并[1,2-b]喹啉-10-基)磷酸酯(0.4 g, 0.7 mmol) 的異丙醇溶液 (10 mL), 加入氟化銫 (1.1 g, 7 mmol), 反應(yīng)物于室溫下反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)液直接用Combi flash純化(MeCN/H2O), 得到0.05 g（收率：13%）10-羥基喜樹堿 ，呈黃色固體。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ10.34 (s, 1H), 8.45 (s, 1H), 8.01 (d, J = 9.2 Hz, 1H),7.44-7.28 (m, 3H), 6.01 (s, 1H), 5.52 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.38 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 5.22 (s, 2H), 3.47 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 3.04 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 1.88-1.82 (m, 2H), 0.86 (t, J = 7.6 Hz, 3H). MS Calcd.: 378.0 Found: 379.1 ([M+1]+)。
本發(fā)明所述的2-((5-乙基-5-羥基-3,15-二氧-1,3,4,5,13,15-六氫氧卓[3',4':6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-11-基)氧)乙酸(簡稱：高喜樹堿-10-氧代乙酸；桑迪亞登記號(hào)：S60623)，合成路線如下：
。
實(shí)施例7：10-羥基喜樹堿二鈉鹽(7)的合成
10-羥基喜樹堿 (1，7.2 g, 20 mmol)、 NaOH (1.66 g, 41.4 mmol) 和水 (250 mL) 的混合物在50 oC攪拌1.5小時(shí)。反應(yīng)液凍干后得到9 g（理論收率）10-羥基喜樹堿二鈉鹽(7)， 呈黃色固體。
實(shí)施例8：喜樹堿-10-氧代乙酸叔丁酯(8)的合成
10-羥基喜樹堿二鈉鹽(7, 9 g, 8.22 mmol) 懸浮于 DMF (80 mL) 中，加入 K2CO3(2.27 g, 16.43 mmol) 和 溴乙酸叔丁酯 (3.2 g, 16.43 mmol)。反應(yīng)在室溫下攪拌過夜后倒入1 L 水中并用800 mL 的乙酸乙酯萃取。得到的有機(jī)層用800 mL水洗兩次并濃縮后得到8 g (收率: 84%)喜樹堿-10-氧代乙酸叔丁酯(8), 呈黃色固體。
1HNMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 8.52 (s, 1H), 8.10-8.07 (m, 1H), 7.55-7.47 (m,2H), 7.28 (s,1H), 6.54 (s,1H), 5.42 (s,2H), 5.24 (s, 2H), 4.86 (s, 2H), 1.91-1.82 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 0.90-0.84 (m, 3H). MS: m/z 478.9 (M+H+)。
實(shí)施例9： 2-(((4S)-4-乙基-3,4-二羥基-14-氧-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃[3',4':6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-9-基)氧)乙酸叔丁酯 (9)的合成
向喜樹堿-10-氧代乙酸叔丁酯(8, 8 g, 21 mmol) 在甲醇 (150 mL) 的懸濁液中分批加入 NaBH4 (1.6 g, 42 mmol)。反應(yīng)在室溫下攪拌過夜并用飽和NH4Cl 溶液 (10 mL) 淬滅。經(jīng)濃縮去掉溶劑后得到2-(((4S)-4-乙基-3,4-二羥基-14-氧-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃[3',4':6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-9-基)氧)乙酸叔丁酯 (9)的粗品。
實(shí)施例10： 2-((8-((甲酰氧基)甲基)-9-氧7-丙酰基-9,11-二氫吲哚鄰并[1,2-b]喹啉-2-基)氧)乙酸叔丁酯 (10)的合成
化合物2-(((4S)-4-乙基-3,4-二羥基-14-氧-3,4,12,14-四氫-1H-吡喃[3',4':6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-9-基)氧)乙酸叔丁酯 (9)用丙酮和水 (1/1, 300 mL)溶解后加入高碘酸鈉 (22.5 g, 105 mmol)。反應(yīng)在50 oC 下攪拌過夜。丙酮用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除掉后，殘留物用水 (200 mL) 和 二氯甲烷 (300 mL)分層。有機(jī)層先用300 mL水洗兩次，再用無水硫酸鈉干燥后濃縮。殘留物用硅膠柱純化(DCM/MeOH = 80/1) 后得到3.5 g(兩步收率: 37%)2-((8-((甲酰氧基)甲基)-9-氧7-丙?；?9,11-二氫吲哚鄰并[1,2-b]喹啉-2-基)氧)乙酸叔丁酯 (10), 呈黃色固體。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.55 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.08 (d, J = 9.2 Hz,1H), 7.55 (dd, J = 9.2, 2.0 Hz,1H), 7.48 (d, J = 2.4 Hz,1H), 7.34 (s,1H), 5.29 (s,2H), 5.11 (s, 2H), 4.87 (s, 2H), 3.01 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS: m/z 433.2 (M+H+)。
實(shí)施例11：3-(2-(2-(叔-丁氧基)-2-氧乙氧基)-8-(羥甲基)-9-氧-9,11-二氫吲哚啉并[1,2-b]喹啉-7-基)-3-羥基戊酸叔丁酯(11)的合成
向鋅粉 (2.8 g, 43 mmol) 在無水四氫呋喃 (50 mL) 的懸濁液中加入三甲基氯硅烷 (464 mg, 4.3 mmol)。 反應(yīng)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流30分鐘。將油浴鍋移除，并向反應(yīng)瓶中滴加溴乙酸叔丁酯(6.7 g, 34.4 mmol)，滴加速度應(yīng)保持反應(yīng)始終回流。然后加入化合物5 (1.5 g, 3.14 mmol) 并在室溫下攪拌過夜。 反應(yīng)液用乙酸乙酯(150 mL) 和 1N 磷酸水溶液 (150 mL) 分層。有機(jī)層分別用水 (100 mL) 和 飽和食鹽水 (100 mL) 洗, 經(jīng)無水硫酸鈉干燥后濃縮。殘留物用硅膠柱純化(DCM/MeOH = 50/1) 得到化合物1.1 g(收率：62%)3-(2-(2-(叔-丁氧基)-2-氧乙氧基)-8-(羥甲基)-9-氧-9,11-二氫吲哚啉并[1,2-b]喹啉-7-基)-3-羥基戊酸叔丁酯(11)，呈黃色固體。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.51 (s, 1H), 8.08 (d, J = 9.2 Hz,1H), 7.53 (dd, J = 9.2, 2.8 Hz,1H), 7.46 (d, J = 2.8 Hz,1H), 7.27 (s,1H), 5.72 (s,1H), 5.24 (s,2H), 4.87 (s, 2H), 4.77 (s, 2H), 3.08 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 2.72 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 2.04-1.88 (m, 2H), 1.47 (s, 9H), 1.23 (s, 9H), 0.79 (t,J = 7.2 Hz, 3H). MS: m/z 567.3 (M+H+)。
實(shí)施例12：高喜樹堿-10-氧代乙酸的合成(S60623)
3-(2-(2-(叔-丁氧基)-2-氧乙氧基)-8-(羥甲基)-9-氧-9,11-二氫吲哚啉并[1,2-b]喹啉-7-基)-3-羥基戊酸叔丁酯(11，1.1 g, 1.94 mmol) 溶于二氯甲烷和三氟乙酸中 (1/1, 40 mL) 并在室溫下攪拌過夜。 反應(yīng)液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后的得到800 mg(收率: 95%)喜樹堿-10-氧代乙酸(S60623)，呈黃色固體。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.53 (s, 1H), 8.08 (d, J = 9.2 Hz,1H), 7.55 (dd, J = 9.2, 2.4 Hz,1H), 7.50 (d, J = 2.8 Hz,1H), 7.36 (s,1H), 5.52 (d,J = 15.2 Hz, 1H), 5.38 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.25 (s, 2H), 4.89 (s, 2H), 3.47 (d, J = 14 Hz, 1H), 3.06 (d, J = 14 Hz, 1H), 1.86-1.84 (m, 2H), 0.86 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS: m/z 436.9 (M+H+)。
下面是酯和各種酰胺的合成路線。
實(shí)施例13：2-((5-乙基-5-羥基-3,15-二氧-1,3,4,5,13,15-六氫氧卓[3',4':6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-10-基)氧)乙酰甲酯（簡稱：高喜樹堿-10-氧代乙酸甲酯，S60628）
向化合物喜樹堿-10-氧代乙酸(S60623, 50 mg, 0.115 mmol) 在DMF (1 mL) 的溶液中依次加入HOBt(31 mg, 0.23 mmol)、 EDCI (44 mg, 0.23 mmol)、 DMAP (28 mg, 0.23 mmol) 和甲醇 (0.01 mL)。 反應(yīng)在室溫下攪拌30分鐘并用 prep-HPLC (HCl) 純化得到6 mg喜樹堿-10-氧代乙酸甲酯的合成(S60628)的鹽酸鹽 (收率: 12% )，呈黃色固體。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.53 (s, 1H), 8.08 (d, J = 8.8 Hz,1H), 7.55 (dd, J = 9.2, 2.4 Hz,1H), 7.52 (d, J = 2.8 Hz,1H), 7.36 (s,1H), 6.00 (s,1H), 5.52 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 5.25 (s, 2H), 5.01 (s, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.47 (d, J = 14 Hz, 1H), 3.06 (d, J = 14 Hz, 1H), 1.86-1.84 (m, 2H), 0.86 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS: m/z 450.9 (M+H+)。
實(shí)施例14：2-((5-乙基-5-羥基-3,15-二氧-1,3,4,5,13,15-六氫氧卓[3',4':6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-10-基)氧)乙酰胺（簡稱：高喜樹堿-10-氧代乙酰胺，S60627）
向向化合物喜樹堿-10-氧代乙酸(S60628, 50 mg, 0.115 mmol) 和 HATU (87 mg, 0.23 mmol) 在DMF (1 mL) 的溶液中加入DIEA (59 mg, 0.46 mmol) 并在室溫下攪拌10分鐘。 然后加入氯化銨 (9 mg, 0.17 mmol) 并攪拌30分鐘。 反應(yīng)經(jīng) prep-HPLC (HCl) 純化后得到7 mg (收率: 14%)高喜樹堿-10-氧代乙酰胺(S60627)，呈黃色固體。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.54 (s, 1H), 8.09 (d, J = 8.8 Hz,1H), 7.69 (brs, 1H), 7.59 (dd, J = 9.6, 2.8 Hz,1H), 7.49-7.46 (m, 2H), 7.36 (s,1H), 5.52 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.25 (s, 2H), 4.63 (s, 2H), 3.47 (overlap, 1H), 3.06 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 1.88-1.83 (m, 2H), 0.86 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS: m/z 435.9 (M+H+)。
實(shí)施例15：2-((5-乙基-5-羥基-3,15-二氧-1,3,4,5,13,15-六氫氧卓[3',4':6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-10-基)氧)乙酰環(huán)丁胺 （簡稱：高喜樹堿-10-氧代乙酰環(huán)丁胺，S60629）
化合物S60629的制備類似于實(shí)施例14。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.53 (s, 1H), 8.41 (d, J = 7.6 Hz,1H), 8.10 (d, J = 9.2 Hz,1H), 7.61 (dd, J = 9.2, 2.8 Hz,1H), 7.48 (d, J = 3.2 Hz,1H), 7.35 (s,1H), 6.00 (s,1H), 5.52 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.25 (s, 2H), 4.64 (s, 2H), 4.33-4.28 (m, 1H), 3.47 (d, J =13.2 Hz, 1H), 3.06 (d, J = 14 Hz, 1H), 2.18-2.14 (m, 2H), 2.05-1.97 (m, 2H), 1.89-1.83 (m, 2H), 1.68-1.61 (m, 2H), 0.86 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS: m/z 490.0 (M+H+)。
實(shí)施例16：5-乙基-5-羥基-10-(2-氧-2-（吡咯-1-基)乙氧基）-4,5-二氫氧卓[3',4':6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-3,15(1H,13H)-二酮（簡稱：N-四氫吡咯-高喜樹堿-10-氧代乙酰胺，S60622）
化合物S60622的制備類似于實(shí)施例14。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.52 (s, 1H), 8.07 (d, J = 8.8 Hz,1H), 7.55 (dd, J = 9.2, 2.8 Hz,1H), 7.46 (d, J = 2.8 Hz,1H), 7.36 (s,1H), 5.52 (d,J = 15.2 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.25 (s, 2H), 4.94 (s, 2H), 3.35-4.46 (m, 3H), 3.35 (t, J =7.0 Hz, 2H), 3.06 (d, J = 14 Hz, 1H), 1.96-1.93 (m, 2H), 1.87-1.79 (m, 4H), 0.86 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS: m/z 490.0 (M+H+)。
實(shí)施例17：5-乙基-5-羥基-10-(2-嗎啡啉-2-氧乙氧基）-4,5-二氫氧卓[3',4':6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-3,15(1H,13H)-二酮（簡稱：N-嗎啡啉-高喜樹堿-10-氧代乙酰胺，S60624）
化合物S60624的制備類似于實(shí)施例14。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.52 (s, 1H), 8.07 (d, J = 9.2 Hz,1H), 7.55 (dd, J = 9.2, 2.8 Hz,1H), 7.47 (d, J = 2.8 Hz,1H), 7.36 (s,1H), 5.52 (d,J = 15.2 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.25 (s, 2H), 5.05 (s, 2H), 3.67-4.45 (m, 9H), 3.06 (d, J = 14 Hz, 1H), 1.87-1.85 (m, 2H), 0.86 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS: m/z 506.0 (M+H+)。
實(shí)施例18：5-乙基-5-羥基-10-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-氧乙氧基-4,5-二氫氧卓[3',4':6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-3,15(1H,13H)-二酮（簡稱：N-(N’-甲基-嗎啡啉)-高喜樹堿-10-氧代乙酰胺，S60626）
化合物S60626的制備類似于實(shí)施例14。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 10.47 (brs, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.08 (d, J = 9.2 Hz,1H), 7.57 (dd, J = 9.2, 2.8 Hz,1H), 7.49 (d, J = 2.8 Hz,1H), 7.36 (s,1H), 5.52 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 5.26 (s, 2H), 5.12-5.09 (m, 2H), 4.43 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 4.11-4.09 (m,1H), 3.51-3.45 (m,4H), 3.15-2.98 (m,4H), 2.82 (s, 3H), 1.87-1.85 (m, 2H), 0.86 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS: m/z 519.0 (M+H+)。
實(shí)施例19：2-((5-乙基-5-羥基-3,15-二氧-1,3,4,5,13,15-六氫氧卓[3',4':6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-10-基)氧)-N-(2-甲氧基乙基)乙酰胺（簡稱：N-甲氧基乙基-高喜樹堿-10-氧代乙酰胺，S60625）
化合物S60625的制備類似于實(shí)施例14。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.52 (s, 1H), 8.27 (t, J = 5.6 Hz,1H), 8.09 (d, J = 9.2 Hz,1H), 7.60 (dd, J = 9.2, 2.8 Hz,1H), 7.49 (d, J = 2.8 Hz,1H), 7.35 (s,1H), 6.02 (s,1H), 5.52 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.25 (s, 2H), 4.69 (s, 2H), 3.49-3.35 (m, 3H), 3.24 (s,3H), 3.06 (d,J = 13.6 Hz, 1H), 1.90-1.83 (m, 2H), 0.86 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS: m/z 494.0 (M+H+).
實(shí)施例20：2-((5-乙基-5-羥基-3,15-二氧-1,3,4,5,13,15-六氫氧卓[3',4':6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-10-基)氧-N-(2-羥基乙基)乙酰胺（簡稱：N-羥乙基-高喜樹堿-10-氧代乙酰胺，S60632）
化合物S60632的制備類似于實(shí)施例14。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.53 (s, 1H), 8.19 (t, J = 5.6 Hz,1H), 8.09 (d, J = 9.2 Hz,1H), 7.60 (dd, J = 9.2, 2.4 Hz,1H), 7.50 (d, J = 2.4 Hz,1H), 7.36 (s,1H), 5.52 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.25 (s, 2H), 4.69 (s, 2H), 3.49-3.45 (m, 3H), 3.27-3.17 (m,2H), 3.06 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 1.87-1.83 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS: m/z 479.9 (M+H+)。
實(shí)施例21：2-((5-乙基-5-羥基-3,15-二氧-1,3,4,5,13,15-六氫氧卓[3',4':6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-10-基)氧-N-(2-(吡咯-1-基)乙基)乙酰胺（簡稱：N-(1-四氫吡咯乙基)-高喜樹堿-10-氧代乙酰胺，S60630）
化合物S60630的制備類似于實(shí)施例14。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 10.54 (s, 1H), 8.60-8.55 (m, 2H), 8.10 (d, J = 8.8 Hz,1H), 7.64 (dd, J = 9.2, 2.4 Hz,1H), 7.58 (d, J = 2.4 Hz,1H), 7.36 (s,1H), 5.52 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.25 (s, 2H), 4.76 (s, 2H), 3.59-3.45 (m, 5H), 3.29-3.26 (m,2H), 3.08-2.97 (m, 3H), 1.89-1.83 (m, 4H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS: m/z 533.0 (M+H+)。
實(shí)施例22：4-(2-((5-乙基-5-羥基-3,15-二氧-1,3,4,5,13,15-六氫氧卓[3',4':6,7] 吲哚啉并[1,2-b]喹啉-10-基)氧)乙?；?哌嗪-1-碳酸叔丁酯 (12)
該步的制備類似于實(shí)施例14。
實(shí)施例23：5-乙基-5-羥基-10-(2-氧-2-(哌嗪-1-基)乙氧基)-4,5-二氫氧卓[3',4':6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-3,15(1H,13H)-二酮（簡稱：N-哌嗪-高喜樹堿-10-氧代乙酰胺，S60631）
向化合物4-(2-((5-乙基-5-羥基-3,15-二氧-1,3,4,5,13,15-六氫氧卓[3',4':6,7] 吲哚啉并[1,2-b]喹啉-10-基)氧)乙?；?哌嗪-1-碳酸叔丁酯 (12，270 mg, 0.46 mmol) 在乙酸乙酯 (10 mL) 的溶液中加入HCl/dioxane (6 M, 10 mL)。 反應(yīng)在室溫下攪拌30分鐘并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。殘留物用乙酸乙酯打漿后得到化合物300 mg粗品的N-哌嗪-高喜樹堿-10-氧代乙酰胺，取其中40 mg用于 prep-HPLC分離，得到8 mg純品（鹽酸鹽），產(chǎn)品呈黃色固體。
1HNMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 9.27 (brs, 1H), 8.51 (s, 1H), 8.08 (d, J = 9.2 Hz,1H), 7.57 (dd, J = 9.2, 2.8 Hz,1H), 7.49 (d, J = 2.4 Hz,1H), 7.36 (s,1H), 5.52 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.39 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 5.26 (s, 2H), 5.10 (s, 2H), 3.76-3.72 (m,5H), 3.37-3.35 (m,2H), 3.11-3.04 (m,3H), 1.87-1.85 (m, 2H), 0.86 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS: m/z 505.0 (M+H+)。
實(shí)施例23：5-乙基-5-羥基-10-(2-氧-2-(4-(5-((3aS,4S,6aR)-2-氧六氫-1H-噻酚啉并[3,4-d]咪唑-4-基)戊?；?哌嗪-1-基)乙氧基)-4,5-二氫氧卓[3',4':6,7]吲哚啉并[1,2-b]喹啉-3,15(1H,13H)-二酮（S60633）
向生物素 (78 mg, 0.32 mmol) 和HATU (182 mg, 0.48 mmol) 在DMF (2 mL) 的溶液中加入DIEA (165 mg, 1.28 mmol) 并在室溫下攪拌10分鐘。 然后加入化合物S60631 (80 mg, 0.16 mmol) 并在室溫下攪拌30分鐘。 反應(yīng)液直接用prep-HPLC (HCl) 純化后得到40 mg S60633(收率:35%)，呈黃色固體。
1HNMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 8.52 (s, 1H), 8.08 (d, J = 9.2 Hz,1H), 7.57-7.49 (m, 2H), 7.36 (s,1H), 5.52-5.39 (m,2H), 5.25 (s, 2H), 5.08 (s, 2H), 4.23-4.10 (m,4H), 3.58-3.45 (m,4H), 3.16-3.02 (m,3H), 2.86-2.79 (m,2H), 2.62-2.56 (m,2H), 2.38-2.27 (m,3H), 1.89-1.81 (m, 2H), 1.61-1.29 (m, 5H), 0.86 (t,J = 7.2 Hz, 3H). MS: m/z 731.0 (M+H+)。
根據(jù)實(shí)施例獲得的化合物，我們進(jìn)行數(shù)據(jù)測試和比對(duì)：
表()：水相中溶解度對(duì)比數(shù)據(jù)
*注：物質(zhì)濃度為10 mM (DMSO) 。
另外，我們還做了體外活性實(shí)驗(yàn)見圖1，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，我們12個(gè)化合物（S60622、S60623、S60624、S60625、S60626、S60627、 S60628、S60629、S60630、S60631、S60632和S60633）對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶活性都有一定的抑制作用。
用Image J軟件對(duì)圖1的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行灰度值分析，并計(jì)算Super DNA與Relaxed DNA的比值，結(jié)果如下表()：
表()：凝膠電泳灰度值分析
在正常條件下，添加Topo酶的情況下，Super DNA的量顯著減少，條帶肉眼不可見，與Relaxed DNA的比值約為0；分別加入12個(gè)待測化合物后（S60622、S60623、S60624、S60625、S60626、S60627、 S60628、S60629、S60630、S60631、S60632和S60633），Super DNA與Relaxed DNA的比值分別為0.44、0.34、0.36、0.39、0.36、0.38、0.36、0.40、0.29、0.32、0.40、0.46；比值均大于僅含拓?fù)洚悩?gòu)酶和Super DNA的情況。在添加喜樹堿的條件下，super DNA的比例最多，數(shù)值達(dá)到0.86。
盡管我們的化合物活性比參照化合物喜樹堿要低一倍左右，但我們的化合物的溶解度提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，而且，該測試化合物均為消旋體結(jié)果，若是(S)-異構(gòu)體，活性應(yīng)該是相當(dāng)或是超出?？梢钥隙ǖ氖?，在活性差不多的情況下，這些化合物的(S)-異構(gòu)體生物利用度要比喜樹堿好很多，表現(xiàn)出較好的臨床應(yīng)用前景。
本發(fā)明中，我們合成了14個(gè)具有代表性的化合物，有羧酸，甲酯以及酰胺，在這些酰胺中，我們還合成了S60633，該化合物在表()中，對(duì)Topo酶具有最好的抑制性，另外，我們還期望它擁有良好的靶標(biāo)識(shí)別功能，具有可展望的應(yīng)用前景。具體化合物見下表（Ⅲ）：
表（Ⅲ）代表性化合物
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