本發(fā)明涉及微生物代謝工程，糖代謝和共利用以及微生物發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的領域。具體地說，本發(fā)明提供了能夠在較高溫度下(42℃)同時共利用葡萄糖和木糖共發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的耐熱工程酵母。
背景技術：
：丙酮酸的合成方法主要包括化學合成法、酶轉化法和發(fā)酵法?；瘜W合成法通過在液相或氣相中將乳酸酯(或酒石酸)氧化為丙酮酸酯，然后水解成丙酮酸，是目前丙酮酸生產(chǎn)的主要方法，已實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。但是化學合成法存在污染嚴重、成本高等比較明顯的缺點(Causeyetal.,2004)。酶法合成丙酮酸由于具有反應混合物組成簡單、高底物轉化率、產(chǎn)品純度高、后續(xù)分離提取費用低廉和操作簡單等優(yōu)點而成為生物技術法生產(chǎn)丙酮酸研究中的另一個熱點。可用于酶法生產(chǎn)丙酮酸的底物有乳酸、酒石酸、富馬酸、丙二醇等。酶法雖然具有較高的轉化率，但底物成本比較高、來源較窄，限制了其進一步推廣應用(Causeyetal.,2004；Xuetal.,2008)。發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸包括直接利用微生物中的一系列酶(如EMP途徑酶系)完成由底物(如葡萄糖)積累丙酮酸的直接發(fā)酵法(fermentativemethod)和利用微生物中某一種特定功能的酶完成由底物向丙酮酸的轉化(即微生物先生長，再轉化底物為丙酮酸)的休止細胞法(restingcellmethod)。采用休止細胞法生產(chǎn)丙酮酸的主要優(yōu)點是可縮短發(fā)酵時間。但丙酮酸產(chǎn)量略低于直接發(fā)酵法，且操作繁瑣，容易染菌，因此不太可能在工業(yè)生產(chǎn)中得到應用(Causeyetal.,2004；Xuetal.,2008)。發(fā)酵法是生物技術法生產(chǎn)丙酮酸中開展得最早的、也是研究得最多最深入的生產(chǎn)方法。但發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸的問題是轉化率比較低，這是因為丙酮酸作為糖酵解途徑的最終產(chǎn)物，處于代謝途徑中的關鍵代謝支點，在細胞中很容易代謝為其它產(chǎn)物，難以積累。只有切斷或弱化丙酮酸的進一步代謝，才能達到使其在細胞中積累并分泌到胞外的目的(Causeyetal.,2004；Wangetal.,2005)。比較丙酮酸的各種生產(chǎn)方法可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸無疑是擴大丙酮酸應用領域的根本途徑。能夠以糖質原料發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的微生物包括細菌、放線菌和酵母。在酵母中研究的菌株有假絲酵母(Candida)、球擬酵母(Torulopsis)、德巴利酵母(Debaryomyces)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。Torulopsis是研究得最多的、也是目前工業(yè)化生產(chǎn)上所用的菌株。從耐高滲環(huán)境中篩選出來的Torulopsis在一般培養(yǎng)條件下，對葡萄糖的丙酮酸產(chǎn)率比較低(0.41g/g)。對該菌株進行誘變，增加一系列遺傳標記如L-纈氨酸和L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型、丙酮酸脫羧酶活性降低菌株等，丙酮酸產(chǎn)率提高到了0.54g/g。除了Torulopsis之外，Debaryomyces(42g/L)和Saccharomycescerevisiae(36.9g/L)積累丙酮酸的能力也不弱，其產(chǎn)率(0.37-0.44g/g)雖然不及Torulopsis，但這些酵母能以無機銨鹽為唯一氮源，這點是大多數(shù)Torulopsis不具備的。在已有的文獻報道中，酵母積累丙酮酸一般都以葡萄糖為底物。相對而言，細菌積累丙酮酸時所能利用的底物種類相對更多一些(如葡萄糖、葡萄糖醛酸、丙二醇和丙酸)。這些細菌生產(chǎn)丙酮酸的產(chǎn)率雖然不是很低，但產(chǎn)量不高(Causeyetal.,2004；Wangetal.,2005；Xuetal.,2008)。這些篩選出來的菌株對于發(fā)酵的條件要求較高，需要調(diào)節(jié)發(fā)酵液中各種營養(yǎng)元素的比例、溫度以及供氧條件，增加了工業(yè)發(fā)酵中的費用。其次，篩選過程中篩選出的細胞的表型變化和細胞的遺傳變化難以對應，為進一步的分析和改造這些菌株帶來了困難。再次，這些菌株生產(chǎn)丙酮酸的底物都是葡萄糖，目前還未有以木糖為底物進行丙酮酸生產(chǎn)的報道。采用耐熱性酵母K.marxianus(馬克思克魯維酵母)在高溫下發(fā)酵有以下幾個優(yōu)點：1.高溫下發(fā)酵可以降低發(fā)酵中的冷卻費用；2.纖維素酶等的最適催化溫度較高，高溫會提高以淀粉、纖維素等生物質為原料的同步糖化發(fā)酵(SSF)效率，促進糖化，減少在酶上的費用(Fonsecaetal.,2008)；3.能在耐熱范圍內(nèi)生存的微生物較少，因此，高溫會降低污染的風險(Kumaretal.,2013；Kumaretal.,2009)。除此之外，馬克思克魯維酵母是一種GRAS(generalregardingassafe)酵母，廣泛的在乳制品、葡萄酒發(fā)酵制造中存在，對環(huán)境、動物及人類是安全的微生物。它能夠在較高的溫度下生長，最高達52℃，具有很高的生長速率(0.86–0.99h-1,40℃)(BanatandMarchant,1995)。馬克思克魯維酵母有很高的代謝多樣性，能利用多種工業(yè)上的底物糖類生長發(fā)酵。能利用多種廉價底物、耐熱、高生長率等特點，使其被認為是替代釀酒酵母用來進行工業(yè)發(fā)酵和外源蛋白表達的候選者(Zhangetal.,2013；Zhangetal.,2011)。由于馬克思克魯維酵母有很多比釀酒酵母優(yōu)秀的品質，馬克思克魯維酵母被越來越多的用于生物能源的生產(chǎn)(Fonsecaetal.,2008)。馬克思克魯維酵母已經(jīng)有多個菌株基因組信息公布(Jeongetal.,2012)，其代謝通路較為清楚，同時申請人有構建成熟的可以利用木糖的馬克思克魯維酵母菌株(YZJ051)(Zhangetal.,2015a；Zhangetal.,2015b)。所以利用馬克思克魯維酵母發(fā)展成丙酮酸生產(chǎn)菌株有非常重要的應用價值。木質纖維素生物質(如農(nóng)業(yè)廢物玉米秸稈等)是豐富的可再生材料，同時木質纖維素可以從農(nóng)業(yè)廢物如玉米秸稈等中獲得，不會與糧食造成競爭。因此，利用生物從可再生資源中生產(chǎn)有價值的產(chǎn)物木糖醇具有極大的經(jīng)濟和環(huán)境意義。葡萄糖和木糖是其水解液的主要兩個單糖成份，要建立經(jīng)濟的工業(yè)利用過程，需要對兩種糖的高效利用和發(fā)酵(Haetal.,2011)，但目前的方法都不夠高效，尤其是葡萄糖和木糖同時存在時，由于葡萄糖抑制效應，微生物利用木糖的能力常常被葡萄糖抑制而導致效率低下。各種工程菌株的構建，使利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇的能力不斷提高，但是葡萄糖的抑制效應常常難以解除。在構建的馬克思克魯維酵母菌株葡萄糖的抑制效應非常明顯，因此利用葡萄糖和木糖共同發(fā)酵一直是一個瓶頸。綜上所述，丙酮酸是重要的化工產(chǎn)品，廣泛用于制藥、日用化工、農(nóng)用化學品等工業(yè)及科學研究中，但其應用受限于工業(yè)生產(chǎn)的安全性與成本。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明通過基因工程的方法，首先以耐熱酵母YZJ057為基礎，敲除其丙酮酸脫羧酶基因，構建了能利用葡萄糖生產(chǎn)丙酮酸的菌株，并通過過表達KmMTH1-ΔT基因，敲除KmGPD1基因以及過表達KmGLN1基因增加重組菌株生產(chǎn)丙酮酸的產(chǎn)量和速率。然后，重組表達了酵母的木糖代謝通路，使酵母具備利用木糖生產(chǎn)丙酮酸的能力。最后，通過表達木糖特異性的轉運蛋白ScGAL2-N376F，構建了在較高溫度(42℃)下能夠同時共利用和發(fā)酵葡萄糖和木糖的高效生產(chǎn)乙醇和木糖醇的耐熱酵母K.marxianus菌株YZB058(參見圖1)。本發(fā)明通過基因工程改造獲得的菌株YZB058可以同時利用葡萄糖和木糖共發(fā)酵，在高溫下同時利用葡萄糖和木糖的混合糖溶液生產(chǎn)丙酮酸，因此在利用木質纖維素生物質水解產(chǎn)物高效生物轉化生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品上有很巨大的應用前景。本發(fā)明以能利用木糖高效生產(chǎn)乙醇的K.marxianusYZJ051菌株作為宿主，構建丙酮酸積累的代謝通路，從而提供一種能利用葡萄糖和木糖共發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的耐熱工程酵母菌株。用于本發(fā)明的代謝工程改造的載體有pMD18T-ΔScURA3，pZJ022，pZJ026，pZJ027，pZJ034，pZJ036，pZJ042，pZJ061和YEUGAP(參見，Zhangetal.,2015b；Zhangetal.,2016)以及以這些質粒為基礎構建而成的質粒。本發(fā)明中進一步構建的質粒為：⑴以K.marxianus酵母的基因組DNA為模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大連寶生物)進行PCR擴增，得到的產(chǎn)物即為KmPDC1,并將基因連接進入pMD18-T載體中，從而構建質粒pMD18-T-KmPDC1。然后以YEUGAP為模板進行PCR擴增，得到ScURA3完整表達框。利用SmaI對ScURA3完整基因進行酶切，設計引物擴增出pMD18-T-KmGPD1的整個質粒，將這兩個片段用平末端連接，從而獲得質粒pZJ056。⑵以馬克思克魯維酵母YHJ010(來源于NBRC1777)基因組為模板，PCR擴增得到基因KmMTH1，然后將基因KmMTH1用EcoRI和NotI酶切后連接pZJ042載體，從而獲得質粒pZB013。⑶以pZJ022作為模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大連寶生物)進行PCR擴增，得到的產(chǎn)物即為ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段并用XbalI酶切，將PZJ027用XbalI酶切后與ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段連接，從而構建質粒pZB022。本發(fā)明的耐熱工程酵母菌株的制備方法主要包括以下步驟：將K.marxianus工程酵母YZJ057(敲除了YZJ051中ScURA3獲得)的PDC1基因敲除，得到可以積累丙酮酸的菌株，命名為YZJ093；將含有K.marxianus來源的啟動子(KmPGKp)控制的K.marxianus酵母的MTH1基因(KmMTH1)的pZB013轉化進酵母YZJ094(敲除了YZJ093中ScURA3獲得)中，得到YZB024；將YZB043(敲除了YZJ024中ScURA3獲得)中的GPD1基因敲除，得到YZB044；將含有耐熱酵母來源的啟動子(KmPGKp)控制的谷氨酰胺合成酶基因(GLN1)的pZJ043轉化進酵母YZB046(敲除了YZB044中ScURA3獲得)中，得到YZB047；將含有戊糖磷酸途徑中的基因TAL1和TKL1的質粒pZJ026轉化進酵母YZB048中(敲除了YZB047中ScURA3獲得)，得到YZB049；將含有釀酒酵母來源的啟動子(ScGAPDHp)控制的戊糖磷酸途徑中的基因RKI1和RPE1的質粒pZB022轉化進酵母YZB050中(敲除了YZB049中ScURA3獲得)，得到YZB051；將含有樹干畢赤酵母的木糖醇脫氫酶基因突變體(PsXYL2-ARS)的質粒pZJ036轉化進酵母YZB052中(敲除了YZB051中ScURA3獲得)，得到YZB053；將含有釀酒酵母來源的啟動子(ScGAPDHp)控制的釀酒酵母來源的半乳糖通透酶基因突變體(ScGAL2-N376F)的質粒pZJ61轉化進酵母YZB054中(敲除了YZB053中ScURA3獲得)，得到YZB056；將含有釀酒酵母來源的啟動子(ScGAPDHp)控制的釀酒酵母來源的半乳糖通透酶基因突變體(ScGAL2-N376F)的質粒pZJ61轉化進酵母YZB057中(敲除了YZB056中ScURA3獲得)，得到YZB058。本發(fā)明還提供本發(fā)明的菌株(YZB058)用于通過利用葡萄糖和木糖共發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的用途。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果：本發(fā)明利用基因工程、代謝工程、分子生物學以及合成生物學的技術和方法，理性設計丙酮酸生產(chǎn)路徑，結合生物合成法高效無污染的特色和自然界發(fā)酵原料可持續(xù)獲得的優(yōu)勢，以馬克思克魯維酵母為平臺，通過優(yōu)化與耦合代謝過程分析和逆向工程等關鍵技術環(huán)節(jié)，構建出有效的丙酮酸生產(chǎn)工程菌株，同時利用葡萄糖和木糖代謝并生產(chǎn)丙酮酸，并且高溫下的發(fā)酵可以減少冷卻能耗，降低雜菌污染，并為在高溫季節(jié)和熱帶地區(qū)發(fā)酵帶來方便。本發(fā)明獲得的菌株YZB058可以在42℃條件下，同時共利用40.97g/l葡萄糖和20.37g/l木糖在36h生產(chǎn)29.21g/l丙酮酸，其生產(chǎn)速率為0.81g/l/h，總得率為0.48g/g。此菌株對于應用木質纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)高附加值的丙酮酸具有重要的意義。更具體地，本發(fā)明提供以下各項：1.一種丙酮酸高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于，所述菌株通過在雙敲除木糖還原酶基因KmXYL1和木糖醇脫氫酶基因KmXYL2并且重組入粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)的木糖還原酶基因NcXYL1和樹干畢赤酵母(Scheffersomycesstipitis)的木糖醇脫氫酶突變基因PsXYL2-ARS以及馬克思克魯維酵母的木酮糖激酶基因KmXYL3的馬克思克魯維酵母(K.marxianus)中敲除馬克思克魯維酵母的丙酮酸脫羧酶基因KmPDC1和甘油-3-磷酸脫氫酶基因KmGPD1，并且重組入馬克思克魯維酵母的葡萄糖信號感受的負調(diào)控因子MTH1的ΔT突變體基因KmMTH1-ΔT和釀酒酵母的半乳糖通透酶基因突變體ScGAL2-N376F獲得。2.根據(jù)1所述的丙酮酸高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于，所述菌株中進一步轉入馬克思克魯維酵母的谷氨酰胺合成酶基因KmGLN1。3.根據(jù)1所述的丙酮酸高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于，所述菌株中進一步轉入馬克思克魯維酵母的轉醛酶基因KmTAL1和馬克思克魯維酵母的轉酮酶基因KmTKL1。4.根據(jù)1所述的丙酮酸高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于，所述菌株中進一步轉入馬克思克魯維酵母的L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構酶基因KmRPE1和馬克思克魯維酵母的核糖-5-磷酸酮醇異構酶基因KmRKI1。5.根據(jù)1所述的丙酮酸高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于，所述菌株中進一步轉入所述樹干畢赤酵母的木糖醇脫氫酶突變基因PsXYL2-ARS。6.根據(jù)1所述的丙酮酸高溫高產(chǎn)工程菌株，其特征在于，所述菌株含有兩個拷貝的所述釀酒酵母的半乳糖通透酶基因突變體ScGAL2-N376F。7.一種丙酮酸高溫高產(chǎn)工程菌株YZB058，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.12755。9.1-8中任一項所述的丙酮酸高溫高產(chǎn)工程菌株用于利用葡萄糖和木糖共發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的用途。附圖說明圖1.根據(jù)本發(fā)明的耐熱工程酵母菌株的構建流程圖。圖2.本申請質粒的圖譜。A：質粒pMD18-T-KmPDC1；B：質粒pZJ056；C：質粒pZB013；D：質粒pZB022。圖3.工程菌株YZB058利用20g/l木糖和40g/l葡萄糖混合液共發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的結果(42℃，250rpm)。■：葡萄糖；木糖；▲：丙酮酸；甘油。具體實施方式保藏說明本發(fā)明的菌株馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)YZB058已經(jīng)于2016年7月11日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會的普通微生物中心(CGMCC，中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編：100101)，保藏號為CGMCCNo.12755。實施例試劑和菌株本發(fā)明中的所有試劑均是市場購買的試劑級以上試劑。其中，木糖，葡萄糖，甘油，酵母基本氮源，尿嘧啶，膠回收試劑盒以及所有的限制性內(nèi)切酶均來源于上海生工生物工程公司。PrimeSTARHSDNA聚合酶，SolutionI連接酶以及pMD18-T載體購自于大連寶生物公司。大腸桿菌EscherichiacoliXL10-gold菌株作為DNA操作時使用的宿主菌(美國加利福利亞Stratagene公司)，包含100μg/ml氨芐青霉素的Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基用作培養(yǎng)E.coli。葡萄糖合成培養(yǎng)基(YNB葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，尿嘧啶20mg/ml)主要用于轉化。質粒YEUGAP、pZJ042由本實驗室提供(Hongetal.,2007；Zhangetal.,2015b)。YPD培養(yǎng)基(10g/l酵母提取物,20g/l蛋白胨,20g/l葡萄糖)用于酵母的前培養(yǎng)。YPX(10g/l酵母提取物，20g/l細菌學蛋白胨，40g/l木糖，80g/l葡萄糖)用于發(fā)酵培養(yǎng)基。馬克思克魯維酵母YZB058菌株保存在中國微生物菌種保藏管理委員會的普通微生物中心，菌株號CGMCCNo.12755。實施例1、菌株的制備1.提取酵母基因組的具體操作步驟為：①.挑取單克隆，接入5ml液體YPD中，37℃，250rpm，培養(yǎng)24h。②.常溫下12000rpm，5sec離心收菌，棄上清。③.500μl蒸餾水重懸菌體，12000rpm，5sec離心收菌，棄上清。④.取200μl實驗室自配1xbreaking緩沖液(TritonX-100(2％(w/v))，SDS(1％(w/v)),NaCl(100mM),Tris-Cl(10mM,pH8.0),EDTA(1mM))重懸菌體，并將菌液轉入到含有0.3g玻璃珠(425-600um，sigma，美國)的EP管內(nèi)。⑤.加入200μl酚氯仿溶液后，高速震蕩3min，加入200μl1xTE(10mMTris-Cl,pH8.0,1mMEDTA)。輕微震蕩。⑥.12000rpm，離心5min，取最上層清液轉入新的EP管內(nèi)，加入1ml預冷的無水乙醇。⑦.12000rpm,4℃，離心10min，棄上清，室溫下干燥沉淀，并用400μl1xTE重懸沉淀。⑧.加入2μlRNase(RNA水解酶,中國上海生工生物)，2mg/ml)到EP管內(nèi)，混勻，37℃，酶切1h。⑨.取40μl3M醋酸鈉(pH5.2)加入到管內(nèi)，混勻并加入1ml預冷的無水乙醇。⑩.12000rpm，4℃，離心30min，棄上清室溫下干燥。用100μl無菌水重懸沉淀，此即酵母基因組DNA。2.pMD18-T-KmPDC1和pZJ056的構建：以馬克思克魯維酵母YHJ010基因組(NBRC1777，△KmURA3::KANr,△KmLEU2::HISG，△KmTRP1::HISG，參見Hongetal.,2007)為模板，以KMPDC1-F(SEQIDNO:1)，KMPDC1-R(SEQIDNO:2)為引物，PCR擴增得到基因KmPDC1，然后將基因KmPDC1插入pMD18-T載體，從而得到pMD18-T-KmPDC1載體。然后以YEUGAP為模板，以SCURA3-SMAI-F(SEQIDNO:3)，SCURA3-SMAI-R(SEQIDNO:4)為引物，進行PCR擴增得到ScURA3完整表達框。利用SmaI對ScURA3完整基因進行酶切。然后以pMD18-T-KmPDC1為模板，以KMPDC1-MF(SEQIDNO:5)，KMPDC1-MR(SEQIDNO:6)為引物，進行PCR擴增得到pMD18-T-KmPDC1整個質粒。將ScURA3完整基因酶切產(chǎn)物和pMD18-T-KmPDC1質粒PCR產(chǎn)物連接，從而獲得質粒pZJ056(圖2)。具體操作如下：⑴以馬克思克魯維酵母YHJ010基因組為模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶進行PCR擴增得到KmGPD1。然后將KmGPD1插入pMD18-T載體，從而得到pMD18-T-KmPDC1載體。KmPDC1的PCR體系：PCR程序得到KmPDC1后，在DNA末端分別加上“A”堿基后，插入pMD18-T載體(購自大連寶生物)中。加A體系：TA克隆連接體系：將獲得了KmPDC1的pMD18-T載體，命名為pMD18-T-KmPDC1載體。⑵以YEUGAP為模板，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶進行PCR擴增，得到ScURA3完整表達框。利用SmaI對ScURA3完整表達框進行酶切，PCR擴增pMD18-T-KmPDC1，然后連接，從而獲得質粒pZB013。ScURA3完整表達框的PCR體系：對應PCR程序：ScURA3完整表達框的酶切體系：pMD18-T-KmPDC1完整質粒的PCR體系：對應PCR程序：ScURA3完整表達框和pMD18-T-KmPDC1載體的連接體系：⑶將獲得的ScURA3完整表達框-KmPDC-T載體的質粒，命名為pZJ056。3.pZB013的構建：提取馬克思克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)YHJ010的基因組，并將提取的基因組稀釋100倍作為模板，以KMMTH1-F(SEQIDNO:7)和KMMTH1-R為引物(SEQIDNO:8)，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大連寶生物)進行PCR，得到的產(chǎn)物即為KmMTH1,并將KmMTH1基因和pZJ042載體利用EcoRI和NotI雙酶切，連接起來，再用KMMTH1-Δ-F和KMMTH1-Δ-R擴增后轉化，從而獲得質粒pZB013(圖2)。具體的操作如下：⑴KmMTH1的PCR體系：PCR程序：⑵將擴增產(chǎn)物KmMTH1與pZJ042載體分別利用EcoRI和NotI進行雙酶切，連接。KmMTH1的酶切體系：pZJ042載體的酶切體系：⑶KmMTH1和pZJ042載體的連接體系：⑷KmMTH1-ΔT的PCR體系：PCR程序：⑸將獲得的插入了KmMTH1-ΔT的pZJ042質粒，命名為pZB013。3.pZB022的構建：以pZJ022作為模板，SCGAP-XBALI-F(SEQIDNO:9)和TER-XBAL-R(SEQIDNO:10)作為引物，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(大連寶生物)進行PCR，得到的產(chǎn)物即為ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段,并將ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDH片段和pZJ027載體利用XbalI酶切，連接，從而獲得質粒pZB022(圖2)。具體的操作如下：⑴ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段的PCR體系：PCR程序：⑵將擴增產(chǎn)物ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段與pZJ027載體分別利用XbalI進行酶切，連接，從而構建質粒pZB022。ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段的酶切體系：pZJ027載體的酶切體系：ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段和pZJ027載體的連接體系：⑶將獲得的插入了ScGAPDHp-KmRPE1-ScGAPDHt片段的pZJ027質粒，命名為pZB022(圖2)。4.pMD18T-ScURA3敲除片段質粒的構建敲除質粒根據(jù)文獻(Zhangetal.,2015b)制備，是以YEUGAP為模板，通過PCR擴增出ScURA3的前322bp片段和第487bp之后的片段，再通過融合PCR獲得缺失了165bp的ScURA3敲除框，并將其插入pMD18-T載體構建而成。5.將構建的載體轉入改造后的耐熱酵母：1)酵母化學轉化步驟:①.各種改造菌株在YPD平板上劃線，37℃培養(yǎng)24h。②.取5ml液體YPD，并分別在YPD平板上挑取單克隆，37℃，250rpm，培養(yǎng)18h。③.取1ml培養(yǎng)物轉接與裝入9ml液體YPD的50ml三角瓶內(nèi)，37℃，250rpm，搖床培養(yǎng)5h。④.取出培養(yǎng)物，常溫下離心5000rpm，3min，棄上清液，保留菌體。⑤.配制1ml轉化緩沖液：800μl50％PEG4000；50μl4M醋酸鋰；50μlddH2O；100μl1MDTT(溶于10mM醋酸鈉,pH5.2)。⑥.使用200μl轉化緩沖液重懸菌體，5000rpm，離心3min，去上清。⑦.用100μl轉化緩沖液重懸浮菌體，加入5μl(1-10μg)線性化的質粒,輕微震蕩30sec。⑧.在47℃條件下水浴15min。⑨.將菌體涂布于含有亮氨酸(Leu)或尿嘧啶(Ura)的合成培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2天。⑩.挑取板上克隆在液體YPD中培養(yǎng)，提取基因組，并通過PCR鑒定轉化結果。2)本發(fā)明構建耐熱酵母表達菌株的具體過程：作為構建起點的馬克思克魯維酵母(K.marxianus)菌株YZJ051通過在雙敲除木糖還原酶基因KmXYL1和木糖醇脫氫酶基因KmXYL2的馬克思克魯維酵母中重組入粗糙脈孢霉(Neurosporacrassa)的木糖還原酶基因NcXYL1和樹干畢赤酵母(Scheffersomycesstipitis)的木糖醇脫氫酶突變基因PsXYL2-ARS以及馬克思克魯維酵母的木酮糖激酶基因KmXYL3而獲得(其構建可參見非專利文獻Zhangetal.,2015a和Zhangetal.,2015b以及專利文獻CN104164375)。以pMD18T-ScURA3敲除片段為模板，PCR擴增ScURA3敲除片段。將ScURA3敲除片段轉化入YZJ051中，同源重組后，使菌株YZJ051內(nèi)的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，瓊脂15g/L)和5’-FOA的平板上篩選ScURA3敲除菌株，獲得的菌株命名為YZJ057。以pZJ056敲除片段為模板，PCR擴增KmPDC1-T-ScURA3基因。將KmPDC1-T-ScURA3基因片段轉化入YZJ057中，同源重組后，使菌株YZJ057內(nèi)的KmPDC1被敲除，同時使菌株恢復URA3基因的功能。在合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，瓊脂15g/L)上篩選陽性克隆，命名為YZJ093。以pMD18T-ScURA3敲除片段為模板，PCR擴增ScURA3敲除片段。將ScURA3敲除片段轉化入YZJ093中，同源重組后，使菌株YZJ093內(nèi)的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，瓊脂15g/L)和5’-FOA的平板上篩選ScURA3敲除菌株，獲得的菌株命名為YZJ094。用SmaI酶切pZB013載體。將酶切產(chǎn)物轉化至YZJ094，使菌株獲得Ura3基因，恢復Uracil的合成的能力，同時獲得重組表達的KmMTH1基因。在合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，瓊脂15g/l)上篩選陽性克隆，獲得的菌株命名為YZB024。以pMD18T-ScURA3敲除片段為模板，PCR擴增ScURA3敲除片段。將ScURA3敲除片段轉化入YZB024中，同源重組后，使菌株YZB024內(nèi)的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，瓊脂15g/L)和5’-FOA的平板上篩選ScURA3敲除菌株，獲得的菌株命名為YZB041。以pZJ034敲除片段為模板，PCR擴增KmGPD1-T-ScURA3基因。將KmGPD1-T-ScURA3基因片段轉化入YZB041中，同源重組后，使菌株YZB041內(nèi)的KmGPD1被敲除，同時使菌株恢復URA3基因的功能。在合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，瓊脂15g/L)上篩選陽性克隆，命名為YZB044。以pMD18T-ScURA3敲除片段為模板，PCR擴增ScURA3敲除片段。將ScURA3敲除片段轉化入YZB044中，同源重組后，使菌株YZJ109內(nèi)的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，瓊脂15g/L)和5’-FOA的平板上篩選ScURA3敲除菌株，獲得的菌株命名為YZB046。用SmaI酶切pZJ043載體(Zhangetal.,2015b以及CN104164375)。將酶切產(chǎn)物轉化至YZJ046，使菌株獲得Ura3基因，恢復Uracil的合成的能力，同時獲得重組表達的KmGLN1基因。在合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，瓊脂15g/l)上篩選陽性克隆，獲得的菌株命名為YZB047。以pMD18T-ScURA3敲除片段為模板，PCR擴增ScURA3敲除片段。將ScURA3敲除片段轉化入YZB047中，同源重組后，使菌株YZB047內(nèi)的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，瓊脂15g/L)和5’-FOA的平板上篩選ScURA3敲除菌株，獲得的菌株命名為YZB048。用SmaI酶切pZJ026載體。將酶切產(chǎn)物轉化至YZB048，使菌株獲得Ura3基因，恢復Uracil的合成的能力，同時獲得重組表達的KmTAL1和KmTKL1基因。在合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，瓊脂15g/l)上篩選陽性克隆，獲得的菌株分別命名為YZB049。以pMD18T-ScURA3敲除片段為模板，PCR擴增ScURA3敲除片段。將ScURA3敲除片段轉化入YZB049中，同源重組后，使菌株YZB049內(nèi)的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，瓊脂15g/L)和5’-FOA的平板上篩選ScURA3敲除菌株，獲得的菌株命名為YZB050。用SmaI酶切pZB022載體。將酶切產(chǎn)物轉化至YZB050，使菌株獲得Ura3基因，恢復Uracil的合成的能力，同時獲得重組表達的KmRPE1和KmRKI1基因。在合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，瓊脂15g/l)上篩選陽性克隆，獲得的菌株命名為YZB051。以pMD18T-ScURA3敲除片段為模板，PCR擴增ScURA3敲除片段。將ScURA3敲除片段轉化入YZB051中，同源重組后，使菌株YZB051內(nèi)的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，瓊脂15g/L)和5’-FOA的平板上篩選ScURA3敲除菌株，獲得的菌株命名為YZB052。用SmaI酶切pZJ036載體。將酶切產(chǎn)物轉化至YZB052，使菌株獲得Ura3基因，恢復Uracil的合成的能力，同時獲得重組表達的PsXYL2-ARS基因。在合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，瓊脂15g/l)上篩選陽性克隆，獲得的菌株分別命名為YZB053。以pMD18T-ScURA3敲除片段為模板，PCR擴增ScURA3敲除片段。將ScURA3敲除片段轉化入YZB053中，同源重組后，使菌株YZB051內(nèi)的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，瓊脂15g/L)和5’-FOA的平板上篩選ScURA3敲除菌株，獲得的菌株命名為YZB054。用SmaI酶切pZJ061載體。將酶切產(chǎn)物轉化至YZB054，使菌株獲得Ura3基因，恢復Uracil的合成的能力，同時獲得重組表達的ScGAL2-N376F基因。在合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，瓊脂15g/l)上篩選陽性克隆，獲得的菌株命名為YZB056。以pMD18T-ScURA3敲除片段為模板，PCR擴增ScURA3敲除片段。將ScURA3敲除片段轉化入YZB056中，同源重組后，使菌株YZB056內(nèi)的URA3基因被敲除，失去尿嘧啶的合成的能力。在含有尿嘧啶的合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/L，酵母基本氮源6.7g/L，尿嘧啶2mg/ml，瓊脂15g/L)和5’-FOA的平板上篩選ScURA3敲除菌株，獲得的菌株命名為YZB057。用SmaI酶切pZJ061載體。將酶切產(chǎn)物轉化至YZB057，使菌株獲得Ura3基因，恢復Uracil的合成的能力，同時獲得進一步重組表達的ScGAL2-N376F基因。在合成培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20g/l，酵母基本氮源6.7g/l，瓊脂15g/l)上篩選陽性克隆，獲得的菌株命名為YZB058。3)提取基因組，通過PCR鑒定酵母轉化的陽性菌株。鑒定酵母轉化的陽性菌株的PCR體系：對應PCR程序：實施例2、構建的工程菌株發(fā)酵情況該實施例用于測試工程菌株利用木糖和葡萄糖共發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的效果。結果表明通過工程改造馬克思克魯維酵母，得到的工程菌株可以在高溫下(42℃)共發(fā)酵葡萄糖和木糖產(chǎn)生丙酮酸。另外，由于KmGPD1的敲除使發(fā)酵過程幾乎不產(chǎn)生副產(chǎn)物甘油。1.在YPD培養(yǎng)基平板上復蘇菌株YZB058，37℃培養(yǎng)1天。2.挑取單克隆，接于5ml液體YPD培養(yǎng)基。37℃，250rpm，過夜。3.配制30ml木糖葡萄糖培養(yǎng)基于250ml錐形瓶中。配方：20g/l木糖，40g/l葡萄糖糖，10g/l酵母提取物，20g/L細菌學蛋白胨。滅菌待用。4.取適量過夜培養(yǎng)物接入30ml木糖葡萄糖培養(yǎng)基中，使他們的初始OD600達到1.0,42℃,250rpm培養(yǎng)。6.在0h，12h，20h，24h，28h，36h，48h取樣，并取上清通過HPLC檢測分析(圖3)。7.從圖3可知，在葡萄糖和木糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，結果表明工程菌株幾乎可以將葡萄糖和木糖共利用完全，并且生產(chǎn)丙酮酸。另外，KmGPD1的敲除使副產(chǎn)物甘油幾乎全部消失。最終，本發(fā)明中的YZB058菌株，在42℃條件下，能在36h內(nèi)同時共利用40.97g/l葡萄糖和20.37g/l木糖生產(chǎn)29.21g/l丙酮酸，其生產(chǎn)速率為0.81g/l/h，得率為0.48g/g。參考文獻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