本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及基于馬尾松轉(zhuǎn)錄組測序序列而開發(fā)的SSR引物及其應(yīng)用?；谵D(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的多對SSR標(biāo)記引物，專用于從DNA水平對馬尾松種質(zhì)進(jìn)行快速鑒定及親緣關(guān)系分析。

背景技術(shù)：

馬尾松(Pinus massoniana)是我國南方最主要的優(yōu)質(zhì)針葉用材樹種之一，在我國森林資源發(fā)展、林紙一體化、松香林產(chǎn)化工業(yè)及森林生態(tài)服務(wù)功能中具有重要地位，其中，馬尾松優(yōu)良種質(zhì)的發(fā)掘和保護(hù)對產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要。因此，馬尾松種質(zhì)的準(zhǔn)確、高效鑒定和親緣關(guān)系分析，對種質(zhì)的知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)、開發(fā)和利用具有重要現(xiàn)實意義。目前，已有馬尾松遺傳多樣性、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面的相關(guān)報道，但由于馬尾松基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的缺乏，造成馬尾松生長發(fā)育規(guī)律解析、分子標(biāo)記開發(fā)和遺傳圖譜構(gòu)建等相對滯后。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，，主要有RAPD、AFLP、ISSR、SRAP等分子標(biāo)記技術(shù)已被用于馬尾松種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系分析和遺傳圖譜構(gòu)建，但這些多為顯性標(biāo)記，不能區(qū)分純合體和雜合體，且這些分子標(biāo)記覆蓋馬尾松基因組的比例較小，標(biāo)記密度較低。

簡單重復(fù)序列(SSR)廣泛分布于各類真核生物基因組的不同位置，由于重復(fù)次數(shù)和重復(fù)程度不同，使其呈現(xiàn)高度的多態(tài)性。與其它分子標(biāo)記技術(shù)相比，SSR標(biāo)記具有多態(tài)信息含量高、共顯性遺傳、技術(shù)簡單、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)等特點，被認(rèn)為是可靠性最高的分子標(biāo)記類型之一。SSR標(biāo)記可分為基因組SSR(gSSR)和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR(EST-SSR)，基因組SSR標(biāo)記的開發(fā)操作繁瑣，費時費力，費用高，這是限制SSR標(biāo)記應(yīng)用的一大瓶頸。與基因組SSR標(biāo)記相比，表達(dá)序列標(biāo)簽來源于基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)，可直接反映基因的表達(dá)信息，且標(biāo)記在種間的通用性更高。

隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展和測序成本的降低，利用新一代高通量測序技術(shù)對植物全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行測序，產(chǎn)生豐富的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其中包含了大量的EST序列。利用轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)SSR標(biāo)記既有EST-SSR標(biāo)記的優(yōu)點，同時其海量的數(shù)據(jù)為SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了比EST-SSR更全面的信息，提高了遺傳多樣性和分子標(biāo)記輔助育種研究的準(zhǔn)確性。因此，本發(fā)明利用高通量測序技術(shù)成功獲得馬尾松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析，最終找到了適用于馬尾松SSR標(biāo)記分析的引物，這將會對馬尾松重要性狀基因的定位、分子標(biāo)記輔助選擇育種和比較基因組學(xué)研究等起重要推動作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：為了克服現(xiàn)有分子標(biāo)記覆蓋馬尾松基因組比例低、操作復(fù)雜等缺點，本發(fā)明旨在提供多態(tài)性檢出率高、分辨率更好、穩(wěn)定可靠、簡單高效的分子標(biāo)記鑒定方法。該方法可直接用于馬尾松的種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系分析和遺傳圖譜的構(gòu)建，為種質(zhì)知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)和遺傳改良提供更好的評估工具。本發(fā)明需要解決的關(guān)鍵技術(shù)是馬尾松SSR標(biāo)記引物的獲得，以及聚丙烯酰胺變性凝膠的優(yōu)化。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種利用轉(zhuǎn)錄組測序的SSR分子標(biāo)記鑒定馬尾松種質(zhì)的方法，包含以下步驟：

(1)DNA提取采用天根DNAsecure Plant Kit試劑盒優(yōu)化步驟，然后按如下的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序用引物對馬尾松樣本進(jìn)行擴(kuò)增；

(2)基于馬尾松轉(zhuǎn)錄組測序的序列設(shè)計SSR引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化；

(3)最后對PCR產(chǎn)物，采用優(yōu)化的10％聚丙烯酰胺變性凝膠電泳，通過銀染法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，根據(jù)譜帶的有無和大小來判定結(jié)果。

所述的SSR標(biāo)記引物為如下的1對或任意幾對：

所述的PCR反應(yīng)體系采用10-20μl反應(yīng)體系：分別包含10-50ng的模板DNA 1-2μl，正、反向引物各0.3-0.6μl，5-10μl Mix及適量ddH₂O。其中Mix含0.1U/μl Taq polymerase、500μM dNTP、20mM Tris-HCl、100mM KCl、3mM MgCl₂，以及其它穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑。

所述的PCR的反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性4min；對94℃反應(yīng)30s，60-63℃反應(yīng)45s，72℃反應(yīng)45s進(jìn)行40個循環(huán)；72℃延伸7min；4℃最終保存。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明方法適用于馬尾松種質(zhì)快速可靠的分子檢測和鑒定，具有重要的實用價值，與其它方法相比，本發(fā)明具有以下的技術(shù)優(yōu)勢：

1、操作簡便快速：本發(fā)明對樣本進(jìn)行簡單處理、PCR擴(kuò)增和常規(guī)的聚丙烯酰胺變性凝膠電泳后即可判斷結(jié)果，無需對擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，整個檢測過程可在5個小時內(nèi)完成；

2、對聚丙烯酰胺變性凝膠的制作已進(jìn)行優(yōu)化，并形成一套完整的體系，效果較好：制作過程簡單，耗時較短，且能將差異較小的片段(3bp左右)較好的區(qū)分開，進(jìn)一步提高了SSR標(biāo)記在種質(zhì)鑒定和知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)上的應(yīng)用效率；

3、檢測結(jié)果靈敏度高：對待檢樣品僅需提供模板10-50ng，即可準(zhǔn)確鑒定其所屬種質(zhì)；

4、結(jié)果高度準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好：本發(fā)明已經(jīng)對不同種質(zhì)的馬尾松DNA樣本進(jìn)行了檢測，經(jīng)過多次重復(fù)檢測，檢測準(zhǔn)確率100％，為檢測結(jié)果提供了高度的可靠性；

5、本發(fā)明的SSR引物開發(fā)基于馬尾松轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，引物具有高特異性、專一性：在馬尾松SSR分子標(biāo)記研究領(lǐng)域，前人多采用從其他松屬類植物中篩選的引物，或依靠生物信息學(xué)手段從松屬EST數(shù)據(jù)庫中開發(fā)的SSR引物，但效果都不太理想；

6、本發(fā)明中開發(fā)的SSR引物獲得的分子標(biāo)記，在馬尾松基因組中分布均勻、多態(tài)性豐富、清晰穩(wěn)定、分辨率高，可有效用于馬尾松的種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系分析及遺傳圖譜構(gòu)建等工作，在知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)和遺傳育種上具有重要實際意義；

7、取材方便、經(jīng)濟(jì)效益明顯：針葉、球花等組織或器官均可為實驗材料，苗期、幼林期、成年大樹均可取樣，不受季節(jié)、地點的限制。通過對馬尾松苗木純度的SSR分子鑒定，可避免苗木生產(chǎn)與銷售過程中出現(xiàn)的魚龍混雜現(xiàn)象。

附圖說明

圖1為SSR引物擴(kuò)增后1％瓊脂糖凝膠電泳初篩檢測圖；1～4分別表示福建漳平G22家系、H90家系、70-80-5家系；5、6分別表示廣西南寧29-1家系、1-2-1家系；M為DNA Marker；

圖2為SSR引物擴(kuò)增后10％聚丙烯酰胺變性凝膠電泳復(fù)篩檢測圖；1～6分別表示都勻林場的黃平49家系、黃平50家系、黃平38家系、福泉4家系、黃平34家系、福泉3家系；M為DNA Marker；

圖3為引物對PmS54對來自貴州、福建及廣西共72份馬尾松種質(zhì)的10％PAGE變性凝膠電泳檢測圖；1～24對應(yīng)表2中貴州都勻林場各家系；25～48對應(yīng)表2中福建漳平林場各家系；49～72對應(yīng)表2中廣西南寧林場各家系；M為DNA Marker。

具體實施方式

實施例1：以本發(fā)明中的SSR引物，鑒定貴州、福建、廣西三地共72份馬尾松種質(zhì)，其中以引物對PmS54為例，可區(qū)分供試材料。

1.SSR引物的設(shè)計及合成

首先對測序得到的序列進(jìn)行前處理，得到高質(zhì)量無冗余的EST序列，利用MISA軟件在轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中搜索SSR位點，搜索標(biāo)準(zhǔn)為：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最少重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5和5，接著用Primer3.0引物批量設(shè)計程序?qū)蠸SR位點的Unigene序列設(shè)計引物，并且SSR位點序列長度在18～27bp之間。其中，引物設(shè)計的主要參數(shù)為：退火溫度(T_m)在57～63℃之間，60℃最佳；PCR產(chǎn)物大小為100～300bp；GC含量在40％～60％之間，50％最佳。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。設(shè)計合成的PmS54正、反向引物相關(guān)信息如表1所示。

表1引物PmS54相關(guān)信息

2.基因組DNA的提取及檢測

采用貴州、福建、廣西三地共72份馬尾松種質(zhì)為供試材料，見表2所示。

采用天根DNAsecure Plant Kit(DP320)試劑盒并作適當(dāng)修改，提取基因組DNA，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，核酸濃度測定儀檢測DNA濃度，將濃度稀釋至10～50ng/μL左右，-20℃保存。

表2貴州、福建、廣西三地共72份馬尾松種質(zhì)

3.PCR擴(kuò)增

優(yōu)化反應(yīng)體系為(10-20μl)：10～50ng的模板DNA，各0.3-0.6μl正、反向引物(10μM)，5-10μl Mix及適量ddH₂O。其中Mix含0.1U/μl Taq polymerase，500μMdNTP，20mMTris-HCl(pH8.3)，100mMKCl，3mM MgCl₂，以及其它穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑。

優(yōu)化的PCR程序為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，復(fù)性45s，72℃延伸45s，40個循環(huán)；最后72℃延伸7min，4℃保存。

4.SSR引物初篩

將PCR反應(yīng)產(chǎn)物在含有GoldViewⅠ的1％瓊脂糖凝膠中，以5V/cm的電壓電泳適當(dāng)時間，然后于凝膠分析儀中觀察并拍照保存，篩選出條帶清晰的引物，如圖1所示。

5.SSR引物多態(tài)性位點復(fù)篩

初篩引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，在10％聚丙烯酰胺變性凝膠中，以80V電壓預(yù)電泳10min左右，然后以150V電壓正式電泳2～3h，最后顯影、染色、拍照，篩選出條帶清晰、具有多態(tài)性差異的引物，如圖2所示。已優(yōu)化的10％聚丙烯酰胺變性凝膠電泳的操作過程如下：

1)安裝夾心式垂直電泳板

(1)將玻璃板拿到流動水處洗刷干凈、晾干，用乙醇或剝離硅烷均勻擦洗玻璃板；

(2)將清洗干凈的兩塊長、短玻璃板晾干后，按要求分別插入到U型硅橡膠框的凹形槽中；

(3)將裝好的玻璃電泳板傾斜成45-60℃角，放在灌膠支架上固定好；

(4)用滴管吸取少量的1％瓊脂糖溶液，灌入凝膠長玻璃板外側(cè)底部，灌膠液面高度約0.5-1.0cm(封膠面應(yīng)整齊)，待瓊脂糖凝固；

2)制備凝膠板

(1)按表3各組分的用量，從上到下依次加入小燒杯中，混勻；加完尿素后，用雙蒸水補(bǔ)足至50ml后進(jìn)行過濾，過濾結(jié)束后同時加入10％APS(過硫酸銨)和TEMED(四甲基二乙胺)，混勻稍微靜止等泡沫散去；

表3 10％聚丙烯酰胺變性凝膠組成成分及添加成分的順序

(2)將混勻的凝膠沿玻璃板凹口快速均勻倒下，至短玻璃板邊緣，插入適當(dāng)?shù)氖嶙臃鈼l；

(3)室溫聚合1-2小時后，小心取出梳子封條，用注射器加ddH₂O多次沖洗加樣孔；

(4)將凝膠板用力均勻地固定在垂直電泳槽里，帶凹口背板朝里，面向緩沖液槽；

(5)用1×TBE電解液灌滿電泳槽的緩沖液槽，接上電極，打開電源，調(diào)試工作環(huán)境為電壓80V，預(yù)電泳10min左右；

(6)預(yù)電泳期間，向PCR產(chǎn)物中加入2.5μl loading buffer(上樣緩沖液)，混勻，PCR儀97℃變性10min，4℃保存；

(7)正式電泳點樣前，用注射器加1×TBE電解液再次沖洗加樣孔，邊沖洗邊點樣，PCR產(chǎn)物上樣量為2μl左右，然后打開電源，調(diào)試工作環(huán)境為電壓150V，電泳2.5小時左右；

(8)電泳至所需位置后，切斷電源，拔出導(dǎo)線，回收緩沖液，卸下玻璃板。在工作臺上，將背板撬起，然后將膠板放入有ddH₂O的托盤中沖洗一或兩次，銀染檢測；

3)銀染檢測

(1)固定(10％冰乙酸)：50ml冰乙酸加ddH₂O定容至500ml，混勻，倒入托盤中，搖床輕搖25min左右，約至二甲苯靑褪去，ddH₂O漂洗兩次(速度快，約5s)；

(2)染色(0.1％AgNO₃)：稱取0.5g AgNO₃用ddH₂O定容至500ml，染色時現(xiàn)加入3ml 37％的甲醛，混勻，倒入托盤中于搖床上避光震蕩約25min，然后ddH₂O漂洗2次，時間不超過5s；

(3)顯色：稱取7.5g NaOH，ddH₂O定容至500ml，染色時加入2ml 37％甲醛，混勻，將顯色液倒入托盤中于搖床上震蕩至滿意為止(可分兩次加入，第一次加入少許，洗掉黑色銀液倒掉，再加入剩余顯色液，輕搖至條帶滿意為止)；

(4)ddH₂O漂洗1～2次，盡量不超過5s，立即數(shù)碼相機(jī)拍照記錄。

6.供試材料的SSR分析

用復(fù)篩出的多態(tài)性較好的SSR引物(如PmS54)，對供試材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增及變性PAGE凝膠電泳、銀染，結(jié)果如圖3。凝膠制備和染色方法見步驟5。

7.數(shù)據(jù)處理及分析

每種SSR引物重復(fù)擴(kuò)增3次，絕大部分帶型可重復(fù)，極少數(shù)不能重復(fù)的譜帶統(tǒng)計時忽略不計。采用人工讀帶的方式，對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，將譜帶按“引物號-片段長度”進(jìn)行記錄，并按有無分別賦值1和0，建立數(shù)據(jù)庫。

指紋圖譜構(gòu)建

不同引物產(chǎn)生的譜帶數(shù)及多態(tài)性存在差異，根據(jù)用最少的引物組合鑒別盡量多種質(zhì)的原則，建立馬尾松遺傳圖譜，且所有供試材料的特異性各不相同，達(dá)到種質(zhì)鑒定的目的。