本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及懸浮胡蘿卜細胞基因組中β(1,2)木糖轉(zhuǎn)移酶的基因全序列及其相應(yīng)的用于轉(zhuǎn)染雙子葉植物的CRISPR/CAS9的質(zhì)粒構(gòu)建。
背景技術(shù)：
：利用植物表達異源蛋白質(zhì)是近三十年前才開始的技術(shù)。在1986年，第一個具有藥理活性的蛋白，人類生長激素，被成功地通過轉(zhuǎn)基因煙草表達出來。自那以后，各種各樣的與人相關(guān)的蛋白通過不同種的植物被表達出來。從1989年第一個植物表達抗體的誕生到1992年第一個植物疫苗的出現(xiàn)，基因改造植物在生物學(xué)領(lǐng)域的地位逐步增高。目前市面上較為成熟的蛋白表達體系有細菌表達、酵母、哺乳動物細胞以及轉(zhuǎn)基因動物等。轉(zhuǎn)基因植物與上述表達體系相比，不僅有著產(chǎn)物質(zhì)量較高，污染風(fēng)險低，儲藏成本小等優(yōu)點，而且在產(chǎn)能擴大方面遠遠優(yōu)于上述其他體系。較低的場地、設(shè)備費用使其產(chǎn)物有著較高的價格優(yōu)勢。然而蛋白產(chǎn)量與質(zhì)量的多變性、難以適應(yīng)GMP規(guī)則、農(nóng)藥與肥料對植物的影響、害蟲與疾病甚至當(dāng)?shù)氐耐寥琅c氣候等因素限制了大規(guī)模生產(chǎn)的應(yīng)用。在這方面，植物細胞培養(yǎng)既保留了上述生產(chǎn)方法的優(yōu)點，又避免了實地種植所帶來的不便。植物細胞懸浮培養(yǎng)優(yōu)點繁多，操作簡便，被廣泛的用于多方面的研究中。通過組培得到的細胞形態(tài)單一，材料方便易得，培養(yǎng)成本低廉，單一培養(yǎng)系統(tǒng)中較高的容納量以及較好的重現(xiàn)性使得植物組織培養(yǎng)成為生物藥生產(chǎn)的重要手段。然而其缺點也不容忽視。脫分化細胞因為其較硬的細胞壁和較大的尺寸而對剪切力十分敏感，這限制了大規(guī)模培養(yǎng)時的操作條件；另一方面，植物細胞懸浮培養(yǎng)需要添加植物生長因子，這些因子可能會使懸浮細胞發(fā)生體細胞克隆變異，從而改變被培養(yǎng)細胞的基因型。在這其中，胡蘿卜(DaucuscarotaL.)由于有著相對容易的愈傷組織發(fā)生和較高的再生潛力而成為了這個領(lǐng)域中的模式植物。胡蘿卜隸屬傘形科，其主根富含維生素A，為人類攝取維生素A的主要來源。在生物制藥領(lǐng)域，胡蘿卜也是用途廣泛。它為兩年生植物，因此可以在其尚未結(jié)出種子的時候收獲，這大大的提高了基因工程植物的生物安全性。除此之外，由于胡蘿卜的主根本身可食用，因此源于植物中的有效成分可直接通過食用主根進行口服吸收，減少了其中的后續(xù)加工步驟。胡蘿卜在植物分子農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中有著重要的地位，它也是第一個獲得批準(zhǔn)用于生產(chǎn)生物藥的植物種類。到目前為止有眾多形式的生物藥物通過胡蘿卜生產(chǎn)出來，其中包括抗體、疫苗、細胞因子和酶等。起源于上世紀(jì)80年代的分子農(nóng)業(yè)在2012年終于完成了第一個由植物生產(chǎn)的人用藥物的上市，這個用于治療高歇氏病的葡糖腦苷脂酶便是由胡蘿卜生產(chǎn)得到。此次成功預(yù)示著胡蘿卜在生物藥制備中的巨大前景。利用懸浮胡蘿卜細胞生產(chǎn)人源重組蛋白有著成本低，安全性高，可規(guī)模化等諸多優(yōu)勢。然而，哺乳動物細胞與植物細胞所分泌生產(chǎn)出的蛋白糖基化修飾結(jié)構(gòu)不同。與其他真核細胞相同，植物細胞中新生蛋白N-糖基化起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)前體寡糖的共價連接，由寡糖轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化完成。如果新生蛋白通過分泌途徑轉(zhuǎn)運，則前體寡糖需要經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中的一系列酶的修飾才能得到成熟的蛋白。其中高爾基體中的糖蛋白修飾正是人與植物糖蛋白差異的根源，其區(qū)別如下：在哺乳動物細胞中，寡糖鏈主鏈有α(1,6)-果糖存在，且糖鏈末端為與β(1,4)-半乳糖連接的唾液酸；而在植物細胞中，寡糖鏈主鏈有α(1,3)-海藻糖存在，在糖鏈分枝處有β(1,2)-木糖連接。由此可知，如果直接將一段蛋白的基因?qū)氲街参锛毎校磉_的蛋白會因為糖基化修飾的不同而有別于原始蛋白。糖基化的差異不僅可能導(dǎo)致在植物中表達的動物蛋白功能喪失或改變，而且可能會引發(fā)人體的免疫反應(yīng)：核心鏈段的β(1,2)-木糖和α(1,3)-海藻糖是IgE結(jié)合植物致敏原的重要的碳水化合物決定位點。實際上，有研究顯示用植物的糖蛋白作為抗原觸發(fā)山羊或兔子的免疫反應(yīng)時，產(chǎn)生的抗體特異性識別核心鏈段的β(1,2)-木糖和α(1,3)-海藻糖。這也凸顯了通過植物生產(chǎn)藥物的潛在問題：植物生產(chǎn)的生物藥物是否會觸發(fā)人類的免疫反應(yīng)。為了解決上述問題，可以將植物產(chǎn)生的重組蛋白人源化，利用CRISPR/CAS9系統(tǒng)敲除植物基因組中的α(1,3)-海藻糖轉(zhuǎn)移酶和β(1,2)-木糖轉(zhuǎn)移酶基因，從而減小了動物細胞和植物細胞生產(chǎn)出的蛋白的糖基化的區(qū)別。CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)是近幾年新興起的一種基因編輯技術(shù)，利用此技術(shù)可以敲除細胞基因組中的某個特定的基因，其作用原理如下：CRISPR包含兩個組件：一個向?qū)NA分子(gRNA)和一個非特異性CRISPR相關(guān)蛋白-9(Cas9)。gRNA由兩部分序列構(gòu)成，一部分為Cas9結(jié)合序列，另一部分為使用者自定的靶向目標(biāo)基因的序列(約20bp)。由此可見若想改變靶點，只需將gRNA稍作調(diào)整即可。CRISPR在最初只用來敲除不同細胞或組織中的特定基因，隨著Cas9酶的不斷改造，這個方法的用途也被逐漸拓寬，如選擇性的激活或沉默某個基因，純化某個DNA的特定部分，甚至可以用來進行活細胞的DNA熒光成像。相對簡便的實驗操作也使得它成為最具擴展性的基因組編輯技術(shù)，并在近期被用來實施基因組層面的篩選。CRISPR/Cas9技術(shù)可通過細胞內(nèi)共表達gRNA和Cas9核酸內(nèi)切酶并對特定基因進行剪切的方式生產(chǎn)基因敲除的細胞或者動物，被切割的靶點(約20bp)需滿足下述兩個條件：1.該靶點不會在基因組其他區(qū)域出現(xiàn)；2.靶點位置需與前間區(qū)序列鄰近基序(protospaceradjacentmotif，PAM)相鄰并處于上游；PAM序列是Cas9酶行使功能所必需的，不同的Cas9其對應(yīng)的PAM序列也不同。一旦Cas9蛋白和gRNA被表達出來，兩者通過gRNA中的Cas9結(jié)合序列以及Cas9蛋白中被暴露在表面的正電荷溝結(jié)合，形成核酸-蛋白復(fù)合物，此時Cas9經(jīng)歷構(gòu)象變化，從原先的未激活狀態(tài)變?yōu)橛蠨NA結(jié)合活性的狀態(tài)。核酸-蛋白復(fù)合物會結(jié)合在任意一個有PAM序列的DNA鏈段中，但是gRNA中的靶向序列是否與靶點結(jié)合決定了Cas9是否行使酶切功能。當(dāng)這個復(fù)合物結(jié)合靶點序列時，處于gRNA靶向序列部分的3’端“種子”序列開始與靶點序列配對。如果能夠成功配對，則剩下的gRNA靶向序列部分沿著3’到5’的方向開始配對。只有當(dāng)正確配對率足夠高的時候，Cas9才會對靶點基因進行切割。Cas9切割與gRNA結(jié)合的DNA單鏈后進行構(gòu)象變化，再對另一條DNA單鏈進行切割，因此最終靶點DNA呈雙鏈斷裂狀態(tài)(斷裂位點通常在PAM序列上游3-4個bp)。被切斷的DNA通過兩種方法進行修復(fù)：高效但出錯率高的非同源末端連接(NHEJ)以及低效但高保真的同源性修復(fù)(HDR)。NHEJ修復(fù)通路是最活躍的修復(fù)途徑，能夠在短時間內(nèi)修復(fù)雙鏈斷裂的DNA，但經(jīng)常會導(dǎo)致斷裂位點插入或缺失核苷酸。正是因為其出錯率高，表達Cas9和gRNA的細胞會產(chǎn)生一系列的突變，產(chǎn)生不同的性狀。在大多數(shù)情況中，NHEJ造成的核苷酸片段插入或缺失會使轉(zhuǎn)錄出來的mRNA在翻譯時出現(xiàn)氨基酸的插入、缺失或移碼突變，其中移碼突變可能會造成mRNA可讀框內(nèi)出現(xiàn)終止密碼子而使翻譯提前結(jié)束。這些突變最終會造成靶點基因功能的缺失，從而達到基因敲除的目的。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種分離的胡蘿卜XylT基因及其應(yīng)用。為了實現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明的第一方面，提供一種分離和測定胡蘿卜XylT基因的序列的方法，包括：(1)提取胡蘿卜基因組DNA；(2)利用巢式PCR技術(shù)獲得XylT基因片段，純化，獲得純化后的XylT基因片段；(3)將獲得的純化后的XylT基因片段進行測序，獲得分離的胡蘿卜XylT基因的序列。優(yōu)選地，步驟(2)包括：設(shè)計外側(cè)一對引物和內(nèi)側(cè)一對引物，以步驟(1)中提取的胡蘿卜基因組DNA為模板，使用外側(cè)一對引物進行第一次PCR反應(yīng)，獲得第一次PCR產(chǎn)物；再以第一次PCR產(chǎn)物作為模板，使用內(nèi)側(cè)一對引物進行第二次PCR反應(yīng)；所述外側(cè)一對引物包括如SEQIDNO.1所示的正向引物和SEQIDNO.2所示的反向引物；所述內(nèi)側(cè)一對引物包括如SEQIDNO.3所示的正向引物和SEQIDNO.4所示的反向引物。優(yōu)選地，步驟(3)包括：采用如SEQIDNO.9所示的W3F與如SEQIDNO.12所示的W4R作為PCR反應(yīng)的引物，以步驟(2)中獲得的純化后的XylT基因片段為模板進行PCR反應(yīng)，獲得未知序列PCR產(chǎn)物；然后采用酶切連接的方法將其插入質(zhì)粒中，獲得單克隆后對插入片段進行測序。進一步優(yōu)選地，采用如SEQIDNO.9所示的W3F與如SEQIDNO.12所示的W4R作為測序時所采用的引物。本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的胡蘿卜XylT基因，其核苷酸序列中含有兩段STR位點。所述胡蘿卜XylT基因，亦即胡蘿卜β(1,2)木糖轉(zhuǎn)移酶基因。優(yōu)選地，第一STR位點的核苷酸序列如SEQIDNO.25所示，具體為：TATATATATATATATATATATATATATATA；第二STR位點的核苷酸序列如SEQIDNO.26所示，具體為：TATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA。優(yōu)選地，所述分離的胡蘿卜XylT基因的全長核苷酸序列如SEQIDNO.13所示。本發(fā)明的第三方面，提供一種分離的核酸分子，包含：單鏈RNA，所述單鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與XylT基因雜交的核苷酸序列。優(yōu)選地，所述XylT基因來源于胡蘿卜。更進一步優(yōu)選地，所述XylT基因的全長核苷酸序列如SEQIDNO.13所示。優(yōu)選地，所述單鏈RNA的序列與XylT基因中的靶序列基本相同。優(yōu)選地，所述XylT基因中的靶序列包括：如SEQIDNO.14所示的第一靶序列和如SEQIDNO.15所示的第二靶序列。進一步地，所述單鏈RNA為gRNA(向?qū)NA)。所述單鏈RNA包括：如SEQIDNO.27所示的第一gRNA和如SEQIDNO.28所示的第二gRNA。將所述gRNA和CAS9在細胞內(nèi)表達后，CAS9和sgRNA組成RNA-protein復(fù)合體(RNP)。其中所述gRNA通過RNA-DNA堿基互補配對原則，將此RNP定位到XylT基因的特定位置，這時，CAS9將發(fā)揮其核酸內(nèi)切酶的特性，在堿基互補配對的位置上對XylT基因進行切割，形成DNA雙鏈斷裂。進而，特異性敲除細胞內(nèi)源性XylT基因表達。本發(fā)明的第四方面，提供了一種XylT基因干擾核酸構(gòu)建體，含有編碼前述分離的核酸分子的基因片段，能表達如SEQIDNO.27所示的第一gRNA和如SEQIDNO.28所示的第二gRNA。所述的XylT基因干擾核酸構(gòu)建體，可以是將能表達如SEQIDNO.27所示的第一gRNA和如SEQIDNO.28所示的第二gRNA的基因片段克隆入已知載體獲得。進一步地，所述的XylT基因干擾核酸構(gòu)建體可以是質(zhì)粒載體。本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，所述的XylT基因干擾核酸構(gòu)建體是CRISR/Cas9質(zhì)粒。優(yōu)選地，所述的XylT基因干擾核酸構(gòu)建體的核苷酸序列如SEQIDNO.24所示。本發(fā)明的第五方面，提供一種敲除XylT基因的試劑盒，所述試劑盒包括：存在于容器中的前述分離的核酸分子和/或前述的XylT基因干擾核酸構(gòu)建體。本發(fā)明的第六方面，提供一種敲除XylT基因的方法，包括：將前述分離的核酸分子和/或前述的XylT基因干擾核酸構(gòu)建體施用于對象中。所述敲除XylT基因的方法可以是體內(nèi)的也可以是體外的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)和確定了胡蘿卜β(1,2)木糖轉(zhuǎn)移酶的基因全序列，并針對此序列設(shè)計了兩個有效的gRNA，合成相應(yīng)的CRISPR/CAS9質(zhì)粒，從而達到敲除懸浮胡蘿卜細胞基因組中β(1,2)木糖轉(zhuǎn)移酶的目的。本發(fā)明利用了巢式PCR的擴增技術(shù)和cloning技術(shù)，以提取的懸浮胡蘿卜細胞基因組為模板，對β(1,2)木糖轉(zhuǎn)移酶進行兩次擴增后，利用cloning技術(shù)，將擴增片段插入pET21a質(zhì)粒上后進行測序，發(fā)現(xiàn)β(1,2)木糖轉(zhuǎn)移酶的基因序列中存在兩段STR位點，這對于胡蘿卜種屬鑒定及其進化方面具有重大意義。附圖說明圖1：胡蘿卜細胞基因組DNA1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(1kbLadder)結(jié)果，其中左列代表Marker條帶，右列代表胡蘿卜細胞基因組DNA條帶。圖2a：實施例2中第一次PCR產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(1kbLadder)結(jié)果圖。圖2b：實施例2中兩次PCR反應(yīng)產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(1kbLadder)結(jié)果圖。圖2c：實施例2中純化后PCR產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(1kbLadder)結(jié)果圖。圖3a：實施例4中質(zhì)粒1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中，M為1kbMarker，1～12為所挑選的1～12號克隆提取的質(zhì)粒，pET-21a為原始質(zhì)粒，作為陰性對照。圖3b：實施例4中質(zhì)粒1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中M為1kbMarker，13～24為所挑選的13～24號克隆提取的質(zhì)粒，pET-21a為原始質(zhì)粒，作為陰性對照。圖3c：實施例4中質(zhì)粒1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中M為1kbMarker，25～47為所挑選的25～47號克隆提取的質(zhì)粒，pET-21a為原始質(zhì)粒，作為陰性對照。圖4：gRNA1和gRNA2PCR產(chǎn)物1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，Marker為5000bp的marker。圖5：g1和g2酶切鑒定2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，Marker為5000bp的marker，箭頭指示的為被切下來的片段。圖6a：g1質(zhì)粒1％瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，其中M為1kbMarker，1～6為所挑選的1～6號克隆提取的質(zhì)粒。圖6b：g2質(zhì)粒1％瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，其中M為1kbMarker，1～6為所挑選的1～6號克隆提取的質(zhì)粒。圖7：U6g2片段PCR產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其大小為590bp，Marker為5000bp的marker。圖8：g1g2串聯(lián)質(zhì)粒1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中，M為1kbMarker，g1g2大小為16.6kb。圖9：g1g2串聯(lián)質(zhì)粒酶切鑒定1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，其中，M為1kbMarker；紅色箭頭指示的為被切下來的片段。具體實施方式在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。當(dāng)實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。實施例1胡蘿卜基因組DNA的提取1.實驗方法此步驟使用天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒。具體操作步驟包括：取新鮮的胡蘿卜細胞團塊約100mg，加入液氮充分研磨。將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)先裝有700μL65℃預(yù)熱緩沖液GP1的離心管(實驗前，需要在預(yù)熱的GP1中加入巰基乙醇，現(xiàn)配現(xiàn)用，使其終濃度為0.1％)，迅速顛倒混勻后，將離心管放在65℃水浴20min，水浴過程中每過5min顛倒離心管數(shù)次以混合樣品。加入700μL氯仿，充分混勻，12,000rpm離心5min。將上一步所得的上層水相轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入700μL緩沖液GP2，充分混勻。將混勻的液體小心地轉(zhuǎn)移到吸附柱CB3中，12,000rpm離心30sec，棄去廢液。(吸附柱容積為700μL左右，可以分數(shù)次加入混勻的液體離心。)向吸附柱CB3的中心加入500μL緩沖液GD(GD需要加入無水乙醇，使用前檢查加入與否)，12,000rpm離30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。向吸附柱CB3中心加入600μl漂洗液PW(PW需要加入無水乙醇，使用前先檢查加入與否)，12,000rpm離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。重復(fù)操作上一步驟。將吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm離心2min，倒掉廢液。之后在室溫下將吸附柱CB3放置數(shù)分鐘，或者放入超凈臺中開啟最大風(fēng)速吹干，將吸附柱材料中殘余的所有漂洗液徹底去除。將吸附柱CB3轉(zhuǎn)移入一個干凈的新離心管中，向吸附膜的中間部位小心地懸空滴加50-200ul洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，然后12,000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中。注意：洗脫緩沖液的體積應(yīng)不少于50ul，體積過小將會影響回收效率。此外，洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響，因此若用ddH2O做洗脫液的話，應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，倘若pH值低于7.0就會降低洗脫效率；并且收集的DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防止DNA降解。為了增加基因組DNA的得率，可以將離心得到的溶液再次加入吸附柱CB3中，室溫放置2min后12,000rpm離心2min。2.實驗結(jié)果如圖1所示，采用1％脂糖凝膠電泳進行檢測，并用NanoDrop儀器檢測其OD260/OD280比值為2.06，說明所得胡蘿卜基因組DNA純度較高。實施例2利用巢式PCR技術(shù)獲得XylT片段1.實驗方法(1)PCR反應(yīng)：以實施例1中獲得的胡蘿卜基因組DNA為模板，利用基因同源性從胡蘿卜數(shù)據(jù)庫中獲得3段exon序列，根據(jù)此序列設(shè)計外側(cè)和內(nèi)側(cè)兩對引物，使用外側(cè)一對引物進行第一次PCR反應(yīng)。再以第一次PCR產(chǎn)物稀釋10倍后為模板，使用內(nèi)側(cè)一對引物進行第二次PCR反應(yīng)。PCR引物序列見表1，反應(yīng)各組分見表2。第一次PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為98℃1min，95℃0.5min，55℃0.5min，68℃10min，35個循環(huán)，68℃10min。第二次PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為98℃1min，95℃0.5min，55℃0.5min，68℃6min，35個循環(huán)，68℃10min。表1PCR反應(yīng)引物序列表2PCR反應(yīng)各組份ReagentsVolume2×KODFXBuffer25ul2mMdNTPs10ul10uMPrimerforward1.5ul10uMPrimerreverse1.5ulTemplateDNA(ng)5ngKODFX1ulddH2OTo50ul(2)PCR產(chǎn)物純化此步驟使用北京索萊寶科技有限公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，實驗操作步驟包括：(使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標(biāo)簽)1、瓊脂糖凝膠電泳后，將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下(盡量切除多余部分)，放入干凈的離心管中，稱取重量；2、向膠塊中加入3倍體積溶膠液(如果凝膠重為0.1g，其體積可視為100ul,則加入300ul溶膠液)，50-55℃水浴放置10min，期間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解；注意：溶膠時，如果溶膠液變?yōu)榧t色(正常情況下為淡黃色)，可向含有DNA的膠溶液中加入10-30ul3M醋酸鈉(pH5.2)將膠溶液調(diào)為淡黃色，否則將會影響DNA與吸附柱的結(jié)合，影響回收效率；3、將上一步所得溶液加入一個吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中；注意：膠塊完全溶解后最好將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因為吸附柱在較高溫度時結(jié)合DNA的能力較弱；4、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中；5、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中；6、12000rpm離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，防止漂洗液中的乙醇影響后續(xù)的實驗；7、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加適量經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置2min，12000rpm離心1min；8、DNA產(chǎn)物-20℃保存。2.實驗結(jié)果如圖2所示，本次PCR產(chǎn)物依然用1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。其中，圖2a為第一次PCR反應(yīng)產(chǎn)物，圖2b為兩次PCR反應(yīng)產(chǎn)物，圖2c為純化后PCR產(chǎn)物，純化后PCR產(chǎn)物大小約為5kb。其中所用DNAMarker均為1KbLadder。實施例3XylT純化后PCR產(chǎn)物測序1.實驗方法將實施例2純化后PCR產(chǎn)物送于上海華津生物科技有限公司進行測序。以外側(cè)兩對PCR引物作為第一對測序引物，同時向中間進行測序。再依據(jù)測序結(jié)果設(shè)計兩對引物繼續(xù)進行測序。測序引物序列見表3。表3測序引物序列測序引物名稱引物序列(5’-3’)序號W1FGCTTATTTTGGTAATGGCTTTACTCGACSEQIDNO.5W1RCAAGAATATAGGATGGTACTCTAATCSEQIDNO.6W2FAATCCTTTTCTGGAGTTGAGSEQIDNO.7W2RGGCTGTTGCCACAGATCATGSEQIDNO.8W3FCGTATTACTATGAGGCGAGGSEQIDNO.9W3RATGCAGCATACCAATCTGTAACTGSEQIDNO.10W4FGATTTCTTGATGGCATGGTCAAGSEQIDNO.11W4RTCCATCTCCACCACTTCCACCSEQIDNO.122.實驗結(jié)果測序結(jié)果顯示，當(dāng)用W4F與W4R引物進行測序時，測序圖譜結(jié)果顯示各堿基峰混亂，無法得到完整的序列。此步的其他對引物測序結(jié)果將與實施例4的結(jié)果一起展示。實施例4利用Cloning技術(shù)獲得未知序列中的2段STR位點1.實驗方法用W3F與W4R作為PCR反應(yīng)的引物，以實施例2中獲得的XylT純化后PCR產(chǎn)物作為模板進行PCR反應(yīng)。獲得未知序列PCR產(chǎn)物后，采用酶切連接的方法將其插入pET21a質(zhì)粒中，獲得單克隆后對插入片段進行測序。具體操作步驟如下：(1)PCR反應(yīng)及其產(chǎn)物純化PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為98℃1min，95℃0.5min，55℃0.5min，68℃2min，30個循環(huán)，68℃2min。PCR反應(yīng)體系見表4。獲得PCR片段產(chǎn)物后使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對其進行純化，詳細步驟見實施例2。表4未知序列PCR反應(yīng)體系ReagentsVolume2×KODFXBuffer25ul2mMdNTPs10ul10uMPrimerW3F1.5ul10uMPrimerW4R1.5ulTemplateDNA(ng)5ngKODFX1ulddH2OTo50ul(2)酶切連接反應(yīng)pET21a質(zhì)粒含有一個PmeI酶切位點，需用PmeI酶對其進行消化，消化反應(yīng)體系見表5，消化反應(yīng)條件為37℃，4h。質(zhì)粒消化完全后，加入上一步所得PCR純化后產(chǎn)物進行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系見表6。其反應(yīng)條件為37℃，2h。將上述連接體系再次用PmeI消化，以減少轉(zhuǎn)化后的空載體質(zhì)粒。二次消化體系見表7，反應(yīng)條件為37℃，2h。表5消化載體體系表6連接反應(yīng)體系表7二次消化體系(3)轉(zhuǎn)化取酶切連接產(chǎn)物5ul加到50ul的感受態(tài)細胞(DH5α)中，輕輕搖勻，冰浴30min。42℃熱激90s，快速轉(zhuǎn)到冰浴2-3min，注意不要搖動管。向管中加入500ul的LB培養(yǎng)基，150rmp，37℃，搖45min。將菌液全部涂到含100ug/mlAmpicilin的LB平板上。將平板正置直至液體全部吸收。倒置平板，于37℃培養(yǎng)16h。(4)抽提質(zhì)粒挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落，接種到2ml含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37℃，150rpm，搖床培養(yǎng)12～16h。取1-1.5ml培養(yǎng)物倒入1.5ml離心管中，4℃，13000rpm離心30s，棄上清，然后再短暫離心，用槍頭將離心管底部少量殘液吸出棄掉。剩余菌液4℃保存。將細胞沉淀漩渦震蕩打散后，重懸于100μl冰預(yù)冷的堿裂解液Ⅰ中，漩渦震蕩，使細菌懸浮均勻。細菌重懸液中加入200μl堿裂解液Ⅱ，上下翻轉(zhuǎn)離心管5次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上(<5min)。加入150μl冰預(yù)冷的堿裂解液Ⅲ,上下翻轉(zhuǎn)離心管8次,使溶液Ⅲ在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，并將離心管置于冰上1～3min,4℃，13000rpm離心5min，將～400μl的上清轉(zhuǎn)移至另一個離心管中。加400μl酚:氯仿(V:V＝1:1)，震蕩充分混合有機相和水相，13000rpm離心2min，取上清于新離心管中。用2～2.5體積的乙醇(850μl)室溫沉淀核酸，混合均勻，室溫靜置2min。13000rpm離心5min。小心的把上清倒掉(注意不要把沉淀倒出)；然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出棄掉。加1ml左右70％乙醇于沉淀中，顛倒離心管數(shù)次，洗滌管壁與沉淀，如沉淀偏離管底需13000rpm離心1min。小心的把上清倒掉(注意不要把沉淀倒出)，然后再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出(若沉淀漂浮，用槍頭將其置于離心管底部)。打開離心管，室溫靜置3～5min，使乙醇充分揮發(fā)，直至離心管內(nèi)沒有可見的液體存在。加50μlTE緩沖液(含20μg/mlRNaseA)于離心管中，靜置5min，溫和震蕩混勻。貯存于-20℃，并取5ul用于瓊脂糖凝膠電泳的檢測。(5)測序?qū)⒛z電泳檢測后確定有片段插入的質(zhì)粒(條帶位置高于ctrl的質(zhì)粒)送于測序公司進行測序。測序引物即為PCR反應(yīng)的引物。2.實驗結(jié)果質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3a/b/c所示。將條帶位置高于ctrl的質(zhì)粒送于公司測序，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)該段序列中含有2段STR位點。其中STR1有5種TA序列的重復(fù)，分別是13，14，15，18，19個TA的重復(fù)序列。STR2有6種TA重復(fù)序列，分別是24，15，22，13，21，7個TA的重復(fù)。結(jié)合實施例3的測序結(jié)果，胡蘿卜XylT的全序列如下(其中STR1與STR2以c為例)：ATGAAGACGAAAAGTTTAAAGATTATTATATTTCTCATATTGATCAACACAATAACCCTCTTTCTCTACTTGTCATCTCACCCCGACTACTTGAAACACCGCTCACCTCCCTCTCCCCAGCAAGCCCATCATCATTTTTCTGGGTTTTCTCAAATCAATTCTTCAACTAAGCCCTGGCCCATCCTCCCCTCTTATCTCCCCTGGTCTCAGAACCCTAATGTTAAGTTTGGATCATGTGAGGCTTATTTTGGTAATGGTTTTACTCGACCCTTTTATCTTCTCAACTCCTCTTCGGGTTCCGATGGTTGGTTTCGGTGTTTCAAGAGTGATACTTTGTTGACTTCTATTTGTGAAGGTGGGATTATTAGAATGAATCCGGCTAAGATTAATATGTCTCATGGTGGTGAGCTCTTGGAGACTGTTATTGGCAGGGAAGAGAATGATGAGCTGCCTGTTTTCCAGCCCGGAGCTTTCGATATTCTGGTTCATAACAAGGCCAAATTTGGGGATAAGATTATAACTCCCTATTTGCTTCATCGTGTTTTTCCGCAAGGGGAGGTTATTAGGCACACTATGCGCAGCTTGTTGAATTCCATTCGCTTGGTTTCACCTGGTGACTTTCAATGCTCTGAGGTAATCAACGTCGTCTCTTTGCTTGCATTTATGTTTTTTGTCTGATTATTGTCTACTCCACTTTCTATTTAATGCTACTAGCAGATTATACCATGCCGAGATAATTAGGATAACCAACCTTAACTCTATACTTACTATCCAAGATAATTAGGATAACCAACCTTAACTCTATACTTACTATGCGCTCATCATTGGATTAGTATTCTTAGTAATAGATAGAGTTCAGCAGTATAATAGATGCATGCCCTTGAGCTATTTTTATTGTGATTATTTGATTCAGAAGTGAAGGCCGAATCCTTTTCTGGAGTTGAGTAAATACTGCAATATGTCCTACTTATCACCACATTTATTACCCTTTTTTTTGGTGGAGGCAATTTTAGAAGTTTTTAATACTTACACCCTTGGACAACTTAATCAAAGTTTAAATCCTTATATTATATTTGGTTGGGGTGAATGAAAATGGACGGAATAGAATGAAATTTGAACTACTCCCTCCGTCTCACCAAATTGTTTACGTTGGGTTTGGGCACGGAGGTTAAGAAATATGTATAAAGTAGTGGAAAAGAGAAAGAAAAGTGGGTGAAATGGTGGGACCCATTGATTTTTAATATATAAAAGAGATAGTGGAGTAAAAGTAGTGTGAAAAGGAAAAAAAAAGTGGGAAAGTGGTGGGACCCATTAACTATTTTAGGAAAGTTTTATAATGTAAAGAAATGAGTGGGACGTCCAGAAAAGGAAACTTTAAAGAATCTGGTGGGACGGAGGGAGTATAATTTAGTTAAATGTTTAATAATTTCATTTCCTCCATCATTCCACTCTTATCACCCTTAACTTGAGCTCAAGCCCTCCGCTTTATGAAGGAATGCTACATTCTTTATCATATCCATTTTCTACCCAAATCTCATCATACAAAATTTGCATCCACTCATTATTTTTTTCCAAGTCCTTCCTTTTACCCTTAAATTTTTTCTTTTTATTTTCACTCGCTCCATTCCATTCCATTTCATTCACCCCAACCAAACAAAACATTAACCTCGTATTACTATGAGGCGAGGGGTATTCGATGTAGTTGGATCTTTTGATTTCTTGATGGCATGGTCAAGATTTTTGTTTGTTCAGATGTCAAGAATATATATATATATATATATATATATATATATTCAAAAGTGATGGCCGAAGCTTTTTTTTTTTTAACTTGAGCATTTATTATCCTTTTTCTTGGTAGGGGCAATTTTAGAAATTTTTAATACTCACACTCTTGGGCAACTGCATTGAAGTTAAAACCCTTGTGTTTCCTTGGCGTGAATGAAGATGGAATGAATGGAATGAAATTTGAGCTATAATTTAATTAAATGTTTAATAATTTCATTCCCTCCATCATTCCATTTCTATCACCCTTAACTAGACTCAAGCCATCCACTTTGTGAAGAAATTCTCCATTCCTATCATACCTACTTTCTACCGCAATCTCATCATGCAAAATTTGCATCCCCACATTAGTTTTTCAAGTCCTCTCTTTTATCCTCTACCCTTTGTTATATCCTTTTATTTTCACACATCCATTGACCCCAACCAAACACAACATTAACCTCTCATTACCTTGAGGCGAGGGGTATACACTATACTATGTAGTTGGATATTTTGATTTCTTCATGGCGTGGATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAATAGGGTCCTACTTCACTACAAACTTTCTTAAAATAAAAACTATAAATTAATATTATTTTTTTAACTCACATCAAAATATCAAACATATGGTTTGAAAATTGATCGTTGGAAGATTAAGAAAAATACAGCTGTGGAAGACAACTAGGGTTGCAATTAAAAGATGACAATGGAGGTGAAAGAGGCAGAAGAGAGGAGGCAACAGCGGTGGGTGAAGGAGGCGGTGGAGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGTGGAAGTGGTGGAGATGGAGGTGTAGGTATTAGTGATATGAGCTTCAGAATTTAGTGATATTTGAGGTGGGTTTTTAGTTTCTAGGATAAGGAGGTTTCTATTAGAGTAAGACTCTCTCTCTCTCTCTATATATATATAACTACATTATACATATGATTCCACATGCTTACAACTTACAAGGGATTTTGGTGTGCGCCATGTCGTGGGCTTTGGCCGGAGAAACACTTGGAAATACACTTTCACTCAAAATCTAGGTCAGAGCAAGAATGTTATTGTTTATCTTGTATGGAAAATTAATAAACAAGTCAAAGTGTCGCAAAACTTTTCGGTGTATGTCTTGCCTTGACTCTTTATGAAAATAAATATAATACATATAAGTAGGTGCAGATTTCATCTTCATGTTTCCAGTATTACACAATTAGTAGTCATCTCTTGTTCTGACACATCTATGTTTCTTAAGAAATAATATGGAATACCAATGTCATAAAACTGAAAGTCCTATCCATAATTTATCACCAGATGTCCCTTTTAAATATTGTACCATCTCTTACAGTTTGGTATTTAAGTTCTTGACTTATAGTATCTATCTTCAGTGGGTTGAGGAGCCAACACTTTTGGTTACACGCTTTGAGTATGCAAACCTATTTCATACAGTTACAGATTGGTATGCTGCATACGTGGCTTCTAGAGTAACTGGTTTGCCCTATCGTCCTCAGCTGGTGTTTGTAGATGGTCACTGCATGGTAAGTGTACTCAGCTTCACTTCATTACAGTATTTAGTATTTACAGATCGTAATTCTTCTTGTTGGTGTCATGATGATTGCCTGCTCGCAAATTCATTATGTGCAGTCTTTCACTTATAAATATTCCATGTTCTTTAATTCAGACATATGTAGAACATTATATATTTTGTTATATTTTTCAAATCTGAACCTGTATATAAGCAACCAGAATAGTGTGGTTACTCATTTACCTTGATACTGCTGTATGAATGCTTTTTCATTCTTTCCTGTTAAATGCTATGTAGATGATTGGGCACAATCTTAAATATGTGAAGTTGACAAGCAGTAGGCACACATTAGTTTTTGGCATTTTGCTTTTCAAATTTTTAGAATTCATATATTTTAAATTTGTCTAAAGAAAAAGGTACATTTTAATGTATATGTAAGTAACTACGTCGAGTCCCTGGGTATTCCTGGTGCTCACGTTCTTATCTACTTGCCTAGATATGTTCCACACAGAACCAACATGCTGCATAGAATTATCTTCTTAATGTCTTGTCAATGTTCCAGGCACCCTTGGAAGAAACATGGAAAGCGATGTTCTCAAGCCTAAGATATGCTAAAAATTTTAGTGGACCTGTTTGTTTTCGCCATGCTATCCTTTCACCTTTAGGATATGAAACTGTCCTATTTAAAGGGCTGACTGAAGACGTAGATTGCCATGGAGCTTCTGCTCATGATCTGTGGCAACAGCCTGATGATCGAAAAACAGCTCGCATATCTGAATTTGGAGAGATGATAAGAGCTTCCTTTGGATTTCCTGTGGATAGGCACCAAACTTCGAAGCCCGATGCAGGTCTAAATGTTCTCTTTGTTCGGCGTGAGAATTACTTGGCTCATCCACGCCATGCTGGTAAGGTTCAATCAAGGCTCGCCAACGAACAAGAGCTTTTTGATTCGTTAAAGATCTGGGCATCAAAAGATGTAGATTGCAAAATAAATTTAGTCAATGGGATATTTGCCCATATGCCGATGAAAGATCAGGTCCGAGCAATTCACGATGCCTCGGTCATTATTGGGGCTCATGGAGCTGGCCTCACTCATATAGTGTCAGCCTCACCGAAAGCAGTTATTCTAGAGATCGTTGCTGCTGAGTTTATGCGCCCGCATTTCACGCTTATTGCAAAATGGAAAGGATTAGAGTACCATCCTATATTCTTGTCAGACTCTTATGCTAAACCTTTAATTGTCAAACAAAAACTTAGTAGCATCCTGAAAACCCTTGGATGCTAA(SEQIDNO.13)(粗體字母為胡蘿卜XylT基因的3段exon序列，斜體字母部分為STR位點)。其中，第一STR位點的核苷酸序列如SEQIDNO.25所示，具體為：TATATATATATATATATATATATATATATA；第二STR位點的核苷酸序列如SEQIDNO.26所示，具體為：TATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA。胡蘿卜的XylT基因全序列為其作為被敲除基因的靶點奠定了重要的基礎(chǔ)，實施例5將基于此序列結(jié)果設(shè)計相應(yīng)的gRNA。此外，本實施例的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了胡蘿卜XylT基因中含有兩段STR位點，這為胡蘿卜等植物的進化研究及其種屬鑒定提供了可靠依據(jù)。實施例5XylT基因中g(shù)RNA靶點的選取1.實驗方法根據(jù)實施例3和4中得到的測序結(jié)果，使用在線設(shè)計工具CHOPCHOP設(shè)計gRNA。具體操作步驟如下：打開靶點在線設(shè)計工具CHOPCHOP(http://chopchop.cbu.uib.no/)，輸入實施例3和4所測得的基因序列Exon1和Exon3，設(shè)置好各項選擇提交后，即可給出數(shù)個合適的在PAM序列周圍的靶位點供選擇，并給出各位點的潛在脫靶位置、數(shù)目等信息。根據(jù)給出的這些靶位點，綜合考慮各項參數(shù)后選擇預(yù)測脫靶效應(yīng)較低的靶位點。根據(jù)以下原則進行篩選：脫靶數(shù)目的多寡；脫靶處是否有錯配還是可以完美結(jié)合非目標(biāo)序列；靶標(biāo)序列在基因中的位置，越靠近5’端越好；GC含量，有近期研究顯示GC含量在40％～80％的gRNAs更有效；在靶標(biāo)處20位左右的鳥嘌呤可以增加剪切效率。設(shè)計的兩種gRNA中，gRNA1用以敲除XylTExon1，gRNA2用以敲除XylTExon3。2.實驗結(jié)果使用在線設(shè)計工具CHOPCHOP分別獲得gRNA1和gRNA2的靶點位置及其序列。gRNAgRNA靶點序列5’-3’(含PAM序列)序號gRNA1GAGATGACAAGTAGAGAAAGAGGSEQIDNO.14gRNA2GAGCTTCTGCTCATGATCTGTGGSEQIDNO.15實施例6gRNA活性的體外檢測1.實驗方法此步實驗使用北京維尚立德生物科技有限公司的Cas9-gRNA靶點效率檢測試劑盒(Catalog.No.VK007)。具體操作步驟如下：(1)gRNAPCR產(chǎn)物的獲得a：引物合成先合成含有T7promoter的gRNA引物，引物序列見下表：正向引物中，序列TAATACGACTCACTATAG是T7promoter，斜體字母為gRNA靶點，序列GTTTTAGAGCTAGAAATAGC是gRNA骨架部分。反向引物亦為gRNA骨架部分。b：PCR擴增反應(yīng)：使用上述引物(引物需稀釋濃度為10uM)，并以含有g(shù)RNA骨架的質(zhì)粒為模板(本實驗選用北京唯尚立德生物科技有限公司的標(biāo)準(zhǔn)gRNA模板VK007-17)進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為98℃1min，95℃0.5min，55℃0.5min，68℃1min，35個循環(huán)，68℃1min。PCR產(chǎn)物大小為120bp。反應(yīng)體系見下表：ReagentsVolume2×KODFXBuffer25ul2mMdNTPs10ul10uMPrimergRNAg1F/gRNAg2F1.5ul10uMPrimergRNAR1.5ulTemplateDNA(ng)5ngKODFX1ulddH2OTo50ulc：PCR產(chǎn)物的純化與檢測使用瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化，并用1.5％瓊脂糖凝膠電泳對其進行檢測。濃度應(yīng)大于70ng/ul。此步需要DNA濃縮處理后濃度才能達到要求。純化步驟詳見實施例2。DNA濃縮步驟如下：向純化后DNA溶液中加入1/10體積的3MNaAc，混勻。再加入2倍體積的無水乙醇，混勻。4℃靜置10-30min。12000rpm，4℃離心10min。棄上清，加入700ul75％乙醇清洗沉淀。12000rpm離心1min。棄上清，室溫放置幾分鐘，晾干乙醇，加入DNA洗脫緩沖液溶解DNA，室溫靜置5min，混勻。跑膠鑒定。(2)gRNA的轉(zhuǎn)錄gRNA的體外轉(zhuǎn)錄體系如下：反應(yīng)結(jié)束后，加入2ulDNaseI，37℃反應(yīng)30min。(3)gRNA的回收與提取加入115ulDEPC水，15ulStopSolution均勻后，加入2倍體積的無水乙醇，混勻后，-20℃凍存過夜。13000rpm4℃離心20min，去除上清保留沉淀。加入300ul的70％乙醇清洗沉淀，13000rpm4℃離心1min，棄上清，室溫晾置1-2min后，加入40ulDEPC水溶解RNA沉淀。用NanoDrop測其濃度。(4)體外酶切反應(yīng)反應(yīng)體系如下：充分混勻后，37℃1h。用2％的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。2.實驗結(jié)果圖4為gRNAPCR產(chǎn)物純化后1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測示意圖；經(jīng)DNA濃縮后，用NanoDrop測其濃度gRNA1的PCR產(chǎn)物為73ng/ul，gRNA2的PCR產(chǎn)物濃度為80ng/ul。圖5為2％的瓊脂糖凝膠電泳酶切鑒定示意圖；結(jié)果可知gRNA1和gRNA2體外檢測均有活性，且活性很好。故gRNA1和gRNA2可以做為胡蘿卜XylT基因的2個gRNA靶點。實施例7敲除XylT基因的CRISR/Cas9質(zhì)粒構(gòu)建1.實驗方法此步驟所用試劑盒為北京唯尚立德生物科技有限公司的植物Cas9/gRNA質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒(Catalog.No.VK005-04)。此試劑盒能快速方便地將gRNA靶點序列插入到CAS9/gRNA質(zhì)粒中，且多個gRNA可以構(gòu)建到同一載體中。詳細步驟如下：(1)使用CHOPCHOP軟件確定gRNA靶點位置后，按照如下格式設(shè)計引物：Target-Sense：5’-TTG-gRNAsenseTarget-Anti：5’-AAC-gRNAanti(gRNA引物不能加上PAM序列)將合成的引物分別稀釋成10μM后，按如下比例混合均勻：ReagentsVolumeTarget-Sense5μLTarget-Anti5μLH2O15μLTotal25μL混勻后，按照如下程序處理：95℃3min→95℃到25℃緩慢冷卻(可將樣品管放在95℃水中，自然冷卻至室溫)→16℃5min(2)按照如下體系，將各試劑添加進PCR管中，混合均勻，16℃反應(yīng)2h。(3)取上一步最終產(chǎn)物5-10ul轉(zhuǎn)化至50ulDH5a感受態(tài)細胞中。具體步驟詳見實施例4轉(zhuǎn)化。(4)挑3-5個菌落搖菌，抽提質(zhì)粒后跑DNA膠檢測，將大小對的質(zhì)粒送測序。測序引物為：sqprimer:5’-GATGAAGTGGACGGAAGGAAGGAG-3’(SEQIDNO.19)。按照上述方法將g1，g2質(zhì)粒構(gòu)建好后，進而構(gòu)建串聯(lián)質(zhì)粒g1g2。利用VK005-04的三個酶切位點，將g1與g2串聯(lián)在同一質(zhì)粒中，得到敲除XylT基因質(zhì)粒g1g2。首先構(gòu)建好g1和g2后，使用AscI+SpeI酶切處理g2，得到U6g2片段。在這里，為了獲得較多的該片段，使用了PCR的方法來擴增大小為569bp的U6g2片段，經(jīng)過純化及測序鑒定序列正確后，將其與AscI+AvrII酶切處理過的g1質(zhì)粒載體進行連接。獲得U6g2片段的PCR反應(yīng)引物見下表：引物名稱引物序列5’-3’序號U6g2FCGAGCTCGGTACCCGGGGATCSEQIDNO.20U6g2RGAGGATAAAACCTCACCAAAATACGSEQIDNO.21U6g2片段大小約為590bp，故PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)參數(shù)為：98℃1min，95℃0.5min，55℃0.5min，68℃1min，30個循環(huán)，68℃2min。PCR反應(yīng)體系見下表：ReagentsVolume2×KODFXBuffer25ul2mMdNTPs10ul10uMPrimerU6g2F1.5ul10uMPrimerU6g2R1.5ulTemplateDNA(ng)質(zhì)粒g25ngKODFX1ulddH2OTo50ulg1質(zhì)粒用AscI+AvrII酶切的消化體系見下表：消化后g1載體與U6g2片段的連接體系見下表：取5ul上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細胞中，挑單克隆，抽提質(zhì)粒后酶切鑒定，選取酶切鑒定后正確的質(zhì)粒用sqprimer測序引物進行測序。2.實驗結(jié)果圖6a和6b所示g1和g2質(zhì)粒1％瓊脂糖凝膠電泳檢測示意圖；質(zhì)粒大小約為16kb。g1質(zhì)粒挑選3號克隆的測序結(jié)果如下(gRNA用斜字體表示)：5’-CAGGAAACAGCTATGACATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCTTTCACTGGCGCGCCCCAATGTCCCTAGGTTCGTTGAACAACGGAAACTCGACTTGCCTTCCGCACAATACATCATTTCTTCTTAGCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGGAGATGACAAGTAGAGAAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTACTAGTTTTGATCTTGAAAGATCTTTTATCTTTAGAGTTAAGAACTCTTTCGTATTTTGGTGAGGTTTTATCCTCTTGAGTTTTGGTCATAGACCTATTCATGGCTCTGATACCAATTTTTAAGCGGGGGCTTATGCGGATTATTTCTTAAATTGATAAGGGGTTATTAGGGGGTATAGGGTATAAATACAAGCATTCCCTTAGCGTATAGTATAAGTATAGTAGCGTACCTCTATCAAATTTCCATCTTCTTACCTGCACAGGGCCTGCAACCTACTGCTCAA-3’(SEQIDNO.22)。其中，第一gRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.27所示，具體為：GAGATGACAAGTAGAGAAAG。g2質(zhì)粒挑選3號克隆的測序結(jié)果如下(gRNA用斜字體表示)：5’-CAGGAAACAGCTATGACATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCTTTCACTGGCGCGCCCCAATGTCCCTAGGTTCGTTGAACAACGGAAACTCGACTTGCCTTCCGCACAATACATCATTTCTTCTTAGCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGGAGCTTCTGCTCATGATCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTACTAGTTTTGATCTTGAAAGATCTTTTATCTTTAGAGTTAAGAACTCTTTCGTATTTTGGTGAGGTTTTATCCTCTTGAGTTTTGGTCATAGACCTATTCATGGCTCTGATACCAATTTTTAAGCGGGGGCTTATGCGGATTATTTCTTAAATTGATAAGGGGTTATTAGGGGGTATAGGGTATAAATACAAGCATTCCCTTAGCGTATAGTATAAGTATAGTAGCGTACCTCTATCAAATTTCCATCTTCTTACCTGCACAGGGCCTGCAACCTACTGCTCAA-3’(SEQIDNO.23)。其中，第二gRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.28所示，具體為：GAGCTTCTGCTCATGATCTG。圖7所示PCR反應(yīng)U6g2片段的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測示意圖；U6g2片段大小約為590bp。圖8所示轉(zhuǎn)化后g1g2串聯(lián)質(zhì)粒1％瓊脂糖凝膠電泳檢測示意圖；質(zhì)粒大小約為16.6kb。圖9所示g1g2串聯(lián)質(zhì)粒酶切鑒定1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測示意圖；被切下來的片段大小約為1180bp。g1g2串聯(lián)質(zhì)粒的測序結(jié)果如下(gRNA用斜字體表示)：5’-CAGGAAACAGCTATGACATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCTTTCACTGGCGCGCCCCAATGTCCCTAGGTTCGTTGAACAACGGAAACTCGACTTGCCTTCCGCACAATACATCATTTCTTCTTAGCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGGAGATGACAAGTAGAGAAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTACTAGGTTCGTTGAACAACGGAAACTCGACTTGCCTTCCGCACAATACATCATTTCTTCTTAGCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTGCGGGTTCCGATGGTTGGTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTACTAGTTTTGATCTTGAAAGATCTTTTATCTTTAGAGTTAAGAACTCTTTCGTATTTTGGTGAGGTTTTATCCTCTTGAGTTTTGGTCATAGACCTATTCATGGCTCTGATACCAATTTTTAAGCGGGGGCTTATGCGGATTATTTCTTAAATTGATAAGGGGTTATTAGGGGGTATAGGGTATAAATACAAGCATTCCCTTAGCGTATAGTATAAGTATAGTAGCGTACCTCTATCAAATTTCCATCTTCTTACCTGCACAGGGCCTGCAACCTACTGCTCAA-3’(SEQIDNO.24)。采用本實施例所構(gòu)建的g1g2串聯(lián)質(zhì)粒的去敲除XylT基因，結(jié)果敲除效率高。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明任何形式上和實質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)對上述實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3