本發(fā)明提供了一種控釋抑菌性食用復(fù)合膜及其制備方法，更具體地說(shuō)涉及大豆分離蛋白/果膠/Nisin/乳酸鈉復(fù)合抑菌包裝膜及其制備方法，屬于食品包裝技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在各種包裝材料中，塑料以其優(yōu)越的性能及較低的成本廣泛地用于食品包裝，但是塑料包裝性質(zhì)穩(wěn)定，使用后遺棄在環(huán)境中不易分解腐爛，長(zhǎng)期存留，易引起環(huán)境污染。目前人工合成膜的應(yīng)用正受到來(lái)自安全和環(huán)保方面的挑戰(zhàn)，可食性包裝膜因具有更高的安全性和環(huán)保性而成為研究的趨勢(shì)。從蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)等生物大分子中開(kāi)發(fā)可食的涂層和薄膜已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外科研工作者研究的熱點(diǎn)。
大豆蛋白分子中存在大量的氫鍵、疏水鍵、離子鍵等作用，大豆分離蛋白(SPI)是一種經(jīng)堿溶酸沉法提取得到的高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，蛋白質(zhì)含量達(dá)92%以上，使得大豆蛋白具有良好的成膜性能。以大豆蛋白粉為基質(zhì)，添加甘油、山梨醇等作為增塑劑，可制成具有良好強(qiáng)度、彈性和防潮性等特點(diǎn)的可食性膜或涂層，可以保持水分，阻止氧氣滲入，還能保持脂肪類食品的原味。
隨著食品科技的發(fā)展和消費(fèi)者對(duì)食品高質(zhì)量的要求，食品包裝正朝著活性食品包裝的方向發(fā)展。其中抑菌食品包裝是應(yīng)用最為廣泛的活性食品包裝之一。雖然食品在加工過(guò)程中就已經(jīng)過(guò)滅菌處理，食品在儲(chǔ)運(yùn)或開(kāi)封后容易被微生物二次污染。抑菌食品包裝可抑制食品表面的微生物污染，提高食品的安全性，并延長(zhǎng)其貨架期，在今后的食品包裝市場(chǎng)中必將具有廣闊的應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種Nisin/乳酸鈉-大豆分離蛋白復(fù)合控釋抑菌膜及其制備方法，方法簡(jiǎn)便、易于操作，該方法在復(fù)合膜中添加Nisin/乳酸鈉復(fù)配抑菌劑，改善了膜的性能并使其具有抑菌性，從而延長(zhǎng)了食品的貨架期。
本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題：解決目前國(guó)內(nèi)外食品包裝研究領(lǐng)域所制備的可食性蛋白膜在貯藏、包裝食品時(shí)抑菌性差，最終導(dǎo)致包裝食品保質(zhì)期顯著下降，成為限制可食性膜應(yīng)用于食品包裝行業(yè)的共性問(wèn)題。
本發(fā)明解決的技術(shù)方案：一種可食性控釋抑菌蛋白復(fù)合膜的制備方法，其特征在于按照以下步驟制備：
(1)準(zhǔn)確稱取LM-106As果膠于燒杯中，加入去離子水100mL用恒溫加熱磁力攪拌器在80℃下攪拌，直到全部溶解為止，制成果膠溶液；
(2)稱取大豆分離蛋白于燒杯中，加入去離子水1000mL，用玻璃棒攪拌均勻后，用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9，用恒溫加熱磁力攪拌器在80℃下攪拌30min后，在4000r/min的離心機(jī)中離心15min，把上清液倒入燒杯中。稱取上清液的質(zhì)量，向燒杯中滴加甘油，攪拌均勻，制成大豆分離蛋白溶液；
(3)取大豆分離蛋白溶液于100mL燒杯中，再按大豆分離蛋白溶液：果膠為一定的比例加入果膠，放入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（95℃，功率60Kw，超聲2s/間歇2s，運(yùn)行總時(shí)間為5min）進(jìn)行乳化，制成復(fù)合涂膜液一；
(4)取果膠溶液20mL于燒杯中，在向燒杯中加入乳酸鈉溶液和Nisin，待Nisin充分溶解后加入大豆分離蛋白溶液100mL，放入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中（95℃，功率60Kw，超聲2s/間歇2s，運(yùn)行總時(shí)間為5min）進(jìn)行乳化，制成復(fù)合涂膜液二；
(5)將配置好的復(fù)合涂膜液一量取30mL在有機(jī)玻璃板上涂膜，并把有機(jī)玻璃板置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱中在70℃下干燥1h；然后將配置好的復(fù)合涂膜液二量取50mL在第一層膜上進(jìn)行涂膜，并把有機(jī)玻璃板置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱中在70℃下干燥1.5h；最后再次量取復(fù)合涂膜液一20mL在有機(jī)玻璃板上涂膜，并把有機(jī)玻璃板置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱中在70℃下干燥1h取出。干燥后室溫放置6-7h，水浴溫度為87℃回軟45s后揭膜；
(6)成品。
優(yōu)選步驟(3)中所述的大豆分離蛋白溶液與果膠二者的混合物質(zhì)量比為5：1；步驟(4)中所述的抑菌劑為Nisin與乳酸鈉二者的混合物，二者的混合物質(zhì)量比為1：12。優(yōu)選步驟(5)有機(jī)玻璃板的板槽規(guī)格為長(zhǎng)×寬×高300 mm×300 mm×10mm，倒膜量為100g。
同時(shí)提供上述方法制備的食用復(fù)合膜，具有以下特征：
(1)在貯藏期2個(gè)月內(nèi)，貯藏溫度25℃、濕度50%，所述食用復(fù)合膜抑菌圈直徑僅減小10-15%，而未經(jīng)控釋技術(shù)處理所得抑菌蛋白膜在直徑減小接近100%；及
(2)在貯藏期2個(gè)月內(nèi)，復(fù)合膜拉伸強(qiáng)度降低3-9%，而僅大豆分離蛋白-果膠復(fù)合膜的拉伸強(qiáng)度降低20-30%；及
(3)在貯藏期2個(gè)月內(nèi)，復(fù)合膜透水性增加2-7%，而僅大豆分離蛋白-果膠復(fù)合膜的透水性增加8-19%；及
(4) 在貯藏期2個(gè)月內(nèi)，復(fù)合膜透氧性增加4-5.5%，而僅大豆分離蛋白-果膠復(fù)合膜的透氧性增加8-13.8%；及
(5) 在貯藏期2個(gè)月內(nèi)，復(fù)合膜透二氧化碳性增加2-4.5%，而僅大豆分離蛋白-果膠復(fù)合膜的透二氧化碳性增加7-9.3%。
其中，抑菌性的評(píng)定方法為在培養(yǎng)皿中抑菌圈的直徑大小來(lái)判斷，且抑菌性能的評(píng)定方法是：
式中：d0——溫度為25℃、濕度為50%環(huán)境貯藏2天后復(fù)合膜的抑菌圈直徑；dt——溫度為25℃、濕度為50%環(huán)境貯藏t天后復(fù)合膜的抑菌圈直徑。
本發(fā)明通過(guò)添加Nisin/乳酸鈉天然復(fù)配抑菌劑制備以大豆分離蛋白為原材料的食品包裝膜，Nisin可以與能夠引起食品腐敗的G+菌細(xì)胞膜結(jié)合，插入和孔道形成等多步過(guò)程形成孔道復(fù)合物，引起細(xì)胞液泄露，從而導(dǎo)致菌株死亡；乳酸鈉的添加可減低產(chǎn)品的水分活性，從而阻止微生物的生長(zhǎng)；乳酸根離子有抑菌功能團(tuán)。乳酸鈉對(duì)鼠傷害，沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用。乳酸鈉的抑菌范圍主要針對(duì)革蘭氏陰性菌，可與 Nisin 形成互補(bǔ)，擴(kuò)大其抑菌譜，繼而達(dá)到殺菌的效果。以食品微生物分析中的常見(jiàn)污染菌如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌及金黃色葡萄球菌等為研究對(duì)象，考察復(fù)合膜對(duì)有害生物的處理效果，開(kāi)發(fā)出在一種既具有良好物理性能又具有抑菌性能的復(fù)合膜，這能夠提供一種新的食品包裝膜，更好的滿足食品的需要。
將制得的可食性大豆蛋白復(fù)合膜在溫度25℃、濕度為50%環(huán)境貯藏2個(gè)月后進(jìn)行機(jī)械性能測(cè)定（以大豆分離蛋白和果膠未經(jīng)Nisin交聯(lián)處理的復(fù)合膜為對(duì)照）：
（1）抑菌效果的測(cè)定
用切刀將膜裁成直徑為16.00mm大小的圓片，貼在均勻涂布了兩種受試菌種菌懸液的瓊脂培養(yǎng)基的表面（該過(guò)程在無(wú)菌條件下操作），將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)于37℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察膜表面菌體生長(zhǎng)現(xiàn)象，并記錄抑菌圈的直徑。
（2）拉伸強(qiáng)度（TS）測(cè)定
采用TA-XTplus2質(zhì)構(gòu)儀（TA.XT.Plus，英國(guó)SMS公司）對(duì)大豆分離蛋白可食性膜性能（機(jī)械強(qiáng)度）進(jìn)行分析。將待測(cè)樣制成長(zhǎng)×寬150×20mm的長(zhǎng)條，膜厚度為0.06mm。拉伸強(qiáng)度測(cè)定采用A/SPR彎形探頭。設(shè)置探頭最小感知力為5g，拉伸前探頭運(yùn)行速度為5.0mm/s，拉伸過(guò)程中的運(yùn)行速度為5.0 mm/ s，拉伸后返回過(guò)程中的運(yùn)行速度為5.0 mm/s，有效拉伸距離為50mm。可食性膜機(jī)械強(qiáng)度用拉伸強(qiáng)度（Tensile strength）即探頭拉伸過(guò)程中的最大感應(yīng)力F（單位g）表示。每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值。
（3）水蒸汽透過(guò)性測(cè)定
采用擬杯子法測(cè)定水蒸汽透過(guò)率：稱取3g經(jīng)干燥的無(wú)水氯化鈣并裝入直徑為20mm的稱量瓶中，用石蠟將待測(cè)的大豆蛋白復(fù)合膜密封于瓶口處，置于相對(duì)濕度為83%的干燥器中（內(nèi)裝溴化鉀飽和溶液），于1天（24h）后稱量，通過(guò)杯重的增加量計(jì)算水蒸汽的透過(guò)率。
WVTR：水蒸汽透過(guò)率(mg/cm2·d)；△m：水蒸汽遷移量(mg)；A：膜的面積(cm2)；t：測(cè)定時(shí)間(s)；
（4）透氧性測(cè)定
在稱量瓶裝3mL亞油酸，其它過(guò)程同水蒸汽透過(guò)性測(cè)定方法。
（5）透二氧化碳性測(cè)定
在稱量瓶裝3mLKOH飽和溶液，其它過(guò)程同水蒸汽透過(guò)性測(cè)定方法。
（6）抑菌性能的評(píng)定方法是：
式中：d0——溫度為25℃、濕度為50%環(huán)境貯藏2天后實(shí)驗(yàn)組復(fù)合膜的抑菌圈直徑；dt——溫度為25℃、濕度為50%環(huán)境貯藏t天后復(fù)合膜的抑菌圈直徑。
本發(fā)明的有益效果：
（1）本發(fā)明通過(guò)添加Nisin/乳酸鈉復(fù)合天然抑菌劑制備以大豆分離蛋白為主要原材料的食品包裝膜，通過(guò)抑菌劑破壞細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)從而達(dá)到殺菌的效果。選取食品微生物中常見(jiàn)的大腸桿菌、沙門(mén)氏菌及金黃色葡萄球菌污染菌為研究對(duì)象，考察復(fù)合膜對(duì)污染菌及其菌群的抑菌效果，另外，復(fù)合抑菌劑中的NISIN開(kāi)發(fā)出在一種既具有良好物理性能又具有抑菌性能的復(fù)合膜，這能夠提供一種新的食品包裝膜，更好的滿足食品的需要。
Nisin的作用方式如表面活性劑，它對(duì)細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞及孢子都有作用，類似于陽(yáng)離子去污劑，吸附于細(xì)胞后破壞細(xì)胞膜，造成細(xì)胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)的外泄。Nisin內(nèi)含有脫氫基團(tuán)和硫醚交聯(lián)認(rèn)為 Nisin 的活性與非常見(jiàn)脫氫殘基有關(guān)，這些脫氫基團(tuán)可與硫醇和其他有效親核物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。Nisin 能鈍化Bacillus cereus發(fā)芽孢子膜中的巰基基團(tuán)，抑制孢子的萌發(fā)。Nisin與其他螯合劑（如EDTA）結(jié)合使用時(shí)，螯合劑能改變細(xì)菌外膜的脂多糖層，使細(xì)胞表層通透性增加，Nisin能進(jìn)入到達(dá)細(xì)胞質(zhì)膜，與細(xì)胞膜磷脂發(fā)生靜電相互作用，形成孔道，增加了膜透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)小分子親水物質(zhì)如 ATP、ADP、單價(jià)陽(yáng)離子、氨基酸等快速溢出細(xì)胞，質(zhì)子動(dòng)勢(shì)徹底消失，細(xì)胞能量代謝衰竭因而死亡。也可能是內(nèi)部的氨基酸流動(dòng)，質(zhì)子動(dòng)勢(shì)的破壞，影響了細(xì)胞內(nèi)部 PH 值，造成細(xì)胞質(zhì)凝集甚至細(xì)胞解體。
乳酸鈉的使用目前還很有限。USDA 認(rèn)為乳酸鈉是安全的，最大使用量高達(dá)4%，乳酸鈉防腐的機(jī)理有以下幾個(gè)：①乳酸鈉的添加可減低產(chǎn)品的水分活性，從而阻止微生物的生長(zhǎng)；②乳酸根離子有抑菌功能團(tuán)，乳酸根離子影響了電化學(xué)質(zhì)子梯度的形成，因此形成對(duì)微生物代謝起著重要作用。由于電化學(xué)質(zhì)子梯度形成的阻礙，微生物需好用更多能量，使其能量缺乏而影響其生長(zhǎng)繁殖；③破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能完整性，使膜穿孔、破裂，導(dǎo)致報(bào)內(nèi)外物質(zhì)不能正常運(yùn)輸，抑制胞內(nèi)ATP正常合成的作用；④酸化胞內(nèi)環(huán)境，因其新陳代謝紊亂。乳酸鈉對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用。乳酸鈉的抑菌范圍主要針對(duì)革蘭氏陰性菌，可與 Nisin 形成互補(bǔ)。乳酸鈉的抑菌性不是特別顯著，以 Nisin的抑菌性為主要方面，乳酸鈉主要起到輔助抑菌、擴(kuò)大 Nisin 抑菌譜的作用，且乳酸鈉為微粘液體，它的加入也能部分影響到 Nisin 的擴(kuò)散，類似于甘油的作用。
同時(shí)，本發(fā)明創(chuàng)造性使用可控釋技術(shù)來(lái)制備具有抑菌性控釋的可食復(fù)合蛋白膜。通過(guò)控釋技術(shù)活性物質(zhì)的濃度能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持在有效的范圍內(nèi)，延長(zhǎng)了作用時(shí)間，提高了作用效果?？煽蒯尫偶夹g(shù)在抑菌包裝中研究的意義就在于：結(jié)合食品本身特性及其易感微生物生長(zhǎng)規(guī)律，設(shè)計(jì)合理的釋放系統(tǒng)，使得該系統(tǒng)中的抑菌劑以最佳速率釋放到食品表面，并能在食品表面維持抑制細(xì)菌所需的最佳濃度，有效保證食品安全，延長(zhǎng)貨架壽命。
具體實(shí)施方式一種可食性控釋抑菌蛋白復(fù)合膜的制備方法：
以大豆分離蛋白為50g，果膠為0.5g，甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，Nisin濃度為0.025g/100ml，乳酸鈉濃度為6%。
(1)準(zhǔn)確稱取LM-106As果膠0.5g于燒杯中，加入去離子水100mL用恒溫加熱磁力攪拌器在80℃下攪拌，直到全部溶解為止，制成濃度為0.5%的果膠溶液；
(2)準(zhǔn)確稱取大豆分離蛋白50g于燒杯中，加入去離子水1000mL，用玻璃棒攪拌均勻后，用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9，用恒溫加熱磁力攪拌器在80℃下攪拌30min后，在4000r/min的離心機(jī)中離心15min，把上清液倒入燒杯中。稱取上清液的質(zhì)量，向燒杯中滴加1.5%質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)的甘油，攪拌均勻，制成大豆分離蛋白溶液；
(3)取5%的大豆分離蛋白溶液于100mL燒杯中，再按大豆分離蛋白溶液：果膠為5：1加入果膠，放入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（95℃，功率60%，超聲2s/間歇2s，運(yùn)行總時(shí)間為5min）進(jìn)行乳化，制成復(fù)合涂膜液一；
(4)取果膠溶液20mL于燒杯中，在向燒杯中加入乳酸鈉溶液和Nisin，待Nisin充分溶解后加入5%大豆分離蛋白溶液100mL，放入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中（95℃，功率60%，超聲2s/間歇2s，運(yùn)行總時(shí)間為5min）進(jìn)行乳化，制成復(fù)合涂膜液二；
(5)將配置好的復(fù)合涂膜液一量取30mL在有機(jī)玻璃板上涂膜，并把有機(jī)玻璃板置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱中在70℃下干燥1h；然后將配置好的復(fù)合涂膜液二量取50mL在第一層膜上進(jìn)行涂膜，并把有機(jī)玻璃板置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱中在70℃下干燥1.5h；最后再次量取復(fù)合涂膜液20mL在有機(jī)玻璃板上涂膜，并把有機(jī)玻璃板置于恒溫鼓風(fēng)干燥箱中在70℃下干燥1h取出。干燥后室溫放置6-7h，水浴溫度為87℃回軟45s后揭膜；
(6)成品。
表1貯藏期間Nisin/乳酸鈉-大豆分離蛋白復(fù)合膜抑菌性能的變化
注：Ⅰ普通NISIN抑菌蛋白膜，Ⅱ?yàn)榭蒯屢志鞍讖?fù)合膜。上表中的負(fù)值如-1.2表示增加1.2mm。
表2對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組膜各項(xiàng)物理指標(biāo)的比較
注：①對(duì)照組為不添加復(fù)配抑菌劑的果膠—大豆分離蛋白復(fù)合膜；②透水性指標(biāo)越低，表示水分遷移量越少，膜防腐效果越好；透光率越低，光線越不易經(jīng)過(guò)薄膜照射進(jìn)入包裝內(nèi)的食品，越能更好地達(dá)到食品包裝保護(hù)的作用；對(duì)氣體的透性低能延緩食品的氧化變質(zhì)，從而起到抗氧化的作用；③抑菌性指標(biāo)采用抑菌圈直徑來(lái)表示，相同條件下，復(fù)合膜的抑菌圈越大的話表示膜的抑菌性能越佳。
本發(fā)明制作的復(fù)合膜，具有較好的物理性能和抑菌性，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。