本發(fā)明屬于生物分子克隆技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及白葉枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)的藥用野生稻Oo92082基因，基于該基因序列設(shè)計表達(dá)水平分析引物和特異擴(kuò)增引物。利用表達(dá)水平分析引物可通過Real-time PCR分析該基因在藥用野生稻受白葉枯病菌脅迫的不同時間點的相對表達(dá)量；利用設(shè)計的特異擴(kuò)增引物可以從藥用野生稻中分離克隆該基因，或從其它植物中分離克隆藥用野生稻Oo92082基因的同源基因。

背景技術(shù)：

由稻黃單胞桿菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的白葉枯病(Bacterial Blight,BB)是世界水稻生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一。培育抗病品種、分離克隆抗病基因輔助育種是防治水稻白葉枯病最經(jīng)濟(jì)、有效的方法。雖然一些抗白葉枯病基因通過應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選育和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，加快了水稻抗病育種的進(jìn)程，但現(xiàn)有的大部分白葉枯病抗性基因在水稻育種中的應(yīng)用仍然受到很大的限制，而已培育的攜帶抗病主效基因的抗病材料，由于病原菌生理小種的進(jìn)化和變異導(dǎo)致其原有的抗性基因逐漸喪失了抗性。因此分離克隆能夠介導(dǎo)持久和無小種特異性抗性的抗病相關(guān)基因，就有可能創(chuàng)造廣譜和持久的抗性材料，對抗白葉枯病育種有著重大意義。藥用野生稻(Oryza officinalis Wall.)對許多常見病害以及逆境等都具有抗性和耐受性，其抗性材料檢出率和抗性級別是各種野生稻中最高的，無論是在自然環(huán)境中還是在野生稻圃中，藥用野生稻都很少發(fā)病，因此，通過發(fā)掘藥用野生稻中高抗白葉枯病的新基因，并從中克隆分離抗病關(guān)鍵基因，對水稻抗白葉枯病育種具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄組測序(RNA Sequence)的研究對象為特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，廣義上包括信使RNA、核糖體RNA、轉(zhuǎn)運RNA及非編碼RNA，狹義上指所有mRNA的集合。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息，近年來，由此形成的技術(shù)路線被廣泛應(yīng)用于基因結(jié)構(gòu)、基因功能、尋找新基因、基因差異表達(dá)分析等研究領(lǐng)域，并且取得顯著成效。

本發(fā)明從白葉枯病菌脅迫的藥用野生稻轉(zhuǎn)錄組測序的差異表達(dá)基因中獲得一個Contig_92082基因，通過差異表達(dá)水平分析，該基因在白葉枯病強(qiáng)致病菌PXO99和C5脅迫下的表達(dá)水平比沒有接菌處理的對照組要高；Contig_92082基因經(jīng)注釋到NR、GO和KEGG等數(shù)據(jù)庫，未獲得任何功能注釋，且該基因最大開放閱讀框(ORF)編碼的氨基酸序列經(jīng)BLASTp比對，沒有任何同源性。經(jīng)上述分析，推測Contig_92082基因是一個直接參與藥用野生稻抗白葉枯病應(yīng)答進(jìn)程的新基因，將其命名為藥用野生稻Oo92082基因。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是克服現(xiàn)有栽培稻中原有的抗白葉枯病基因由于病原菌生理小種的不斷變異而逐漸喪失抗性，因而缺乏抗白葉枯病的新基因的缺陷和不足，提供一種新的白葉枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)的藥用野生稻Oo92082基因，該基因與白葉枯病抗性相關(guān)；還提供一種分析藥用野生稻Oo92082基因在藥用野生稻受白葉枯病菌脅迫的不同時間點的表達(dá)水平引物及其方法，一種特異擴(kuò)增藥用野生稻Oo92082基因開放閱讀框的的引物及其方法，從而為進(jìn)一步從藥用野生稻中分離克隆抗白葉枯病基因奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明所提供的藥用野生稻Oo92082基因是通過從白葉枯病菌脅迫的藥用野生稻轉(zhuǎn)錄組測序分析的差異表達(dá)基因中篩選到一個差異極顯著、編號為Contig_92082的基因，該基因在白葉枯病菌脅迫下的表達(dá)水平比沒有接菌處理的對照組要高；該編號基因經(jīng)注釋到NR、GO和KEGG等數(shù)據(jù)庫，未獲得任何功能注釋；且該基因最大開放閱讀框(ORF)編碼的氨基酸序列經(jīng)BLASTp比對，沒有任何同源性。經(jīng)上述分析，推測Contig_92082基因是一個直接參與藥用野生稻抗白葉枯病應(yīng)答進(jìn)程的新基因，將其命名為藥用野生稻Oo92082基因。該藥用野生Oo92082基因序列可以用于分析該基因在藥用野生稻受白葉枯病菌脅迫不同時間點的表達(dá)水平，并為分離克隆該基因提供序列信息。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1.一種白葉枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)的藥用野生稻Oo92082基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.技術(shù)方案1所述的一種白葉枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)的藥用野生稻Oo92082基因在藥用野生稻受白葉枯病菌脅迫不同時間點的表達(dá)水平分析引物，所述表達(dá)水平分析引物由上游引物和下游引物組成，所述表達(dá)水平分析引物的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，所述表達(dá)水平分析引物的下游引物序列如SEQ ID NO:4所示。

3.一種分離克隆技術(shù)方案1所述的一種白葉枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)的藥用野生稻Oo92082基因開放閱讀框的特異擴(kuò)增引物，所述特異擴(kuò)增引物由上游引物和下游引物組成，所述特異擴(kuò)增引物的上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，所述特異擴(kuò)增引物的下游引物序列如SEQ ID NO:6所示。

序列表中SEQ ID NO:1所示的是藥用野生稻Oo92082基因的核苷酸序列。它是由受白葉枯病菌脅迫下藥用野生稻轉(zhuǎn)錄組測序分析獲得的。

序列表中SEQ ID NO:2所示的是通過SEQ ID NO:1設(shè)計特異擴(kuò)增引物，從藥用野生稻中分離克隆獲得的藥用野生稻Oo92082基因的開放閱讀框的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO:3所示的是藥用野生稻Oo92082基因在藥用野生稻受白葉枯病菌脅迫不同時間點的表達(dá)水平分析引物的上游引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO:4所示的是藥用野生稻Oo92082基因在藥用野生稻受白葉枯病菌脅迫不同時間點的表達(dá)水平分析引物的下游引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO:5所示的是分離克隆藥用野生稻Oo92082基因開放閱讀框的特異擴(kuò)增引物的上游引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO:6所示的是分離克隆藥用野生稻Oo92082基因開放閱讀框的特異擴(kuò)增引物的下游引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO:7所示的是藥用野生稻Oo92082基因開放閱讀框編碼的氨基酸序列。

本發(fā)明首次提供了白葉枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)的藥用野生稻Oo92082基因，利用該基因序列設(shè)計了藥用野生稻Oo92082基因在藥用野生稻受白葉枯病菌脅迫不同時間點的表達(dá)水平分析引物和分離克隆藥用野生稻Oo92082基因開放閱讀框的特異擴(kuò)增引物。

利用本發(fā)明提供的表達(dá)水平分析引物，通過Real-time PCR分析了藥用野生稻Oo92082基因在未接白葉枯病菌的對照組(0h)和接白葉枯病菌后24h、48h、72h、96h的藥用野生稻葉片中的5個時間點的表達(dá)水平情況，發(fā)現(xiàn)藥用野生稻Oo92082基因在接種白葉枯病菌后表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，而在這5個時間點中，該藥用野生稻Oo92082基因在白葉枯病菌生理小種PXO99(以下簡稱：PXO99)和白葉枯病菌生理小種C5(以下簡稱：C5)脅迫后相對表達(dá)量(RQ值)出現(xiàn)最高峰的均在48h，其中PXO99脅迫后在48h時間點的相對表達(dá)量(RQ值)是對照組的16倍多，C5脅迫后在48h時間點的相對表達(dá)量(RQ值)是對照組的85倍多，說明：在藥用野生稻受到白葉枯病菌的脅迫時，該藥用野生稻Oo92082基因的表達(dá)量逐步增強(qiáng)、表達(dá)水平上調(diào)，在檢測的5個時間點中，在48h相對表達(dá)量達(dá)到最高，因此，該藥用野生稻Oo92082基因?qū)儆谒幱靡吧臼馨兹~枯病誘導(dǎo)表達(dá)的誘導(dǎo)型表達(dá)基因，其介導(dǎo)藥用野生稻白葉枯病免疫反應(yīng)，表明：從藥用野生稻中得到的藥用野生稻Oo92082基因是與抗白葉枯病直接相關(guān)的基因，是新的抗白葉枯病基因。

利用本發(fā)明特異擴(kuò)增引物，通過PCR從白葉枯病菌脅迫的藥用野生稻中擴(kuò)增藥用野生稻Oo92082基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂凝膠電泳檢測，擴(kuò)增到約500多bp的條帶(圖2)，條帶大小與預(yù)期基因條帶大小(512bp)接近。將該基因條帶進(jìn)行膠回收后克隆到pClone007載體上，經(jīng)測序獲得SEQ ID NO:2序列，SEQ ID NO:2序列與轉(zhuǎn)錄測序序列SEQ ID NO:1進(jìn)行同源比對，發(fā)現(xiàn)分離克隆的SEQ ID NO:2序列和SEQ ID NO:1序列一致，表明：通過該特異擴(kuò)增引物可以從藥用野生稻中擴(kuò)增到藥用野生稻Oo92082基因。藥用野生稻Oo92082基因的成功分離克隆及提供的堿基序列信息，為深入研究藥用野生稻Oo92082基因與藥用野生稻抗白葉枯病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)、提供了理論依據(jù)。

附圖說明

圖1是藥用野生稻Oo92082基因在未接種白葉枯病菌的對照組0h和接種白葉枯病菌24h、48h、72h、96h各時間點的藥用野生稻葉片中的相對表達(dá)量。0h：以ddH₂O代替菌液接種處理時間點；24h、48h、72h、96h：分別接種PXO99和C5處理時間點。橫坐標(biāo)表示時間，縱坐標(biāo)表示藥用野生稻Oo92082基因在藥用野生稻葉片中的相對表達(dá)量，圖中黑色長條表示：強(qiáng)致病菌PXO99(菲律賓小種6)接菌處理組，對藥用野生稻致病能力強(qiáng)；斜紋長條表示：強(qiáng)致病菌C5(中國南方稻區(qū)強(qiáng)制病代表菌株)接菌處理組，對藥用野生稻致病能較弱。

圖2是利用藥用野生稻Oo92082基因序列SEQ ID NO:1設(shè)計的特異擴(kuò)增引物從云南藥用野生稻中擴(kuò)增到藥用野生稻Oo92082基因開放閱讀框的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2中M:D2000DNA Marker；泳道1為利用SEQ ID NO:1設(shè)計的特異擴(kuò)增引物擴(kuò)增的藥用野生稻Oo92082基因開放閱讀框基因片段，預(yù)期大小512bp。所述特異擴(kuò)增引物由上游引物和下游引物組成，所述特異擴(kuò)增引物的上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，所述特異擴(kuò)增引物的下游引物序列如SEQ ID NO:6所示。

具體實施方式

實驗材料：藥用野生稻采自中國云南省。

白葉枯病菌生理小種PXO99和C5由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所分子室保存。所述白葉枯病菌生理小種PXO99已在非專利文獻(xiàn)“運用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)改良9311白葉枯病抗性的研究”(周遠(yuǎn)飛等，分子植物育種，2003年，第1卷，第3期，第343-349頁)公開，所述白葉枯病菌生理小種C5已在非專利文獻(xiàn)“西南地區(qū)水稻品種對水稻白葉枯病的抗性分析”(王永吉等，中國農(nóng)學(xué)通報，2011,27(27)：260-264))公開，本申請人保證自本專利申請日起20年內(nèi)向公眾發(fā)放所述白葉枯病菌生理小種PXO99和白葉枯病菌生理小種C5，本申請人聯(lián)系地址：云南省昆明市五華區(qū)學(xué)云路9號，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，郵編：650223。

上述白葉枯病菌生理小種PXO99和白葉枯病菌生理小種C5均是利用其對水稻的侵染能力從而導(dǎo)致水稻葉片形成白葉枯病病斑的共性，因此，具有同樣致病能力的各種白葉枯病菌生理小種都能達(dá)到本發(fā)明的實驗效果。以下實施例的各實驗試劑均為市售。

以下實施例無特殊說明的為常規(guī)方法。

實施例1 藥用野生稻Oo92082基因在藥用野生稻受白葉枯病菌脅迫不同時間點的表達(dá)水平分析

(1)總RNA的提取

藥用野生稻總RNA的提取采用Plant Mini Kit進(jìn)行提取，基因組的去除采用RNase-Free DNase set試劑盒進(jìn)行。所有的RNA提取步驟在室溫中完成，所有的離心步驟在20-25℃的標(biāo)準(zhǔn)小型離心機(jī)上完成，離心溫度不低于20℃，對接種白葉枯病菌的樣品和未接白葉枯病菌的樣品均按以下各步驟操作：

A、以白葉枯病菌生理小種PXO99和C5分別接種同種云南藥用野生稻，接菌處理后每隔24h，即24h、48h、72h、96h收集葉片，同時以ddH₂O代替菌液接種同種藥用野生稻，作為0h的對照。

B、稱取不超過50mg的藥用野生稻植物材料，立刻置于處理過的研缽中，加入液氮進(jìn)行研磨。將粉末快速轉(zhuǎn)移至RNase-free，并經(jīng)過液氮冷卻的2mL離心管，注意材料要保持冷凍狀態(tài)。

C、加入500μL Buffer RLT(1mL Buffer RLT加入10μLβ-巰基乙醇)，渦旋混勻。

D、將溶解物轉(zhuǎn)移到帶有2mL收集管的QIAshredder spin column中，最大轉(zhuǎn)速14000×g離心2min。將收集管中的上清液轉(zhuǎn)移至新的2mL離心管中。

E、加入0.5倍體積的無水乙醇至上清液中，輕輕混勻。

F、將樣品(約650μL)轉(zhuǎn)移至帶有2mL收集管的RNeasy spin column中。輕輕蓋上蓋子，≥8000×g離心15s，倒掉收集管中廢液。

G、加入700μLBuffer RW1到RNeasy spin column中，輕輕蓋上蓋子，≥8000×g離心15s清洗柱子上的濾膜，倒掉廢液。

H、加入500μL Buffer RPE至RNeasy spin column中，輕輕蓋上蓋子，≥8000×g離心15s清洗柱子上的濾膜，倒掉廢液。

I、加入500μL Buffer RPE至RNeasy spin column中，輕輕蓋上蓋子，≥8000×g離心2min清洗柱子上的濾膜，倒掉廢液。

K、將RNeasy spin column置于新的1.5mL離心管中，向spin column的膜上直接加入30～50μL RNase-free水，輕輕蓋上蓋子，≥8000×g離心1min，洗脫RNA。

L、1.0％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA完整性的檢測，正常的RNA樣品通過凝膠電泳可以跑出3條條帶，3條條帶的沉降系數(shù)分別28S、18S及5S，其中28S最亮，5S最弱。用NanoDrop 2000超微量分光光度計對RNA純度進(jìn)行檢測，以O(shè)D260/280和OD260/230兩個比值作為指標(biāo)，當(dāng)OD260/280在1.9～2.1之間，且OD260/230在2.0～2.5之間，則認(rèn)為RNA的純度高。

(2)cDNA第一鏈的合成

cDNA采用PrimeScript^TM RT reagent with gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行，具體操作如下：

A、基因組DNA的去除反應(yīng)。5×gDNA Eraser Buffer、gDNA Eraser、RNase Free dH₂O在室溫下解凍后迅速置于冰上，于250μL PCR管中配制表1所示的去除基因組反應(yīng)體系：

表1 去除基因組反應(yīng)體系

反應(yīng)液配制好后，置于PCR儀中，42℃中孵育2min，然后置于冰上。

B、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。于冰上配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。為保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，進(jìn)行各項反應(yīng)時，按反應(yīng)數(shù)+1的量配制Master Mix，然后再分裝到每個反應(yīng)管中。

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

反轉(zhuǎn)錄混合液配制好后，置于PCR儀中，37℃中反應(yīng)15min，85℃5sec。反應(yīng)完后短暫離心，保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

(3)Real-time PCR體系建立和反應(yīng)程序

A、從前期實驗中獲得的白葉枯病菌脅迫的藥用野生稻轉(zhuǎn)錄組測序后的差異表達(dá)基因分析，獲得一個差異極顯著、編號為Contig_92082的基因，該編號基因經(jīng)注釋到NR、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫，未獲得任何功能注釋；編碼的氨基酸序列經(jīng)BLASTp比對，沒有任何同源性，Contig_92082基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，因此，將這個來源于藥用野生稻轉(zhuǎn)錄組的Contig_92082基因命名為藥用野生稻Oo92082基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

B、根據(jù)獲得的藥用野生稻Oo92082基因的序列SEQ ID NO:1，利用生物軟件Primer5.0設(shè)計表達(dá)水平分析引物，該表達(dá)水平分析引物由上游引物和下游引物組成，所述表達(dá)水平分析引物的上游引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述的表達(dá)水平分析引物的下游引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。該表達(dá)水平分析引物送華大基因公司合成。

C、采用TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RnaseH Plus)進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)體系配制，使用Applied Biosystems QuantStudio 6&7實時熒光定量PCR儀進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)程序。

按表3所示的組份在冰上配制PCR反應(yīng)液：

表3 Real-time PCR反應(yīng)體系

Real-time PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30sec；95℃30sec，60℃34sec，40個循環(huán)；溶解曲線：95℃15sec，60 1min，95℃15sec。

(4)實驗結(jié)果分析

通過Real-time PCR技術(shù)對藥用野生稻Oo92082基因(SEQ ID NO:1)在未接菌處理的對照組和分別接種白葉枯病菌生理小種PXO99和C5的各個時間點(0h、24h、48h、72h、96h)的相對表達(dá)量進(jìn)行分析，其差異表達(dá)水平有兩種情況，一種是藥用野生稻Oo92082基因在接種PXO99和C5的云南藥用野生稻中相對表達(dá)量均比對照組高，這種情況表明藥用野生稻Oo92082基因?qū)儆诎兹~枯病菌誘導(dǎo)型表達(dá)基因，同時通過分析PXO99和C5兩個生理小種對藥用野生稻Oo92082基因誘導(dǎo)表達(dá)量的差異，可以分析藥用野生稻Oo92082基因介導(dǎo)的藥用野生稻白葉枯病免疫反應(yīng)早期的表達(dá)變化趨勢。

結(jié)果分析：藥用野生稻Oo92082基因在未接菌的對照組(0h)和接白葉枯病菌(24h、48h、72h、96h)的藥用野生稻葉片中的5個時間點的相對表達(dá)量表明，該藥用野生稻Oo92082基因在接種白葉枯病菌后表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)(圖1所示)。在這5個時間點中，藥用野生稻Oo92082基因在白葉枯病菌PXO99和C5生理小種脅迫后相對表達(dá)量(RQ值)出現(xiàn)最高峰的均在48h，其中PXO99脅迫后在48h時間點的相對表達(dá)量(RQ值)是對照組的16倍多，C5脅迫后在48h時間點的相對表達(dá)量(RQ值)是對照組的85倍多。說明該藥用野生稻Oo92082基因在藥用野生稻受到白葉枯病菌的脅迫時，該藥用野生稻Oo92082基因的表達(dá)量逐步增強(qiáng)、表達(dá)水平上調(diào)，在檢測的5個時間點中，在48h該基因的相對表達(dá)量達(dá)到最高。根據(jù)該結(jié)果分析，藥用野生稻Oo92082基因在云南藥用野生稻中屬于白葉枯病脅迫表達(dá)的誘導(dǎo)型表達(dá)基因，其介導(dǎo)藥用野生稻白葉枯病早期免疫反應(yīng)。表明從云南藥用野生稻中得到的藥用野生稻Oo92082基因是與抗白葉枯病直接相關(guān)的基因，是新的抗白葉枯病基因。

藥用野生稻Oo92082基因序列SEQ ID NO:1為分析該基因在云南藥用野生稻受白葉枯病菌脅迫后不同時間點的表達(dá)水平提供了序列信息，為發(fā)掘云南藥用野生稻中新的抗病基因提供理論依據(jù)。

實施例2藥用野生稻Oo92082基因的分離克隆

(1)根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組分析獲得的藥用野生稻Oo92082基因序列SEQ ID NO:1，利用生物軟件Primer5.0設(shè)計了藥用野生稻Oo92082基因開放閱讀框的特異擴(kuò)增引物，該藥用野生稻Oo92082基因開放閱讀框的特異擴(kuò)增引物由上游引物和下游引物組成，所述藥用野生稻Oo92082基因開放閱讀框的特異擴(kuò)增引物的上游引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，所述藥用野生稻Oo92082基因開放閱讀框的特異擴(kuò)增引物的下游引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。該藥用野生稻Oo92082基因開放閱讀框的特異擴(kuò)增引物送華大基因公司合成。

(2)以實施例1步驟(2)中的cDNA作為PCR反應(yīng)模板，擴(kuò)增白葉枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)的藥用野生稻Oo92082基因，采用TaKaRa的高保真Max DNA Polymerase進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，按表4所示的組份在冰上配制PCR擴(kuò)增體系：

表4 藥用野生稻Oo92082基因PCR擴(kuò)增體系

PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性2min；98℃10sec，退火5sec，72℃延伸10sec，35個循環(huán)；72℃延伸10min。

(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，將與預(yù)期大小512bp相近大小的電泳條帶(圖2)采用生工生物工程(上海)股份有限公司的SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行回收，具體操作如下：

A.在紫外燈下將與預(yù)期大小512bp相近大小的電泳條帶(圖2)切下，放入1.5mL離心管中，稱重；根據(jù)膠塊的重量和濃度，按每100mg瓊脂糖(如膠不足100mg則用水補充至100mg)加入300～600μL Buffer B2的比例加入Buffer B2；

B.將離心管置于50℃水浴5～10min，期間不斷搖動，直至膠塊完全溶化；

C.向吸附柱中加入500μL Wash solution，室溫，9000×g離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱放入同一個收集管中；重復(fù)此步驟一次；

D.將空吸附柱和收集管放入離心機(jī)9000×g離心1min，其殘存于Wash solution中的乙醇揮發(fā)干；

F.向吸附柱膜中央加入30μL的Elution buffer，室溫放置2min，9000×g離心1min洗脫DNA，洗脫獲得DNA溶液。

(4)藥用野生稻Oo92082基因與pClone007的連接

本實施例2步驟(3)F獲得的DNA溶液經(jīng)SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收后得回收片段，采用TSINAKE的pClone007Blunt Simple Vector Kit將回收片段與pClone007載體進(jìn)行連接。按表5所示組份在冰上配制連接體系：

表5 藥用野生稻Oo92082基因與pClone007的連接體系

混勻后，短暫離心，置于室溫5min。

(5)將步驟(4)連接產(chǎn)物的通過熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，具體操作如下：

A.將步驟(4)10μL連接產(chǎn)物全部加入到100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用槍頭輕輕混勻后冰上放置30min；同時以1μL無菌水加入到100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中作為陰性對照；

B.42℃水浴中熱擊60sec。熱擊后立即置于冰上冷2～3min(禁止搖動)；

C.向每管中加入700μL LB液體培養(yǎng)基(不含任何抗生素)，混勻后37℃180rpm震蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因；

D.室溫，4000rpm離心5min，棄去600μL上清液，用槍頭輕輕懸均菌液，取100μL菌液涂布于含有50mg/L Amp抗生素的LB平板上；

F.37℃倒置暗培養(yǎng)過夜，直至長出菌落。

(6)藥用野生稻Oo92082基因與pClone007載體重組子的篩選

A.從上述步驟(5)長有菌落的平板上挑取單菌落，接種50mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩培養(yǎng)12-16h；

B.取1μL菌液進(jìn)行PCR檢測，確定是否是藥用野生稻Oo92082基因與pClone007載體的重組子，PCR反應(yīng)體系與PCR反應(yīng)程序按實施例2步驟(2)；

C.經(jīng)PCR檢測，將所述回收片段與pClone007載體的重組子送深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測序，該回收片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；將回收片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2與轉(zhuǎn)錄組測序序列SEQ ID NO:1進(jìn)行比對分析。

(7)結(jié)果分析：利用本發(fā)明特異擴(kuò)增引物從白葉枯病菌脅迫的云南藥用野生稻中分離克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的回收片段，可能存在3種情況：一是擴(kuò)增到預(yù)期基因條帶大小512bp，二是擴(kuò)增到基因條帶，但基因條帶大小與預(yù)期大小(512bp)不同，三是擴(kuò)增不到基因條帶。將擴(kuò)增到的基因條帶經(jīng)膠回收后克隆到pClone007載體上，測序后與轉(zhuǎn)錄組測序序列SEQ ID NO:1進(jìn)行比對分析，確認(rèn)序列正確性。

結(jié)果分析：利用本發(fā)明特異擴(kuò)增引物，通過PCR從白葉枯病菌脅迫的藥用野生稻中擴(kuò)增到的DNA片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂凝膠電泳檢測，擴(kuò)增到約500多bp的條帶(圖2泳道1)，條帶大小與預(yù)期基因條帶大小(512bp)接近。將該基因條帶進(jìn)行膠回收后克隆到pClone007載體上，經(jīng)測序獲得SEQ ID NO:2序列，SEQ ID NO:2序列與轉(zhuǎn)錄測序序列SEQ ID NO:1進(jìn)行同源比對，發(fā)現(xiàn)分離克隆的SEQ ID NO:2序列和SEQ ID NO:1序列一致，SEQ ID NO:2所示序列是SEQ ID NO:1所示序列的開放閱讀框的序列，即用本發(fā)明特異擴(kuò)增引物擴(kuò)增到的DNA片段實際是藥用野生稻Oo92082基因，表明：通過本發(fā)明特異引物可以從藥用野生稻中擴(kuò)增到其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的藥用野生稻Oo92082基因。藥用野生稻Oo92082基因的成功分離克隆，為后續(xù)該基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

藥用野生稻Oo92082基因的SEQ ID NO:1所示序列為分析該基因在藥用野生稻受白葉枯病菌脅迫后不同時間點的表達(dá)水平及從中分離克隆該基因提供了序列信息，為發(fā)掘云南藥用野生稻中新的抗病基因提供理論依據(jù)。

上文中已經(jīng)用一般性說明及其具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

<110> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所

<120> 白葉枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)的藥用野生稻Oo92082基因及其特異擴(kuò)增引物

<130> /

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 708

<212> DNA

<213> 藥用野生稻（Oryza officinalis Wall.）

<220>

<221> 起始密碼子

<222> (42)..(44)

<220>

<221> 開放閱讀框

<222> (42)..(293)

<220>

<221> 終止密碼子

<222> (291)..(293)

<400> 1

tttttttttt gacatgttat caatgcattt atatttgaca tatgatgtat ccttacaaaa 60

atggcaatgg taagaaaaaa ttacattacc aagaagacta ttcaacgata atagtgatcc 120

atgatactct tataagcaag tggtattaca agtgccccgt taatcttcag gtttccaaca 180

taaattcagg taacccgatt acagatcttg tttcccaaac taaaatcgga aacaggcacg 240

cacaaactta cgcaaagaaa aaaagaaaac caaacaaaca tactagtacg tgattatctc 300

gttgtcaagg cctcctttga aactgaggaa ttttgtgaga atctttccaa aactaaattc 360

tctcaaaatt cctgcatttc aaagaagatt tcgcccatct ctcttctacc ccaggaatgc 420

gaagaagatc gcgcatccca gcagccacat ggcatggtaa aaccccatga tggccagcac 480

gtgagagttc atcaccggcg cggtggagct caggatgagg atcccgccgg cggcgtacag 540

catcaggagc acgccggaag gtcgtcgccg gccgccgccg ccgccgactc gcgctcctgc 600

aggctccatc ctgtggtagc tagtacacct gccggccacc tagtgctggg atgaagtgat 660

gaggttttct ctgattagtt gatcagcaca gggtgagtag tccgcccc 708

<210> 2

<211> 512

<212> DNA

<213> 藥用野生稻（Oryza officinalis Wall.）

<220>

<221> 起始密碼子

<222> (1)..(3)

<220>

<221> 開放閱讀框

<222> (1)..(252)

<220>

<221> 終止密碼子

<222> (250)..(252)

<400> 2

atgatgtatc cttacaaaaa tggcaatggt aagaaaaaat tacattacca agaagactat 60

tcaacgataa tagtgatcca tgatactctt ataagcaagt ggtattacaa gtgccccgtt 120

aatcttcagg tttccaacat aaattcaggt aacccgatta cagatcttgt ttcccaaact 180

aaaatcggaa acaggcacgc acaaacttac gcaaagaaaa aaagaaaacc aaacaaacat 240

actagtacgt gattatctcg ttgtcaaggc ctcctttgaa actgaggaat tttgtgagaa 300

tctttccaaa actaaattct ctcaaaattc ctgcatttca aagaagattt cgcccatctc 360

tcttctaccc caggaatgcg aagaagatcg cgcatcccag cagccacatg gcatggtaaa 420

accccatgat ggccagcacg tgagagttca tcaccggcgc ggtggagctc aggatgagga 480

tcccgccggc ggcgtacagc atcaggagca cg 512

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 藥用野生稻（Oryza officinalis Wall.）

<400> 3

gtatccttac aaaaatggca atggt 25

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 藥用野生稻（Oryza officinalis Wall.）

<400> 4

gcgtgcctgt ttccgattt 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 藥用野生稻（Oryza officinalis Wall.）

<400> 5

atgatgtatc cttacaaa 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 藥用野生稻（Oryza officinalis Wall.）

<400> 6

cgtgctcctg atgctgt 17

<210> 7

<211> 83

<212> PRT

<213> 藥用野生稻（Oryza officinalis Wall.）

<400> 7

Met Met Tyr Pro Tyr Lys Asn Gly Asn Gly Lys Lys Lys Leu His Tyr

1 5 10 15

Gln Glu Asp Tyr Ser Thr Ile Ile Val Ile His Asp Thr Leu Ile Ser

20 25 30

Lys Trp Tyr Tyr Lys Cys Pro Val Asn Leu Gln Val Ser Asn Ile Asn

35 40 45

Ser Gly Asn Pro Ile Thr Asp Leu Val Ser Gln Thr Lys Ile Gly Asn

50 55 60

Arg His Ala Gln Thr Tyr Ala Lys Lys Lys Arg Lys Pro Asn Lys His

65 70 75 80

Thr Ser Thr