本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，具體地說，涉及一種評價破骨細胞骨吸收功能的方法及其應用。

背景技術(shù)：

骨質(zhì)疏松是目前老齡化社會的常見病和多發(fā)病。骨質(zhì)在新陳代謝的過程中不斷的通過合成和降解進行重建，該過程由成骨細胞和破骨細胞共同作用來完成。破骨細胞在骨質(zhì)代謝過程中具有十分重要的作用，其功能的過度激活在骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展上有著較為直接的作用。破骨細胞的體外實驗在骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制和治療方式的研究中有著極為重要的作用。其中，對破骨細胞溶骨活性的評價，經(jīng)常作為各種干預因素處理后的觀察指標，在此類研究中有著不可或缺的作用。

在既往的研究中，對破骨細胞功能的評價主要集中在三個方面。第一，通過檢測破骨細胞溶骨后的代謝產(chǎn)物，如NTX-I、CTX-I和ICTP；第二，通過檢測破骨細胞內(nèi)特異性酶的含量和活性，如TRAP染色和組織蛋白酶K活性的檢測；第三，通過將破骨細胞與骨片進行共培養(yǎng)，使用顯微鏡觀察骨片上破骨細胞吸收陷窩的個數(shù)、面積以及深度，來評價破骨細胞的功能。

以上方法中，第一、二種方法是對破骨細胞功能的間接反映，可通過該指標推測破骨細胞的功能，但影響結(jié)果的因素較多，準確性相對較差。第三種方法可以直接的反映破骨細胞的溶骨功能，并可以通過對吸收陷窩的個數(shù)、面積以及深度差異的分析，比較溶骨功能的強弱，是目前使用較為廣泛，結(jié)果也較為準確的方法，但該方法在使用的過程中存在較大的限制。第一，骨片的制備。骨片制備的困難是限制該方法使用的重要原因。以使用牛骨制備骨片為例，首先需將牛股骨洗凈，刮除表面肌腱、韌帶和內(nèi)面的骨髓，將骨皮質(zhì)縱行切開，用骨皮質(zhì)制成一條圓柱形骨棒。然后使用重型切片機，將骨棒切成100μm左右的骨薄片并用剪刀將其剪切到目的大小，最后將骨薄片磨成10～50μm后置于75％酒精或者雙抗中備用。其中，骨片的打磨過程困難，成功率較為有限，使骨片的大量制備可行性不高。同時，國內(nèi)重型切片機的缺乏也是一個重要的限制。此外，受骨皮質(zhì)厚度的限制，骨棒的直徑一般為10mm左右，因此只適用于48孔或者96孔細胞培養(yǎng)板。第二，骨片的使用。骨片在使用過程中，首先遇到的問題是無法承受高溫滅菌，只能通過酒精或著雙抗浸泡和紫外線照射的方法滅菌，培養(yǎng)時污染的可能性相對增加。其次，由于破骨細胞有著趨于遠離骨片的特性，使得其不易附著于骨片表面，而常常聚集在骨片周圍和骨片下。又由于人工剪切骨片的水平有限，并不能使骨片和培養(yǎng)孔的大小十分一致。因此，種植在骨片上的細胞數(shù)量，很大程度上取決于滴加細胞時的位置和液體流速，而骨片的不透明又限制了對細胞的計數(shù)。第三，結(jié)果的分析。由于骨片上細胞數(shù)的不一致，使得用于功能比較時，基線的可比性大大降低。而骨片上細胞分布的不一致，使得在觀察結(jié)果時，很大程度上取決于視野的選取。

基于以上原因，目前為止，沒有一種較好的方法可以檢測破骨細胞的溶骨活性，極大限制了對影響破骨細胞功能因素的研究。因此，本領域亟需開發(fā)一種簡單易行并且準確性較高的實驗方法，以評價破骨細胞的溶骨活性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種評價破骨細胞骨吸收功能的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種評價破骨細胞骨吸收功能的方法，所述的方法是將長徑小于30μm的骨粉固定于細胞培養(yǎng)板的底面，通過對培養(yǎng)前后定點照片的光密度分析，比較培養(yǎng)前后細胞培養(yǎng)板的透光度，從而反映細胞培養(yǎng)板內(nèi)骨粉被吸收的程度，以評價破骨細胞的骨吸收功能。

優(yōu)選地，所述的方法包括以下步驟：

a)制板：將長徑小于30μm的骨粉進行滅菌，加入酒精溶液制成骨粉混懸液，充分混勻后滴加至細胞培養(yǎng)板的孔中，然后將加好的細胞培養(yǎng)板晾干，再向孔內(nèi)加入丙酮，所述丙酮的加入量與孔底面積的比例為(10-30)μl:1.75cm²，滴入丙酮后迅速翻轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)板，1-10min之內(nèi)在孔底做標記，待孔底完全凝固后用蒸餾水沖洗，將未固定在孔底的骨粉沖洗干凈，晾干；

b)培養(yǎng)前拍照：用顯微鏡于標記位置拍照，同時選取一個不做任何處理的孔作為校正孔進行拍照，以用于校正培養(yǎng)后拍照時因顯微鏡參數(shù)不一致而產(chǎn)生的誤差；

c)細胞的接種和培養(yǎng)：在上述細胞培養(yǎng)板內(nèi)進行細胞的培養(yǎng)，接種濃度為(0.5-1.5)*10⁵個/ml，培養(yǎng)時間為8-14d。

d)培養(yǎng)后拍照：培養(yǎng)結(jié)束后除去細胞及殘留核酸，待細胞培養(yǎng)板晾干后再次對標記位置和校正孔進行拍照；

e)照片對比：對培養(yǎng)前后兩次照片進行光密度分析，比較細胞培養(yǎng)前后細胞培養(yǎng)板的透光度，從而反映細胞培養(yǎng)板的孔內(nèi)骨粉被吸收的程度。

優(yōu)選地，所述丙酮的加入量與孔底面積的比例為10μl:1.75cm²。

優(yōu)選地，步驟d)中，除去細胞的方法是采用EDTA配制的0.25％胰酶消化10-20min，再使用強RIPA裂解10-20min；或直接使用強RIPA裂解15-30min。

優(yōu)選地，步驟d)中，除去殘留核酸的方法是先采用0.5-5mol/L的NaCl溶液清洗，再使用蒸餾水清洗。

優(yōu)選地，所述的骨粉由牛股骨皮質(zhì)制成。但不僅限于此，其它動物股骨，或使用長骨均可。

優(yōu)選地，所述酒精溶液的體積濃度為70％-90％，所述骨粉混懸液的濃度在2.5mg/ml以上。

優(yōu)選地，步驟a)中，是使用微量移液器的槍頭在孔底做標記。但不僅限于此，只要使用細小較硬頭端的無菌物品都可以完成。

優(yōu)選地，步驟b)中，是在10×光鏡下拍照。次之，在4×或者20×也是可行的。

優(yōu)選地，步驟e)中，所述的光密度分析具體是使用軟件分析培養(yǎng)前后兩次照片的總光密度值，除以整張照片的面積，算出平均光密度值，再利用校正孔前后平均光密度的差值的均值，校正培養(yǎng)后拍照所有照片的平均光密度值，校正后的培養(yǎng)后照片的平均光密度值與培養(yǎng)前照片的平均光密度值的差值即反映培養(yǎng)板上骨粉減少的量。

本文中，所述的細胞培養(yǎng)板可以是96孔、48孔、24孔、12孔或6孔，但不僅限于此，也可以是任何適于細胞培養(yǎng)和透光度觀察的培養(yǎng)裝置。

本發(fā)明的有益效果是提供了一種新的反映破骨細胞溶骨功能的實驗方法，具體地，本發(fā)明的方法具備以下優(yōu)點：

1、更加簡便，骨粉板制備十分方便，一般實驗室即可完成，并且可以大量生產(chǎn)；

2、克服了破骨細胞選擇性吸附的問題；

3、通過使用定點標記拍照的方式，避免了因視野選取不同而造成的結(jié)果偏倚，使結(jié)果更加穩(wěn)定、可靠；

4、通過使用光密度分析的方法，反映培養(yǎng)板孔底透光度的變化，從而評價骨粉的厚度變化，具備很好的可操作性和較高的靈敏度。

本發(fā)明的方法在破骨細胞溶骨活性檢測相關(guān)的研究中具有重要的應用價值。

附圖說明

圖1.用于制作骨粉的機器。由一個低速電機帶動金剛砂輪轉(zhuǎn)動，另一邊使用金屬圓筒固定骨棒，并用橡皮筋和一根木棒將骨棒壓在砂輪上。

圖2.制作完成的24孔細胞培養(yǎng)板。細胞培養(yǎng)板的上面3排可用于細胞培養(yǎng)和分組比較。第4排第1孔作為校正孔，其余的未加入骨粉，可用于細胞誘導情況的觀察，因加入骨粉后觀察細胞困難?？椎卓梢钥吹接糜诙c拍照的標記。

圖3.實驗前(A)與實驗后(B)兩次，通過定點拍攝的照片(10×)。仔細觀察可以看到，兩次照片相似度很高，在拍攝的位置上是一致的。

圖4.破骨細胞的TRAP染色(10×)。對實驗中誘導的RAW264.7細胞進行TRAP染色，驗證破骨細胞的誘導成功。染色陽性的細胞，胞漿內(nèi)可見紅色或紫紅色顆粒。

圖5.圖中，A：不同RANKL濃度組的前后光密度變化差異。B：RANKL說明書中，不同濃度重組小鼠RANKL(貨號#462-TEC)誘導小鼠單核/巨噬系RAW264.7細胞分化成破骨細胞的成功率，通常來說，這個作用的半數(shù)有效量在0.5-2ng/ml。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。

本發(fā)明的技術(shù)方案總體思路是將長徑小于30μm的骨粉固定于細胞培養(yǎng)板的底面，通過對培養(yǎng)前后定點照片的光密度分析，比較前后細胞培養(yǎng)板的透光度，從而反映細胞培養(yǎng)板內(nèi)骨粉被吸收的程度。

實施例1本發(fā)明的評價破骨細胞骨吸收功能的方法(一)

一、方法

1)使用低速電機(3r/min)帶動金剛砂輪，將牛股骨皮質(zhì)磨成粉狀，保存于75％酒精中。具體使用如圖1所示的機器磨粉，也可以使用現(xiàn)有技術(shù)中其他的磨粉機。

2)用30μm細胞篩將小于30μm的骨粉篩選出來，離心，倒去酒精，70℃干燥后稱取一定量的骨粉于抗壓瓶中，加入少量蒸餾水后進行高壓蒸汽滅菌。滅菌后加入75％酒精制成2.5mg/ml的混懸液。

3)將該骨粉混懸液置于超聲清洗儀內(nèi)混勻1min后，在超凈臺內(nèi)將其滴加到24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1ml，每次滴加前再次吹吸幾次，使其混勻。將加好的培養(yǎng)板置于超凈臺內(nèi)晾干。保證該骨粉量遠高于之后丙酮可固定的量。

4)在干燥后的每孔內(nèi)加入10μl丙酮，即所述丙酮的加入量與孔底面積的比例為10μl:1.75cm²。滴入丙酮后迅速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，以便丙酮在揮發(fā)前均勻分布于板底。1-10min之內(nèi)使用100μl槍頭在培養(yǎng)板底部做5個點狀標記，待孔底完全凝固后用蒸餾水沖洗3次，將未固定在孔底的骨粉沖洗干凈，晾干。

5)依據(jù)標記的點按順序在10×光鏡下進行拍照，并記錄拍照時的顯微鏡各項參數(shù)，如光圈大小、濾光鏡的使用、光源強弱、曝光時間長短等。需選取一個不做任何處理的孔作為校正孔進行拍照，以用于校正下次拍照時因顯微鏡參數(shù)不一致而產(chǎn)生的誤差。

具體地，取如圖2制作完成的24孔骨粉板1塊，用顯微鏡在10×光鏡下于標記位置拍照，每孔5張照片。

6)在培養(yǎng)板內(nèi)進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后用胰酶消化、RIPA裂解細胞以除去細胞，然后用2mol/L的NaCl溶液洗凈殘留核酸，最后用蒸餾水清洗干凈。待晾干后再次依據(jù)標記的點在同一位置，按同樣的順序進行拍照，并再次對校正孔進行拍照。

在該實施例中，每孔內(nèi)加入3ml PBS，過夜，次日再用PBS沖洗一次并吸凈。將生長狀態(tài)良好的RAW264.7細胞以1*10⁵個/ml的濃度接種到除校正孔外的23個孔內(nèi)，每孔1ml。6小時后更換培養(yǎng)基，以每縱列分組，第1列3孔更換無RANKL培養(yǎng)液，第2列4孔加入含0.5ng/ml RANKL培養(yǎng)液，第3列4孔加入含1ng/ml RANKL培養(yǎng)液，第4列4孔加入含2ng/ml RANKL培養(yǎng)液，第5列4孔加入含4ng/ml RANKL培養(yǎng)液，第6列4孔加入含8ng/ml RANKL培養(yǎng)液。以上培養(yǎng)液均為含10％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液。培養(yǎng)板置于37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)。于培養(yǎng)的第3、5、6、7、8、9、10、11天更換相應濃度RANKL的培養(yǎng)液。第12天采用EDTA配制的0.25％胰酶消化15min，再使用強RIPA裂解15min除去骨粉板中細胞，用2mol/L的NaCl溶液洗凈殘留核酸，最后用蒸餾水清洗干凈，晾干后在標記位置再次拍照。未加骨粉孔中細胞進行TRAP染色。

7)利用軟件Image Pro Plus分析前后兩次照片的總光密度值(H：0～255、S：0～255、I：0～255)，除以整張照片的面積，算出平均光密度值。利用校正孔前后平均光密度的差值的均值，校正第二次拍照所有照片的平均光密度值。校正后的第二次照片的平均光密度值與第一次照片的平均光密度值的差值即可反映培養(yǎng)板上骨粉減少的量。骨粉減少的越多，培養(yǎng)板的孔底越透亮，相應的光密度的值也越高。

針對由不同濃度RANKL培養(yǎng)液培養(yǎng)的骨粉孔，將校正后的第二次照片與第一次照片的平均光密度值的差值進行方差分析，并采用最小顯著性差異法(LSD)進行兩兩比較，分析各組間的差異。

二、結(jié)果

1.TRAP染色結(jié)果顯示0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml和8ng/ml RANKL組均有染色陽性的破骨細胞。破骨細胞數(shù)量在0.5ng/ml RANKL組中較少，1ng/ml RANKL組中稍多，2ng/ml、4ng/ml和8ng/ml RANKL組中較多。

2.光密度差值的分析結(jié)果(圖5中A)顯示，針對各組別的破骨細胞骨吸收功能，無RANKL組與0.5、1ng/ml RANKL組相比無明顯差異(P＝0.736、P＝0.078)，無RANKL組與2、4、8ng/ml RANKL組相比差異明顯(P<0.001、P<0.001、P<0.001)，0.5ng/ml RANKL組與1ng/ml RANKL組相比無明顯差異(P＝0.152)，0.5ng/ml RANKL組與2、4、8ng/ml RANKL組相比差異明顯(P<0.001、P<0.001、P<0.001)，1ng/ml RANKL組與2、4、8ng/ml RANKL組相比差異明顯(P<0.05、P<0.05、P<0.05)，2ng/ml RANKL組與4、8ng/ml RANKL組相比無明顯差異(P＝0.717、P＝0.576)，4ng/ml RANKL組與8ng/ml RANKL組相比無明顯差異(P＝0.844)。

以上結(jié)果表明，該方法可以檢測出0.5ng/ml與2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml RANKL誘導RAW264.7細胞形成的破骨細胞的溶骨活性差異。2ng/ml、4ng/ml與8ng/ml的RANKL之間誘導的差異不明顯，其原因可能與2ng/ml以上的RANKL誘導RAW264.7細胞分化為破骨細胞的分化率差異不大有關(guān)。

實施例2本發(fā)明的評價破骨細胞骨吸收功能的方法(二)

1)使用低速電機(3r/min)帶動金剛砂輪，將牛股骨皮質(zhì)磨成粉狀，保存于75％酒精中。具體使用如圖1所示的機器磨粉，也可以使用現(xiàn)有技術(shù)中其他的磨粉機。

2)用20μm細胞篩將小于20μm的骨粉篩選出來，離心，倒去酒精，70℃干燥后稱取一定量的骨粉于抗壓瓶中，加入少量蒸餾水后進行高壓蒸汽滅菌。滅菌后加入90％酒精制成4mg/ml的混懸液。

3)將該骨粉混懸液置于超聲清洗儀內(nèi)混勻1min后，在超凈臺內(nèi)將其滴加到24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1ml，每次滴加前再次吹吸幾次，使其混勻。將加好的培養(yǎng)板置于超凈臺內(nèi)晾干。保證該骨粉量遠高于之后丙酮可固定的量。

4)在干燥后的每孔內(nèi)加入15μl丙酮，即所述丙酮的加入量與孔底面積的比例為15μl:1.75cm²。滴入丙酮后迅速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，以便丙酮在揮發(fā)前均勻分布于板底。1-10min之內(nèi)使用100μl槍頭在培養(yǎng)板底部做5個點狀標記，待孔底完全凝固后用蒸餾水沖洗3次，將未固定在孔底的骨粉沖洗干凈，晾干。

5)依據(jù)標記的點按順序在10×光鏡下進行拍照，并記錄拍照時的顯微鏡各項參數(shù)，如光圈大小、濾光鏡的使用、光源強弱、曝光時間長短等。需選取一個不做任何處理的孔作為校正孔進行拍照，以用于校正下次拍照時因顯微鏡參數(shù)不一致而產(chǎn)生的誤差。

6)在培養(yǎng)板內(nèi)進行細胞培養(yǎng)，接種濃度為0.5*10⁵個/ml，培養(yǎng)時間為14d，培養(yǎng)結(jié)束后用EDTA配制的0.25％胰酶消化10min，再使用強RIPA裂解20min除去骨粉板中細胞，然后用0.5mol/L的NaCl溶液洗凈殘留核酸，最后用蒸餾水清洗干凈。待晾干后再次依據(jù)標記的點在同一位置，按同樣的順序進行拍照，并再次對校正孔進行拍照。

7)利用軟件Image Pro Plus分析前后兩次照片的總光密度值(H：0～255、S：0～255、I：0～255)，除以整張照片的面積，算出平均光密度值。利用校正孔前后平均光密度的差值的均值，校正第二次拍照所有照片的平均光密度值。校正后的第二次照片的平均光密度值與第一次照片的平均光密度值的差值即可反映培養(yǎng)板上骨粉減少的量。骨粉減少的越多，培養(yǎng)板的孔底越透亮，相應的光密度的值也越高。

使用本實施例的方法也可以檢測出0.5ng/ml與2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml RANKL誘導RAW264.7細胞形成的破骨細胞的溶骨活性差異。

實施例3本發(fā)明的評價破骨細胞骨吸收功能的方法(三)

1)使用低速電機(3r/min)帶動金剛砂輪，將牛股骨皮質(zhì)磨成粉狀，保存于75％酒精中。具體使用如圖1所示的機器磨粉，也可以使用現(xiàn)有技術(shù)中其他的磨粉機。

2)用30μm細胞篩將小于30μm的骨粉篩選出來，離心，倒去酒精，70℃干燥后稱取一定量的骨粉于抗壓瓶中，加入少量蒸餾水后進行高壓蒸汽滅菌。滅菌后加入70％酒精制成5mg/ml的混懸液。

3)將該骨粉混懸液置于超聲清洗儀內(nèi)混勻1min后，在超凈臺內(nèi)將其滴加到24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1ml，每次滴加前再次吹吸幾次，使其混勻。將加好的培養(yǎng)板置于超凈臺內(nèi)晾干。保證該骨粉量遠高于之后丙酮可固定的量。

4)在干燥后的每孔內(nèi)加入20μl丙酮，即所述丙酮的加入量與孔底面積的比例為20μl:1.75cm²。滴入丙酮后迅速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，以便丙酮在揮發(fā)前均勻分布于板底。1-10min之內(nèi)使用100μl槍頭在培養(yǎng)板底部做5個點狀標記，待孔底完全凝固后用蒸餾水沖洗3次，將未固定在孔底的骨粉沖洗干凈，晾干。

5)依據(jù)標記的點按順序在10×光鏡下進行拍照，并記錄拍照時的顯微鏡各項參數(shù)，如光圈大小、濾光鏡的使用、光源強弱、曝光時間長短等。需選取一個不做任何處理的孔作為校正孔進行拍照，以用于校正下次拍照時因顯微鏡參數(shù)不一致而產(chǎn)生的誤差。

6)在培養(yǎng)板內(nèi)進行細胞培養(yǎng)，接種濃度為1.5*10⁵個/ml，培養(yǎng)時間為8d，培養(yǎng)結(jié)束后用強RIPA裂解30min除去骨粉板中細胞，然后用5mol/L的NaCl溶液洗凈殘留核酸，最后用蒸餾水清洗干凈。待晾干后再次依據(jù)標記的點在同一位置，按同樣的順序進行拍照，并再次對校正孔進行拍照。

7)利用軟件Image Pro Plus分析前后兩次照片的總光密度值(H：0～255、S：0～255、I：0～255)，除以整張照片的面積，算出平均光密度值。利用校正孔前后平均光密度的差值的均值，校正第二次拍照所有照片的平均光密度值。校正后的第二次照片的平均光密度值與第一次照片的平均光密度值的差值即可反映培養(yǎng)板上骨粉減少的量。骨粉減少的越多，培養(yǎng)板的孔底越透亮，相應的光密度的值也越高。

使用本實施例的方法也可以檢測出0.5ng/ml與2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml RANKL誘導RAW264.7細胞形成的破骨細胞的溶骨活性差異。

對比例1

1)使用低速電機(3r/min)帶動金剛砂輪，將牛股骨皮質(zhì)磨成粉狀，保存于75％酒精中。具體使用如圖1所示的機器磨粉，也可以使用現(xiàn)有技術(shù)中其他的磨粉機。

2)用50μm細胞篩將小于50μm的骨粉篩選出來，離心，倒去酒精，70℃干燥后稱取一定量的骨粉于抗壓瓶中，加入少量蒸餾水后進行高壓蒸汽滅菌。滅菌后加入75％酒精制成2.5mg/ml的混懸液。

3)將該骨粉混懸液置于超聲清洗儀內(nèi)混勻1min后，在超凈臺內(nèi)將其滴加到24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1ml，每次滴加前再次吹吸幾次，使其混勻。將加好的培養(yǎng)板置于超凈臺內(nèi)晾干。保證該骨粉量遠高于之后丙酮可固定的量。

4)在干燥后的每孔內(nèi)加入10μl丙酮，即所述丙酮的加入量與孔底面積的比例為10μl:1.75cm²。滴入丙酮后迅速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，以便丙酮在揮發(fā)前均勻分布于板底。1-10min之內(nèi)使用100μl槍頭在培養(yǎng)板底部做5個點狀標記，待孔底完全凝固后用蒸餾水沖洗3次，將未固定在孔底的骨粉沖洗干凈，晾干。

5)依據(jù)標記的點按順序在10×光鏡下進行拍照，并記錄拍照時的顯微鏡各項參數(shù)，如光圈大小、濾光鏡的使用、光源強弱、曝光時間長短等。需選取一個不做任何處理的孔作為校正孔進行拍照，以用于校正下次拍照時因顯微鏡參數(shù)不一致而產(chǎn)生的誤差。

6)在培養(yǎng)板內(nèi)進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后用EDTA配制的0.25％胰酶消化15min，再使用強RIPA裂解15min以除去細胞，然后用2mol/L的NaCl溶液洗凈殘留核酸，最后用蒸餾水清洗干凈。待晾干后再次依據(jù)標記的點在同一位置，按同樣的順序進行拍照，并再次對校正孔進行拍照。

7)利用軟件Image Pro Plus分析前后兩次照片的總光密度值(H：0～255、S：0～255、I：0～255)，除以整張照片的面積，算出平均光密度值。利用校正孔前后平均光密度的差值的均值，校正第二次拍照所有照片的平均光密度值。校正后的第二次照片的平均光密度值與第一次照片的平均光密度值的差值即可反映培養(yǎng)板上骨粉減少的量。骨粉減少的越多，培養(yǎng)板的孔底越透亮，相應的光密度的值也越高。

使用該方法未能檢測出0.5ng/ml與2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml RANKL誘導RAW264.7細胞形成的破骨細胞的溶骨活性差異。

對比例2

1)使用低速電機(3r/min)帶動金剛砂輪，將牛股骨皮質(zhì)磨成粉狀，保存于75％酒精中。具體使用如圖1所示的機器磨粉，也可以使用現(xiàn)有技術(shù)中其他的磨粉機。

2)用30μm細胞篩將小于30μm的骨粉篩選出來，離心，倒去酒精，70℃干燥后稱取一定量的骨粉于抗壓瓶中，加入少量蒸餾水后進行高壓蒸汽滅菌。滅菌后加入75％酒精制成1mg/ml的混懸液。

3)將該骨粉混懸液置于超聲清洗儀內(nèi)混勻1min后，在超凈臺內(nèi)將其滴加到24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1ml，每次滴加前再次吹吸幾次，使其混勻。將加好的培養(yǎng)板置于超凈臺內(nèi)晾干。保證該骨粉量遠高于之后丙酮可固定的量。

4)在干燥后的每孔內(nèi)加入10μl丙酮，即所述丙酮的加入量與孔底面積的比例為10μl:1.75cm²。滴入丙酮后迅速翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，以便丙酮在揮發(fā)前均勻分布于板底。1-10min之內(nèi)使用100μl槍頭在培養(yǎng)板底部做5個點狀標記，待孔底完全凝固后用蒸餾水沖洗3次，將未固定在孔底的骨粉沖洗干凈，晾干。

5)依據(jù)標記的點按順序在10×光鏡下進行拍照，并記錄拍照時的顯微鏡各項參數(shù)，如光圈大小、濾光鏡的使用、光源強弱、曝光時間長短等。需選取一個不做任何處理的孔作為校正孔進行拍照，以用于校正下次拍照時因顯微鏡參數(shù)不一致而產(chǎn)生的誤差。

6)在培養(yǎng)板內(nèi)進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后用EDTA配制的0.25％胰酶消化15min，再使用強RIPA裂解15min以除去細胞，然后用2mol/L的NaCl溶液洗凈殘留核酸，最后用蒸餾水清洗干凈。待晾干后再次依據(jù)標記的點在同一位置，按同樣的順序進行拍照，并再次對校正孔進行拍照。

7)利用軟件Image Pro Plus分析前后兩次照片的總光密度值(H：0～255、S：0～255、I：0～255)，除以整張照片的面積，算出平均光密度值。利用校正孔前后平均光密度的差值的均值，校正第二次拍照所有照片的平均光密度值。校正后的第二次照片的平均光密度值與第一次照片的平均光密度值的差值即可反映培養(yǎng)板上骨粉減少的量。骨粉減少的越多，培養(yǎng)板的孔底越透亮，相應的光密度的值也越高。

使用該方法未能檢測出0.5ng/ml與2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml RANKL誘導RAW264.7細胞形成的破骨細胞的溶骨活性差異。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發(fā)明的保護范圍。