本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種水稻MIR528基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在自然界，由于植物的不動(dòng)性，其比動(dòng)物更易遭受外界逆境因子脅迫。但是，植物可通過(guò)調(diào)節(jié)其基因組中不同類(lèi)型基因的有序時(shí)空表達(dá)進(jìn)而觸發(fā)或啟動(dòng)其自身防御反應(yīng)機(jī)制以應(yīng)對(duì)各種脅迫。大量研究已證明，植物基因表達(dá)調(diào)控中，啟動(dòng)子具有中心地位，它決定著基因轉(zhuǎn)錄的方向和效率。

miRNA是生物體內(nèi)源產(chǎn)生的一類(lèi)長(zhǎng)度約20-24bp的非編碼小RNA，其通過(guò)序列互補(bǔ)配對(duì)方式在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控靶基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，一種miRNA往往可調(diào)控多個(gè)靶基因表達(dá)，因而在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及應(yīng)答外界逆境脅迫等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。目前，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等手段揭示miRNA生物學(xué)功能的研究取得一定進(jìn)展，然而有關(guān)植物miRNA上游表達(dá)調(diào)控機(jī)制方面的報(bào)道鮮見(jiàn)。我們知道，miRNA盡管不編碼蛋白質(zhì)，但它與蛋白編碼基因一樣具有自身的啟動(dòng)子；其啟動(dòng)子上順式作用元件的類(lèi)型和數(shù)量決定著它的時(shí)空表達(dá)模式。因此，miRNA基因啟動(dòng)子的克隆和功能解析，對(duì)于深入探究植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程、植物與環(huán)境互作機(jī)制以及轉(zhuǎn)基因利用等具有重要理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。

砷是重要的環(huán)境污染物及人類(lèi)I級(jí)致癌物。水稻是重要的糧食作物。但與小麥和玉米等旱糧作物相比，水稻可高效從土壤中吸收、轉(zhuǎn)移與積累砷。因此，提高水稻對(duì)砷的耐受性、減少對(duì)砷的吸收是解決水稻砷污染的有效途徑。我們發(fā)現(xiàn)，在耐砷水稻日本晴中過(guò)量表達(dá)miR528后可導(dǎo)致其對(duì)亞砷酸鹽的耐性極顯著下降，而將其抑制表達(dá)后轉(zhuǎn)基因植株對(duì)砷的耐性得到明顯恢復(fù)。另外我們發(fā)現(xiàn)，miR528過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)高鹽及干旱的耐受性亦顯著降低。這表明，miR528與其靶基因互作在水稻應(yīng)答亞砷酸鹽、高鹽及干旱等脅迫中起著重要調(diào)控作用。因此，利用基因工程手段解決水稻砷污染等逆境脅迫問(wèn)題具有重要現(xiàn)實(shí)意義。然而，目前對(duì)MIR528基因自身轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制尚不清楚。

本發(fā)明從粳稻品種日本晴基因組中克隆得到MIR528基因啟動(dòng)子，通過(guò)構(gòu)建全長(zhǎng)、分段缺失啟動(dòng)子融合GUS表達(dá)載體并轉(zhuǎn)基因證實(shí)，該啟動(dòng)子有活性且可受到亞砷酸鹽誘導(dǎo)表達(dá)；其為廣譜性表達(dá)，它在莖稈中的表達(dá)活性甚至優(yōu)于目前流行的35S啟動(dòng)子。這為進(jìn)一步研究植物應(yīng)答逆境脅迫的分子機(jī)制及該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因利用奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種水稻MIR528基因啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子具有典型的啟動(dòng)子序列特征，含有與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。在水稻中，MIR528基因受到該啟動(dòng)子的調(diào)控，參與亞砷酸鹽、鹽害及干旱脅迫等逆境轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

本發(fā)明的水稻MIR528基因啟動(dòng)子，其具有：(a)序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或(b)SEQ ID No.1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸且同等功能的由(a)衍生的核苷酸序列；或(c)與SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的DNA序列；或(d)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可以與SEQ ID No.1所示核苷酸序列雜交的序列。上述啟動(dòng)子是水稻特有的，它具有明顯啟動(dòng)子序列特征，其具有多個(gè)TATA-box和CAAT-box等。通過(guò)轉(zhuǎn)基因證明其能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)，為有活性的廣譜性表達(dá)啟動(dòng)子。

本發(fā)明還提供含有所述啟動(dòng)子的表達(dá)載體、宿主菌以及含有所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化水稻的種子。

本發(fā)明還提供水稻MIR528基因啟動(dòng)子在植物中調(diào)控下游基因表達(dá)中的應(yīng)用，其研究步驟為：?jiǎn)?dòng)子片段的克隆、植物表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化植物、陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株鑒定、GUS染色觀察、GUS活性檢測(cè)、GUS基因定量表達(dá)分析，所述的轉(zhuǎn)化植物的方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，優(yōu)選下游基因?yàn)镚US基因。

本發(fā)明還提供水稻MIR528基因啟動(dòng)子在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用。其中，所述的植物耐逆性是指植物耐砷、耐鹽和耐干旱等耐受逆境脅迫的能力，優(yōu)選為啟動(dòng)子在應(yīng)答亞砷酸鹽脅迫中的應(yīng)用。

發(fā)明有益的效果是：本發(fā)明中克隆的水稻MIR528基因啟動(dòng)子是水稻特有的、全新的、可被亞砷酸鹽誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子；上述啟動(dòng)子是一個(gè)高效、廣譜表達(dá)啟動(dòng)子，其在水稻莖稈中的調(diào)控活性優(yōu)于時(shí)下流行的35S啟動(dòng)子?？寺〔⒗棉D(zhuǎn)基因解析上述啟動(dòng)子的功能，有助于深入探析其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制以及在水稻響應(yīng)逆境脅迫中的作用。另外，該啟動(dòng)子廣譜、高效表達(dá)特性亦有望將其開(kāi)發(fā)為高效驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的新表達(dá)元件，為其在植物基因工程研究中的利用奠定基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1 MIR528基因啟動(dòng)子的PCR克隆結(jié)果；

圖2 MIR528全長(zhǎng)和分段缺失啟動(dòng)子分布；

圖3 MIR528基因分段缺失啟動(dòng)子的PCR克隆結(jié)果；

圖4全長(zhǎng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株不同組織器官的GUS組織化學(xué)分析；

圖5全長(zhǎng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株不同組織器官GUS基因的定量表達(dá)分析；

圖6各分段缺失啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因植株不同組織器官的GUS組織化學(xué)分析；

圖7各轉(zhuǎn)基因植株在25μM亞砷酸鹽脅迫處理3天時(shí)不同組織器官的GUS組織化學(xué)分析；

圖8各轉(zhuǎn)基因植株在25μM亞砷酸鹽脅迫處理3天時(shí)不同組織器官的GUS基因的定量表達(dá)分析；

圖9在CaMV35::GUS和pQ528Q::GUS轉(zhuǎn)基因植株不同組織器官中GUS酶活性的比較分析。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：

以下實(shí)施例中所采用的實(shí)驗(yàn)材料主要包括：(a)植物材料：粳稻品種日本晴(Oryza sativa L.japonica)；(b)菌株和載體：大腸埃希氏菌菌株DH5α、農(nóng)桿菌菌株EHA105均為市售商品；載體pGEM-T購(gòu)自Promega公司；表達(dá)載體pCX-GUS-P由浙江省農(nóng)科院病毒與生物技術(shù)研究所張恒木課題組提供；(c)酶和化學(xué)試劑：限制性內(nèi)切酶XcmI購(gòu)自NEB公司；ExTaq購(gòu)自TaKaRa公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit、定量表達(dá)分析試劑盒購(gòu)自TOYOBO公司；DNA Marker購(gòu)自北京全式金公司；T4DNA Ligase、凝膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自康為試劑有限公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；CTAB等其他常規(guī)生化試劑購(gòu)自杭州奧謙生物科技有限公司。

以下實(shí)施例中，PCR引物合成和DNA測(cè)序工作均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。以下實(shí)施例中所述的ABI7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Applied Biosystems公司；體式顯微鏡AF6000購(gòu)自萊卡公司；酶標(biāo)儀SpectraMax M5購(gòu)置Molecular Devices公司。以下實(shí)施例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法或按照制造廠商的使用說(shuō)明進(jìn)行。

實(shí)施例1：水稻MIR528基因啟動(dòng)子的克隆

1.1實(shí)驗(yàn)方法

1.1.1MIR528基因啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)

根據(jù)MSU v7數(shù)據(jù)庫(kù)中水稻基因組注釋信息，編寫(xiě)PERL程序提取MIR528前體序列上游2Kb核苷酸序列。利用Promoter v2.0、TSSP等啟動(dòng)子在線預(yù)測(cè)工具對(duì)相應(yīng)核苷酸片段進(jìn)行分析，以明確其是否為可靠的啟動(dòng)子序列。

1.1.2MIR528基因啟動(dòng)子的克隆與生物信息學(xué)分析

采用CTAB法提取水稻基因組DNA。根據(jù)預(yù)測(cè)的MIR528啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)特異引物(Forward：5’-TCA TCT CAA ACT GTC ATA GAC C-3’，Reverse：5’-GTC GCT GCT ACA GCC AAA AAG-3’)，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。采用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)對(duì)啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

1.2結(jié)果分析

1.2.1MIR528基因全長(zhǎng)啟動(dòng)子的克隆

通過(guò)分析MIR528前體與其上游蛋白編碼基因的基因間隔區(qū)長(zhǎng)度、與已發(fā)表cDNA序列的同源比對(duì)以及多個(gè)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件的分析結(jié)果，我們將MIR528前體上游1751bp序列確定為其啟動(dòng)子。在此基礎(chǔ)上，利用設(shè)計(jì)的正反向特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)，擴(kuò)增出的片段大小與預(yù)期結(jié)果吻合(圖1)。將擴(kuò)增片段回收連接到pGEM-T載體上后，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌，然后涂到含有Amp的LB培養(yǎng)基上，再經(jīng)PCR檢測(cè)，最后挑取正確的單克隆進(jìn)行測(cè)序，得到長(zhǎng)度1751bp的核苷酸序列(SEQ ID No.1)。

1.2.2MIR528基因啟動(dòng)子序列順式作用元件預(yù)測(cè)與分析

將啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列輸入PLACE對(duì)啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)該序列中存在大量調(diào)控元件，比如核心啟動(dòng)子元件TATA-box、多個(gè)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)常見(jiàn)順式元件CAAT-box，多種脅迫應(yīng)答元件，比如14個(gè)銅響應(yīng)元件、2個(gè)干旱與2個(gè)熱激應(yīng)答元件。此外，還包含多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的調(diào)控元件，如花粉晚期基因啟動(dòng)子元件、儲(chǔ)藏蛋白mapA的E-box花粉晚期基因啟動(dòng)子元件等。該序列的主要調(diào)控元件見(jiàn)表1。這從生物信息學(xué)水平上驗(yàn)證了克隆到的水稻MIR528基因啟動(dòng)子具有啟動(dòng)子的基本序列特征，并且具有響應(yīng)多種逆境脅迫的能力。

表1水稻MIR528啟動(dòng)子序列含有的主要順式作用元件

實(shí)施例2：水稻MIR528基因啟動(dòng)子及分段缺失啟動(dòng)子重組載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

2.1實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1MIR528全長(zhǎng)啟動(dòng)子及分段缺失啟動(dòng)子重組載體的構(gòu)建

根據(jù)PLACE預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子序列順式作用元件的類(lèi)型、數(shù)量及分布特點(diǎn)，將其分為4個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段(圖2)：(1)Q528Q：全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列(1751bp)；(2)Q528B：自啟動(dòng)子5’端第1位至第900位堿基(900bp)；(3)Q528C：自啟動(dòng)子5’端第451位至第1751位堿基(1301bp)；(4)Q528D：自啟動(dòng)子5’端第901位至1751位堿基(851bp)。設(shè)計(jì)序列特異引物，對(duì)Q528B(Forward:5’-TCA TCT CAA ACT GTC ATA GAC C-3’，Reverse:5’-ATA CAA TAA ATG TGA GCA TTA CAG-3’)、Q528C(Forward:5’-CTT TGA TGACAT TTT CAA CAT TAC-3’，Reverse:5’-GTC GCT GCT ACAGCC AAAAAG-3’)和Q528D(Forward:5’-TCT TAC TAAACC CAC TTT TAT AAA T-3’，Reverse:5’-GTC GCT GCT ACA GCC AAA AAG-3’)等缺失啟動(dòng)子片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后，分別以Q528Q-pGEM-T、Q528B-pGEM-T、Q528C-pGEM-T和Q528D-pGEM-T質(zhì)粒為模板，使用ExTaq酶對(duì)各啟動(dòng)子片段進(jìn)行克隆，同時(shí)使用XcmI對(duì)pCX-GUS-P表達(dá)載體進(jìn)行酶切處理，將條帶大小正確的各啟動(dòng)子片段回收后與酶切處理含GUS基因的表達(dá)載體pCX-GUS-P進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布到含有Kan的LB的培養(yǎng)基上，利用PCR反應(yīng)對(duì)連接到pCX-GUS-P載體目的片段進(jìn)行檢測(cè)，選擇檢測(cè)正確的單克隆進(jìn)行測(cè)序，對(duì)構(gòu)建成功的載體進(jìn)行質(zhì)粒抽取和保存。

2.1.2MIR528啟動(dòng)子片段的遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)全長(zhǎng)啟動(dòng)子及分段缺失啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)化水稻品種日本晴：通過(guò)電擊法將構(gòu)建成功的啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105，并通過(guò)PCR對(duì)轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌進(jìn)行檢測(cè)，選擇正確的單菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)。選擇日本晴胚經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體，利用電擊轉(zhuǎn)化成功的根癌農(nóng)桿菌EHA105侵染5min，共培養(yǎng)后使用潮霉素(50mg/L)和羧芐青霉素(250mg/L)進(jìn)行兩次篩選得到抗性愈傷組織，然后經(jīng)過(guò)分化、生根和移栽得到轉(zhuǎn)基因幼苗。

2.2結(jié)果分析

利用設(shè)計(jì)的各對(duì)啟動(dòng)子片段特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期一致(圖3)。隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物回收并融合GUS后，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得全長(zhǎng)啟動(dòng)子及分段缺失啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植株。利用載體引物(Forward：5’-AGG CGA TTA AGT TGG GTA ACG-3’，Reverse：5’-ATT CCA CAC AGT TTT CGC GAT CC-3’)對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻幼苗進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)，分別得到移栽存活的T₀代陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株45、50、38和58株。

實(shí)施例3：水稻MIR528基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下游GUS基因的表達(dá)

3.1實(shí)驗(yàn)方法

3.1.1轉(zhuǎn)基因植株GUS組織化學(xué)染色

對(duì)野生型對(duì)照(WT)和轉(zhuǎn)基因植株的根系、莖干和葉片等組織進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色：將相應(yīng)試材置于X-GLUC染液中，37℃放置過(guò)夜。使用75％的酒精對(duì)染色后含葉綠素的組織進(jìn)行脫色，至陰性對(duì)照呈現(xiàn)白色時(shí)，使用體式顯微鏡對(duì)染色的組織進(jìn)行拍照。

3.1.2GUS基因的定量表達(dá)分析

采用Trizol法提取21天齡的WT及各轉(zhuǎn)基因幼苗根系、莖干、葉片總RNA；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后將其稀釋10倍后用作模板。在ABI7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 5μL，P-F 0.3μL，P-R 0.3μL，cDNA 1μL，ddH2O 3.4μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性15s，60℃(退火和延伸)1min，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以Actin為內(nèi)參，采用2^-ΔΔCT法估測(cè)GUS基因的相對(duì)表達(dá)量。

3.1.3轉(zhuǎn)基因材料的亞砷酸鹽脅迫處理

選擇健康飽滿的供試材料種子若干，用0.5％的次氯酸鈉溶液消毒15min，用蒸餾水沖洗3-5次后在蒸餾水中浸泡過(guò)夜。然后將其移至發(fā)芽盒中，使用0.5％氯化鈣溶液催芽。當(dāng)苗子長(zhǎng)至約4-5cm高時(shí)，將其固定到含有2L營(yíng)養(yǎng)液的塑料容器內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。每個(gè)容器中放置8棵苗。每3天更換一次營(yíng)養(yǎng)液。上述實(shí)驗(yàn)在16小時(shí)光照(30℃)、8小時(shí)黑暗(20℃)以及75％濕度的智能培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

營(yíng)養(yǎng)液配方：0.274mM MgSO₄，0.091mM KNO₃，0.5μM MnCl₂，0.183mM Ca(NO₃)₂，0.1mM KH₂PO₄，0.4μM ZnSO₄，0.183mM(NH₄)₂SO₄，0.2μM CuSO₄，3μM H₃BO₃，0.1μM(NH₄)₆Mo₇O₂₄，40μM NaFe(III)-EDTA，2mM 2-嗎啉磺酸(MES)。使用NaOH和HCl調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)液pH值至5.5左右。

待供試材料在智能培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21d后，在營(yíng)養(yǎng)液中加入25μM亞砷酸鹽脅迫處理3d。處理結(jié)束后，及時(shí)收獲供試材料根系、莖干和葉片，置于–80℃冰箱備用。

3.2結(jié)果分析

3.2.1MIR528基因啟動(dòng)子在正常生長(zhǎng)條件下的表達(dá)活性分析

在正常生長(zhǎng)條件下，分別對(duì)21天齡WT和MIR528全長(zhǎng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因幼苗(pQ528Q::GUS)的根系、莖干、葉片、雄蕊和穎殼進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。我們發(fā)現(xiàn)，與WT相比，在轉(zhuǎn)基因植株的各個(gè)組織中均檢測(cè)到GUS活性，這從實(shí)驗(yàn)水平上證明該啟動(dòng)子為有活性的廣譜性表達(dá)啟動(dòng)子(圖4)。但是，對(duì)GUS基因在各供試材料根系、莖干和葉片中的定量RT-PCR分析顯示，該啟動(dòng)子在葉片和莖干部位要高于其在根系中的表達(dá)活性(圖5)。

進(jìn)一步對(duì)獲得的各分段缺失啟動(dòng)子的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)在pQ528C::GUS和pQ528D::GUS轉(zhuǎn)化植株的根系、莖干、葉片、雄蕊和穎殼等組織器官中均檢測(cè)到GUS活性，但在pQ528B::GUS與WT的各個(gè)組織中并未檢測(cè)到(圖6)。因?yàn)镼528C和Q528D在各檢測(cè)組織器官中均檢測(cè)到GUS活性且表達(dá)量與Q528Q相當(dāng)，表明其具有全長(zhǎng)啟動(dòng)子的功能。然而，Q528B不能驅(qū)動(dòng)GUS基因正常表達(dá)，表明該啟動(dòng)子片段中缺少轉(zhuǎn)錄起始的重要元件。另外，定量RT-PCR結(jié)果顯示，Q528C和Q528D在葉片中的表達(dá)量亦高于其在根系和莖干中的表達(dá)水平，但Q528D在葉片中的上調(diào)幅度比較顯著(圖5)。綜合上述結(jié)果，認(rèn)定Q528D應(yīng)為水稻MIR528基因啟動(dòng)子的重要功能區(qū)域。

3.2.2MIR528基因啟動(dòng)子在亞砷酸鹽脅迫下的表達(dá)活性分析

我們發(fā)現(xiàn)，在25μM亞砷酸鹽處理3d時(shí)，各轉(zhuǎn)基因材料根系和葉片中的GUS染色程度明顯加深；然而，在莖干中GUS基因的表達(dá)活性均受到抑制，但是其在pQ528C::GUS中的受抑制程度相對(duì)較弱(圖7)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述推測(cè)，我們采用定量RT-PCR分析了GUS基因在正常及砷脅迫下其在不同供試材料根系、莖干和葉片中的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，在亞砷酸鹽脅迫下，各轉(zhuǎn)基因材料根系和葉片中的GUS表達(dá)量均較正常條件下顯著上升，而其在pQ528Q::GUS和pQ528D::GUS根系和葉片中的上調(diào)程度高于pQ528C::GUS。但是，各轉(zhuǎn)基因材料莖干中GUS基因的表達(dá)量均受到明顯抑制：與pQ528Q::GUS和pQ528D::GUS相比，pQ528C::GUS中GUS基因表達(dá)受到的抑制程度相對(duì)較低(圖8)。

實(shí)施例4：水稻MIR528基因啟動(dòng)子與35S啟動(dòng)子的活性比較

4.1實(shí)驗(yàn)方法

4.1.1轉(zhuǎn)基因植株GUS酶活性檢測(cè)

稱取0.1g待檢測(cè)材料，充分研磨后加入600μL GUS酶提取液(50mM NaH₂PO₄，50mM Na₂HPO₄，10mM Na₂EDTA(pH＝8.0)，0.1％Triton-100，20％甲醇，0.1％β-巰基乙醇)，充分混勻，4℃13000rpm離心10min，取上清置于新的離心管中備用。將配制好的1mM 4-MU溶液逐步稀釋成12個(gè)梯度，在激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)455nm處測(cè)定其熒光值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取50μL含GUS酶的上清液，加入450μL在37℃預(yù)熱的檢測(cè)液(0.2M MUG，其它同GUS酶提取液)，迅速充分混勻后，取出50μL加入到950μL的終止反應(yīng)液中，將其作為該酶促反應(yīng)的0點(diǎn)。之后分別在10、20、30、40、50以及60min時(shí)取50μL加入到950μL的終止反應(yīng)液中，使用Molecular Devices公司的SpectraMax M5酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)455nm處測(cè)定其熒光值。

采用Bradford法測(cè)定各樣品的蛋白濃度。將4μg/μL的牛血清蛋白(BSA)逐步稀釋成12個(gè)濃度梯度，然后各取5μL的各待測(cè)樣品提取液、空白對(duì)照以及12個(gè)BSA標(biāo)準(zhǔn)品加入195μL考馬斯亮藍(lán)，在595nm處測(cè)定其吸光值。然后，采用下述公式來(lái)評(píng)價(jià)GUS酶活性：

4.2結(jié)果分析

為評(píng)估MIR528基因啟動(dòng)子在水稻根系、莖干和葉片中驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)活性強(qiáng)弱，我們分析和比較了pQ528Q::GUS和煙草花葉病毒CaMV35S::GUS轉(zhuǎn)基因植株上述組織器官中GUS酶活性。我們發(fā)現(xiàn)，與CaMV35S::GUS相比，pQ528Q::GUS根系和葉片中的GUS酶活性顯著較低，但是，其在莖干中的活性卻明顯優(yōu)于CaMV35S(圖9)。

除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。