本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體的說，涉及一種檢測北京油雞五趾性狀的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

北京油雞是我國一個著名的地方品種，原產(chǎn)于北京地區(qū)，該雞種肉蛋品質(zhì)優(yōu)良，深受養(yǎng)殖戶和消費者歡迎，現(xiàn)已被農(nóng)業(yè)部列入國家畜禽品種資源重點保護名錄。近年來在北京市和全國大部分省市都有推廣，并且養(yǎng)殖量和養(yǎng)殖規(guī)模逐年上升。該雞外貌獨特，具有五趾和三毛(鳳頭、胡須、毛腿)的特征。

其中，五趾是北京油雞屠宰上市后最明顯的辨認性狀，可以作為北京油雞的重要品種標識，幫助消費者籍此做出消費選擇。因此加強北京油雞五趾性狀的選育，無論從促進品種本身開發(fā)而言，還是從養(yǎng)殖者和消費者而言，都具有重要意義。

然而，雞的五趾是一個相對復(fù)雜的質(zhì)量性狀，呈不完全顯性遺傳，通過趾數(shù)的表型來選擇進展非常緩慢，很難獲得顯著的效果。

2010年，Dorshorst等在Siklie和WhiteSultan雞種中檢測到LMBR1基因第5內(nèi)含子內(nèi)ZRS區(qū)域內(nèi)突變rs80659072與五趾有關(guān)，其中GG型表現(xiàn)為四趾，GT和TT型表現(xiàn)為五趾或更多趾。2016年，Zhang等也表示該位點與北京油雞多趾是完全相關(guān)的，并建立了基于酶切的PCR-RFLP方法對該位點進行檢測(專利申請?zhí)?01510044061.2)。

然而，該聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)(PCR-RFLP)方法檢測步驟復(fù)雜，包括：①根據(jù)酶切位點上下游序列設(shè)計引物，利用聚合酶鏈式反應(yīng)擴增目的片段；②擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測；③擴增產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶消化；④酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測。不僅步驟繁瑣、耗時長，而且要多次的轉(zhuǎn)管和加樣，且DNA濃度、DNA質(zhì)量、擴增條件、內(nèi)切酶消化條件、瓊脂糖凝膠質(zhì)量等都會影響到判型的有效性和準確性。

在北京油雞五趾性狀的實際選育過程中，要求能夠快速檢測出基因型，且結(jié)果必須保證準確性，因為一旦判定錯誤，會給育種帶來重大損失。因此，開發(fā)出一種能夠快速準確檢測北京油雞五趾性狀的方法，以此為北京油雞的選育提供有力的技術(shù)支撐尤為必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的采用PCR-RFLP方法檢測北京油雞五趾性狀存在的步驟繁瑣，耗時長，靈敏度低，檢測結(jié)果易受實驗條件影響的缺陷問題，提供一種能夠準確高效地檢測北京油雞五趾性狀的熒光定量PCR方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

首先本發(fā)明提供了一種檢測北京油雞五趾性狀的方法，該方法包括通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測LMBR1基因第5內(nèi)含子內(nèi)ZRS區(qū)域內(nèi)的rs80659072突變位點的基因型的步驟。

優(yōu)選的，上述方法包括根據(jù)LMBR1基因第5內(nèi)含子內(nèi)ZRS區(qū)域的序列，設(shè)計一對熒光定量PCR引物以及與引物配合使用的TaqMan探針，利用這些引物和探針，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測rs80659072突變位點的基因型的步驟；

其中，所述的LMBR1基因第5內(nèi)含子內(nèi)ZRS所在區(qū)域的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本發(fā)明一個優(yōu)選的方面，所述熒光定量PCR的引物為：用于擴增ZRS區(qū)域的熒光定量PCR引物對的核苷酸序列分別如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；和

與上述PCR引物配合使用的TaqMan熒光探針核苷酸序列為：野生型等位基因探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，突變型等位基因探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

優(yōu)選的，上述熒光定量PCR的反應(yīng)體系是：基因組DNA 1μL，40倍濃縮的探針和引物混合液0.25μL，通用PCR混合液5μL，用水補齊至10μL。

優(yōu)選的，上述熒光定量PCR的反應(yīng)條件是：95℃，預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火1min，共40個循環(huán)。

本發(fā)明提供了一種用于鑒定北京油雞五趾性狀的引物，其是用于擴增ZRS區(qū)域的引物對，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

進一步地，本發(fā)明還提供了一種與上述的PCR引物配合使用的TaqMan熒光探針，其包括野生型等位基因探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；突變型等位基因探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

進一步地，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，該試劑盒包含上述的引物和上述熒光探針的組合。

優(yōu)選的，本發(fā)明所述的試劑盒在檢測北京油雞五趾性狀上的應(yīng)用。

更進一步地，本發(fā)明還提供了將上述北京油雞五趾性狀檢測方法應(yīng)用于選育北京油雞五趾性狀上。

本發(fā)明通過設(shè)計特異性的引物對以及與引物對配合使用的探針，采用實時熒光定量TaqMan SNP分型技術(shù)檢測目的序列的基因型。采用實時熒光定量PCR技術(shù)，能夠快速靈敏地檢測待測雞目標區(qū)域突變位點的基因型，并且在此基礎(chǔ)上借助分子標記輔助進行育種，能夠快速構(gòu)建北京油雞五趾品系純系。并且，本發(fā)明使用的實時熒光定量TaqMan SNP分型技術(shù)檢測速度快，靈敏度高，自動化程度高，經(jīng)過一個PCR反應(yīng)即可判型，操作簡便，且反應(yīng)全過程在封閉的管內(nèi)進行，減少了交叉污染。能夠以滿足育種工作對準確性和及時性的要求。

此外，本發(fā)明使用的與特異性的引物對配合使用的探針是TaqMan MGB探針，該探針的3′端的淬滅基團是不發(fā)光的淬滅基團(Non-Fluorescent Quencher，NFQ)，因此當淬滅基團吸收報告基團的能量后并不發(fā)光，大大降低了本底信號的干擾；TaqMan MGB探針還具有更強的序列特異性，實驗結(jié)果更精確可靠。

附圖說明

圖1為部分個體PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中泳道1-10為不同個體，泳道M為100bp Marker；

圖2為熒光定量PCR法檢測個體的基因型；

圖3為不同基因型個體測序結(jié)果。

具體實施方式

目前檢測北京油雞多趾的方法是基于酶切的PCR-RFLP方法對與北京油雞五趾相關(guān)位點的基因型進行檢測，該方法不僅步驟繁瑣、耗時長，而且準確性不能夠滿足后期構(gòu)建北京油雞五趾品系純系的要求，本發(fā)明為了克服上述缺陷，提供一種利用實時熒光PCR技術(shù)高效地檢測北京油雞五趾性狀的方法。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行說明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的前提下，對本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明的范疇：

實施例1突變位點rs80659072的檢測

參考突變位點rs80659072(NCBI登錄號)及其周圍序列(核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)，設(shè)計引物，上游引物：5’-ACATACCAAGAATGTGCATGTGC-3’,下游引物：5’-TTTGAGGTAACTTCCTTGCTTAA-3’，擴增產(chǎn)物長度448bp。

從北京油雞大群中隨機選擇各種趾型的個體，累計155只。采集抗凝血，使用DNA提取試劑盒(天根生化，北京)提取基因組DNA，使用上述引物該位點及其周圍序列進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠檢測后，由北京擎科嘉美生物技術(shù)有限公司完成測序，反向測序。

圖1給出了上述的部分個體的PCR擴增后的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，其中泳道8和10對應(yīng)個體的產(chǎn)物非常弱，無法用于后續(xù)的測序試驗。使用NanoDrop2000紫外分光光光度計，測定基因組濃度，發(fā)現(xiàn)這4只個體DNA濃度較低，只有10-15ng/μL。DNA模板添加量增加到5μL，重新PCR擴增，但是仍然達不到理想的PCR產(chǎn)物擴增濃度。因此，重新對這4只個體提取基因組DNA后，再重新PCR擴增才獲得了滿意的結(jié)果。

所有155只雞的測序結(jié)果見表1：由表1可以看出除了雙四趾(4/4)的油雞外，其余無論哪種表型，左五-右四(5/4)、左四-右五(4/5)、雙五趾(5/5)、六趾(包括雙六趾和單六趾，6/-)，都只有TT和GT兩種基因型。結(jié)果表明，T位點是北京油雞五趾/六趾表型的一個必要條件，但不是充要條件。

表1不同表型油雞rs80659072突變位點基因型分布

實施例2熒光定量PCR檢測方法的建立

本發(fā)明經(jīng)反復(fù)的比對篩選和驗證，根據(jù)LMBR1基因第5內(nèi)含子內(nèi)ZRS區(qū)域及其附近的序列(核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)得到一對用于檢測雞rs80659072突變位點的熒光定量PCR引物和與引物配合使用的TaqMan探針。

上游引物F：5’-TCAGTGGCAAAAAACGAGCAAAAAT-3’(SEQ ID NO.1)

下游引物R：5’-CACACAGAAATGAGTAGGAAGTCCAA-3’(SEQ ID NO.2)。

上游引物由25個堿基組成，對應(yīng)雞2號染色體8467207～8467231堿基位置(www.ensembl.org，galgal4)，下游引物由26個堿基組成，對應(yīng)雞2號染色體8467272～8467299堿基位置(www.ensembl.org，galgal4)，該引物對的擴增片段長度為93bp。

與上述特異性引物配合使用的TaqMan熒光探針核苷酸序列為：

野生型等位基因探針：5’-ATGCAATGAAAGCTC-3’(SEQ IN NO.3)；

突變型等位基因探針：5’-CATGCAATTAAAGCTC-3’(SEQ IN NO.4)。

野生型探針由15個堿基組成，突變型探針由16個堿基組成，對應(yīng)2號染色體第8467241～8467255和8467240～8467255位堿基序列。其中，野生型等位基因的探針針對野生型堿基G，探針5’端連接了熒光基團VIC。突變型等位基因的探針針對突變堿基T，探針5’端連接了熒光基團FAM；兩個探針的3’端標均標記有淬滅基團，該基團為不發(fā)光的淬滅基團(Non-Fluorescent Quencher，NFQ)。

使用伯樂(Bio-Rad)iQ5型實時熒光定量PCR儀進行TaqMan探針實時熒光定量PCR試驗。

以上述實施例1中已知基因型的155個體的基因組DNA為模板，建立TaqMan熒光定量PCR檢測方法。反應(yīng)體系如下：

其中，基因組DNA為實施例1中獲得的基因組DNA，40×SNP Genotyping AssayMix(上、下游引物濃度各36μM和探針濃度各8μM)由ABI(美國)合成，購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司)，Genotyping Master Mix由ABI(美國)合成，購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，ddH2O為滅菌去離子水。

PCR反應(yīng)條件：95℃，預(yù)變性10min；95℃變性15s，60℃退火1min，共40個循環(huán)，實時檢測整個擴增中兩種熒光染料的信號強度。

在檢測過程中每種反應(yīng)體系都設(shè)置2個不加模板DNA的空白對照，以方便軟件對背景色進行校正。

反應(yīng)結(jié)束后，還可以使用儀器自帶軟件，data analysis模塊中的Allelic Disc功能界面直接進行判型，判型結(jié)果見圖2：

通過圖2，可以看出相同基因型的個體聚類在一起，其中，正方形代表的是TT純合子；三角形代表的是GT雜合子；圓形代表的是GG純合子。

不同基因型個體的反向測序結(jié)果見圖3，a)在箭頭所指突變位點處只有一個峰，對應(yīng)A堿基，因為是反向測序，所以對應(yīng)個體的基因型為TT突變型，b)在箭頭所指突變位點處有2個峰，對應(yīng)A、C兩種堿基，因為是反向測序，所以對應(yīng)個體基因型為GT型，為雜合子；c)在箭頭所指突變位點處有一個峰，對應(yīng)堿基為C，因為是反向測序，所以對應(yīng)個體的基因型為GG，野生型。

綜上結(jié)果表明，對155個個體用Taqman探針法檢測結(jié)果與已知PCR產(chǎn)物測序結(jié)果對比顯示二者完全一致，說明TaqMan探針實時熒光定量PCR方法準確可靠。

本發(fā)明所提供的方法對155個個體進行檢測時，使用96孔板，只用了兩塊PCR板子即完成了對結(jié)果的判定。耗時僅4-5小時。并且包含在實施例1中出現(xiàn)的4個無法完成擴增的，這主要是因為TaqMan SNP分型方法對基因組的要求比較低，從10-100ng都可以滿足需要，即使基因組濃度非常低或者提取質(zhì)量略差，都無需重新提取基因組，且不會影響對檢測分型結(jié)果的判定。

而如果采用實施例1的PCR產(chǎn)物直接測序的方法或者PCR-RFLP的方法，都對基因組有很高的要求，否則PCR擴增不穩(wěn)定，或者產(chǎn)物量過少，影響后續(xù)的酶切和測序工作。此外，除了PCR擴增步驟外，PCR產(chǎn)物直接測序的方法或者PCR-RFLP的方法，還需要增加測序或者酶切的步驟，耗時至少增加10小時以上。所以本發(fā)明TaqMan SNP分型方法具有非常明顯的優(yōu)勢。

實施例3不同趾數(shù)表型和基因型雞的遺傳規(guī)律研究

分別選擇不同趾數(shù)表型和不同基因型組合的公雞母雞交配，研究不同基因型的遺傳規(guī)律。具體實驗操作如下：

(1)雙四趾表型：7只GG型公雞，與20只GG型母雞交配；3只TT公雞，與7只TT母雞，7只GT母雞；(2)雙五趾表型：8只TT公雞，與20TT母雞和6只GT母雞；兩只GT公雞和2只GT母雞。

分別對上述交配類型的后代進行趾型的觀察登記。結(jié)果見表2：

表2不同趾數(shù)表型和基因型雞交配后代趾型結(jié)果

通過表2可見CC型與CC型的后代，100％都是雙四趾，該試驗結(jié)果充分說明，如果GG基因型的公雞和母雞交配，則后代完全為雙四趾個體。

而AA與AA或者AC型的后代大多數(shù)表現(xiàn)為雙五趾，具體分析如下：

趾數(shù)表型為雙四趾的TT型與TT型或者GT型雞交配，其后代仍會出現(xiàn)較高比例的五趾雞，雙五趾比例63％左右，單五趾比例19％左右，當然，群體中仍然存在18％左右比例的雙四趾個體。

然而，即使是雙五趾的TT型與TT型或者GT型雞交配，后代仍會出現(xiàn)低比例的雙四趾表型，約4％。

也就是說，可能存在一些抑制因子會抑制其表達，但是并不會影響五趾的遺傳。突變位點rs80659072可以作為一個北京油雞五趾性狀候選標記在育種中進行應(yīng)用，雖然后代并不一定全部表現(xiàn)為五趾，但是會大大提高群體后代五趾表型的比例。