本發(fā)明涉及應(yīng)用微生物技術(shù)領(lǐng)域以及環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一株生物氧化錳生產(chǎn)藻株Desmodesmussp.WR1，同時涉及利用該微藻制備生物氧化錳的方法，和利用該微藻和生物氧化錳所形成的體系對內(nèi)分泌干擾物雙酚A的降解應(yīng)用。

背景技術(shù)：

環(huán)境中的錳氧化物被認(rèn)為在有機(jī)和無機(jī)物的生物地球化學(xué)循環(huán)中起到關(guān)鍵的作用，然而在近中性環(huán)境中錳氧化物的生產(chǎn)速度有限，因此眾多證據(jù)顯示環(huán)境微生物控制著錳氧化物在環(huán)境中生成。

目前利用細(xì)菌來生成氧化錳研究報道較多，結(jié)果顯示細(xì)菌產(chǎn)生的生物氧化錳多為非晶體或弱晶型的納米級顆粒，該類錳氧化物比表面極大，氧化活性高，作為高活性吸附劑和氧化催化劑，被廣泛應(yīng)用到重金屬的去除，以及對有機(jī)污染物降解中。

但利用細(xì)菌生成生物氧化錳需要提供營養(yǎng)物質(zhì)和不斷曝氣，生產(chǎn)成本高，且在生物氧化錳的實(shí)際應(yīng)用中很難利用錳氧化細(xì)菌實(shí)現(xiàn)過程中錳氧化物再生。然而，微藻作為水環(huán)境中最重要的生產(chǎn)者，其以光能為源驅(qū)動力，不僅環(huán)境適應(yīng)性高培養(yǎng)簡單，藻光合作用放出氧氣和生長過程中對碳的固定可提高環(huán)境pH，這又滿足了錳氧化物的生成的熱力學(xué)條件，在生物氧化錳的生成上具有較大潛力和利用價值。此外，微藻作用一種環(huán)境友好、成本低、效益高的可再生資源被廣泛用到污染水體的植物修復(fù)，生物能源和藥用次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)等方面。

盡管如此，微藻在水環(huán)境中對錳氧化物生成的作用并未引起關(guān)注，僅有較少的研究對藻細(xì)胞表明積累的鐵錳沉淀和錳鈣顆粒進(jìn)行了描述。利用微藻生成生物氧化錳，以及對該類錳氧化物的形態(tài)特征和氧化性質(zhì)的系統(tǒng)研究和應(yīng)用評價尚未見有報道。

雙酚A(BPA)作為一種典型的內(nèi)分泌干擾物，對暴露與其中的生物產(chǎn)生不利影響，如導(dǎo)致精子數(shù)目降低、雌性化、影響性腺發(fā)育和導(dǎo)致超雌等現(xiàn)象。目前世界各地的污水、垃圾填埋場及自然環(huán)境水體和沉積物中均有不同程度檢出BPA的報道。將BPA從環(huán)境中去除的方法包括物理化學(xué)和生物學(xué)方法。本發(fā)明旨在利用微藻和生物氧化錳形成生物氧化錳再生體系，將生物氧化錳的氧化和吸附作用，以及微藻生長提高氧氣和pH水平和直接對錳離子進(jìn)行氧化等過程相結(jié)合，形成物理化學(xué)和生物學(xué)相結(jié)合的方法，建立高效的BPA降解體系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一株具有生物氧化錳生成能力的微藻藻株。該藻株生長快，易培養(yǎng)，可利用二價錳離子生成納米級錳氧化物顆粒包裹在細(xì)胞表面，或形成后積累于培養(yǎng)基底部。

本發(fā)明的另一目的是提供所述微藻的應(yīng)用，應(yīng)用于制備微藻-生物氧化錳體系。

本發(fā)明還一目的是提供所述微藻-生物氧化錳體系的制備方法。

本發(fā)明同時提供所述微藻-生物氧化錳體系在降解雙酚A方面的應(yīng)用。

該藻株

本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明提供一種生物氧化錳生成微藻(Desmodesmus sp.WR1)，于2016年9月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏中心地址是中國湖北省武漢市珞珈山武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO: M 2016461。

所述藻株屬于綠藻鏈帶藻屬，細(xì)胞多形成4或2個群體，也有單細(xì)胞，細(xì)胞表面有棘狀凸起，細(xì)胞大小約6～10μm，該藻的18S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。該藻與綠藻Desmodesmus subspicatu，NCBI登錄號為KF673378.1，具有99％的同源性。

本發(fā)明同時提供所述生物氧化錳生成微藻的應(yīng)用，所述藻株在二價錳離子存在條件下，可對錳離子進(jìn)行氧化生成納米級無定形的錳氧化物顆粒，該錳氧化物顆粒具有較高的氧化活性。微藻在生長過程中通過光合作用產(chǎn)生氧氣，又可因利用培養(yǎng)基中的二氧化碳使培養(yǎng)基pH升高，這為錳氧化物生產(chǎn)提供了理化條件；加之微藻本身也具有較高的錳離子氧化能力；此外，微藻還可再次氧化污染物氧化降解過程中作為電子受體的錳氧化物因還原而釋放出的錳離子，形成微藻-生物氧化錳再生體系。所述微藻可很好地應(yīng)用于形成微藻-生物氧化錳體系。利用微藻生產(chǎn)生物氧化錳無需曝氣和提供有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)，操作簡單成本低，在具有較大的應(yīng)用潛力。

所述微藻-生物氧化錳體系的制備方法包括以下步驟：

S1.將微藻培養(yǎng)至對數(shù)期，經(jīng)離心收集后用BG-11培養(yǎng)基在680nm下調(diào)節(jié)其初始的藻細(xì)胞光密度到0.02，得到藻液；

S2.在步驟S1所得藻液中加入氯化錳溶液獲得含有錳離子終濃度為0.5mM的微藻培養(yǎng)液；

S3.將步驟S2所述微藻培養(yǎng)液置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)生成生物氧化錳，形成微藻-生物氧化錳體系。

優(yōu)選地，步驟S1所述微藻培養(yǎng)的條件為采用光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。溫度光暗時間比16L:8D，光強(qiáng)為40～50μmol photon m^-2s^-1。利用分光光度計在680nm下調(diào)節(jié)細(xì)胞光密度為0.02，約每毫升3.5×10⁶個藻細(xì)胞；

優(yōu)選地，步驟S1所述離心的條件是6000轉(zhuǎn)/分，4℃離心15分鐘。

優(yōu)選地，步驟S2所述氯化錳溶液濃度為0.5M。

優(yōu)選地，步驟S3所述培養(yǎng)的時間為3天，可觀察到大量棕色錳氧化物生成。

在轉(zhuǎn)速6000轉(zhuǎn)/分下對生成的生物氧化錳和藻細(xì)胞進(jìn)行收集，保留沉淀?xiàng)壍羯锨逡?，沉淀可?jīng)冷凍干燥或50℃烘干保存，為保持藻細(xì)胞活性，亦可在4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明提供所述的制備方法制得的微藻-生物氧化錳體系。

本發(fā)明還提供所述微藻-生物氧化錳體系在在內(nèi)分泌干擾物的氧化降解中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述內(nèi)分泌干擾物為雙酚A。利用生物氧化錳，或微藻-生物氧化錳再生體系對環(huán)境存在的BPA進(jìn)行降解，該方法效率高成本低，操作簡單，且可循環(huán)利用，該方法不僅大大提高了BPA的降解效率，藻細(xì)胞生長利用環(huán)境中的氮磷等無機(jī)營養(yǎng)，也可對富營養(yǎng)化進(jìn)行一定修復(fù)。

具體的應(yīng)用方法是將制備的微藻-生物氧化錳沉淀按照其中氧化錳終濃度為3mg/L～10mg/L投入到被BPA污染的水體中即可。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供了一株新的具有生物氧化錳生成能力的微藻藻株。該藻株生長快，易培養(yǎng)，可利用二價錳離子生成納米級錳氧化物顆粒包裹在細(xì)胞表面，或形成后積累于培養(yǎng)基底部，填補(bǔ)了本領(lǐng)域技術(shù)空白。

基于所述微藻，本發(fā)明提供了一種利用微藻生成生物氧化錳的方法，微藻為光合自養(yǎng)生物，易培養(yǎng)成本低，操作簡單。該微藻能將錳離子氧化成三價或四價的錳氧化物，包裹在藻細(xì)胞表面，或積累在培養(yǎng)及底部，經(jīng)掃描電鏡、投射電鏡、X粉晶衍射等研究發(fā)現(xiàn)，生成的生物氧化錳為納米級無定型的顆粒，具有較大的比表面積和氧化活性及吸附能力。與利用細(xì)菌生成氧化錳相比，該方法無需曝氣和提供有機(jī)營養(yǎng)，且可將藻細(xì)胞和錳離子同時投入應(yīng)用，建立生物氧化錳再生體系。與人工生成生物氧化錳相比，該方法操作簡單，更易獲得，成本低，且因生成的氧化錳為納米級微粒具有更高的活性。

本發(fā)明提供一種去除BPA的方法，利用藻類生成的生物氧化錳降解水體中的BPA，該方法效率高，成本低，操作簡單，此外利用藻類與生物氧化錳建立再生體系，不僅可有效去除BPA，亦可對水體中的氮磷元素進(jìn)行去除，在污水處理方面中具有應(yīng)用潛力。

附圖說明

圖1為微藻Desmodesmus sp.在掃描電鏡觀察下的形態(tài)圖。

圖2為該微藻的系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖3微藻生成生物氧化錳的濃度

圖4為該微藻及所生成的生物氧化錳在掃描電鏡觀察下的形態(tài)圖。

圖5為能譜儀分析該微藻表面生成的錳氧化物顆粒的元素圖譜。

圖6為該微藻生成的生物氧化錳在透射電鏡下的形態(tài)圖。

圖7為該微藻生成的生物氧化錳經(jīng)制備后用于X射線衍射分析樣品的LBB顯示圖。

圖8為該綠藻生成的生物氧化錳的X射線衍射圖。

圖9為微藻-生物氧化錳體系對BPA的去除情況。

圖10為BPA去除過程中生物氧化錳含量變化圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施過程對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑及儀器為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的試劑及儀器，來源于商業(yè)渠道。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供一株錳氧化物生成藻株(Desmodesmus sp.WR1)，于2016年9月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏中心地址是中國湖北省武漢市珞珈山武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO: M 2016461。

所述藻株屬于綠藻鏈帶藻屬，細(xì)胞多形成4或2個群體，也有單細(xì)胞，細(xì)胞表面有棘狀凸起，細(xì)胞大小約6～10μm。

將所得微藻通過形態(tài)和分子學(xué)方法進(jìn)行鑒定：

首先形態(tài)學(xué)上，將藻細(xì)胞利用2.5％的戊二醛固定后，多次清洗后利用酒精梯度系列進(jìn)行脫水，其后對樣品進(jìn)行干燥并鍍金后，在掃描電鏡下觀察其形態(tài)，結(jié)果如圖1所示，并與藻類分類學(xué)文獻(xiàn)對比，確定該藻所屬種類。

分子上，提取藻的DNA，利用真核生物通用引物EUKA-F(5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAG-3′)/EUKB-R(5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTA C-3′)對該綠藻18S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到基因片段序列(如SEQ ID NO.1所示)；

并與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比和建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2所示)，該藻與綠藻Desmodesmus subspicatu，NCBI登錄號為KF673378.1，具有99％的同源性。證明該藻與鏈帶屬微藻具有較高相似性，因此確定該藻株為鏈帶屬微藻Desmodesmus sp..對其命名為Desmodesmus sp.WR1。

實(shí)施例2

微藻Desmodesmus sp.WR1生物氧化錳體系的制備，過程如下：

將本發(fā)明實(shí)施例1所述微藻藻株培養(yǎng)到對數(shù)期，在6000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速下離心后，棄掉上清液，用滅菌后的BG-11培養(yǎng)基和分光光度計在680nm下調(diào)節(jié)初始藻光密度為0.02，加入初始濃度為0.5M的MnCl₂儲備液獲得錳離子終濃度為0.5mM，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，培養(yǎng)基和細(xì)胞表面均可見到棕色沉淀產(chǎn)生。如圖3所示，生物氧化錳濃度隨實(shí)驗(yàn)時間逐漸升高，且初始藻接種密度越高，生物氧化錳濃度升高越快。利用leucoberbelin blue(LBB)法測定生成的生物氧化錳含量。

LBB方法：首先稱取一定量的LBB溶解于0.25％的冰乙酸溶液當(dāng)中配制成0.004％的LBB溶液，然后取上述藻培養(yǎng)液0.1mL，加入0.5mL LBB溶液中，在室溫下遮光放置15～20min進(jìn)行反應(yīng)，LBB被錳氧化物氧化后呈現(xiàn)藍(lán)色并在620nm下有最大吸收峰，利用分光光度計測定上清液在620nm的吸光度對生成的生物氧化錳進(jìn)行定量，借此從培養(yǎng)的藻株中，篩選出具有最大生成生物氧化錳潛力的藻株。

培養(yǎng)24h后，取一定量的培養(yǎng)液經(jīng)固定、洗滌、脫水、臨界點(diǎn)干燥及鍍金后，進(jìn)行掃描電鏡觀察和能譜儀測定細(xì)胞表面顆粒物的化學(xué)元素組成。如圖4所示，加入錳離子后在藻細(xì)胞表面生成生物氧化錳及聚集的生物氧化錳顆粒。如圖5所示，利用能譜儀測定細(xì)胞表面生成的生物氧化錳顆粒的組成元素，發(fā)現(xiàn)該顆粒元素組成主要包括Mn、O等元素。

培養(yǎng)24h后，取一定量培養(yǎng)液經(jīng)離心收集沉淀，有去離子多次洗滌后，加入去離子水重懸后，滴到銅網(wǎng)上待自然風(fēng)干后進(jìn)行投射電鏡測定生物氧化錳形態(tài)。圖6顯示微藻生成的生物氧化錳形態(tài)特征，確定其為無定型納米大小顆粒。

將培養(yǎng)后的藻液離心收集藻細(xì)胞和生成的生物氧化錳，用去離子水多次洗滌后，在50℃下烘干并研磨，先用LBB法測定其中生物氧化錳含量，其后對干粉樣品進(jìn)行X射線衍射分析，如圖7所示，樣品的X射線衍射圖譜說明該微藻產(chǎn)生的生物氧化錳為非晶體錳氧化物。

實(shí)施例3微藻-生物氧化錳再生體系對BPA的去除應(yīng)用試驗(yàn)

過程如下：

將微藻培養(yǎng)至對數(shù)期，離心后加入BG-11培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其光密度到0.02，將上述藻液100mL分裝至250mL的錐形培養(yǎng)瓶，加入MnCl₂溶液獲得錳離子終濃度為0.1，0.5和1mM，在上述處理中加入雙酚A，雙酚A濃度為14.5mg/L，處理時間為一周，利用高效液相色譜測定培養(yǎng)基中殘留BPA濃度，通過殘留BPA濃度(C)與初始濃度(C₀)的比值，即C/C₀計算生物氧化錳的生成對BPA的去除效果。此外，利用LBB法測定該過程中生物氧化錳的濃度變化。

表1高效液相色譜參數(shù)設(shè)置

試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，與對照相比，生物氧化錳生成顯著促進(jìn)了BPA的去除。如圖9所示，在BPA去除的過程中，生物氧化錳的含量都持續(xù)升高，說明在微藻存在的情況下，生物氧化錳在促進(jìn)BPA去除的過程中仍可以通過微藻對錳離子的再氧化進(jìn)行補(bǔ)充，可作為一個微藻-生物氧化錳系統(tǒng)應(yīng)用到污水處理工藝中。

實(shí)施例4微藻生物氧化錳從城市生活污水中去除雙酚A的效率研究

從暨南大學(xué)內(nèi)的污水口取4L城市生活污水，過濾去除較大顆粒物之后，加入BPA至終濃度為2mg/L，此后分裝至250mL的錐形瓶，用事先制備好的保存于4℃的微藻和生物氧化錳沉淀按照生物氧化錳濃度2mg/L至8mg/L加入到分裝的城市污水中，用液相色譜測定處理一周間污水中殘留的BPA濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生物氧化錳對污水中BPA也具有較高的去除效率。