本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，特別是一種親水型聚合物功能化磁性納米微球及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖蛋白在細胞的生理過程中有重要作用，糖蛋白參與細胞的粘連、運轉(zhuǎn)代謝、信號傳導(dǎo)、內(nèi)吞、受體激活等過程，所以對糖蛋白組學(xué)的研究有助于探究癌的發(fā)生機理，對于癌癥的發(fā)現(xiàn)、防治有重要意義。以軟電離為基礎(chǔ)的生物質(zhì)譜已經(jīng)成為蛋白組學(xué)研究的重要工具，目前shotgun策略是使用最為廣泛的蛋白組學(xué)分析策略，主要包括：獲得生物樣品，對生物樣品進行提取、標記、酶解、分離富集等，對肽段進行質(zhì)譜鑒定，獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析。盡管質(zhì)譜技術(shù)不斷進步，但是在鑒定實際樣品中低豐度蛋白、多肽，特別是翻譯后修飾的蛋白、多肽還顯得不足。低豐度蛋白、多肽不但濃度低，還受到高豐度蛋白、多肽的信號干擾，繁瑣的樣品處理過程往往會有樣品的損失。所以對蛋白酶解樣品進行有效的質(zhì)譜前分離富集是shotgun策略蛋白組學(xué)研究的關(guān)鍵。由于復(fù)雜的生物樣品中，蛋白表達的動態(tài)范圍非常寬，高豐度非糖基化蛋白的存在會大大抑制低含量的糖基化蛋白的質(zhì)譜信號，因此對生物樣品中糖基化蛋白進行選擇性富集分離是糖蛋白組學(xué)研究的關(guān)鍵之一。

基于糖基化蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)，其富集方法主要由以下幾種：（1）凝集素親和色譜法，（2）親水色譜法，（3）硼酸親和色譜法，（4）酰肼化學(xué)法。其中凝集素色譜法特異識別某種糖型的糖蛋白、肽，酰肼化學(xué)高選擇性但反應(yīng)條件劇烈破環(huán)糖鏈結(jié)構(gòu)，硼酸化學(xué)較低選擇性和靈敏度，這些因素都限制了它們的廣泛應(yīng)用?；诮M分油-水兩相分配比不同的親水色譜，由于其操作簡單、廣譜富集及良好的質(zhì)譜兼容性，另外大多數(shù)糖肽比非糖肽親水，已經(jīng)引起廣泛的研究興趣。通常表面含有羥基、氨基、磺酸等極性基團的基質(zhì)可以作為親水色譜的基質(zhì)，例如瓊脂糖、纖維素、多糖與兩性離子聚合物已經(jīng)用于糖肽的分離富集。

近年來，由于功能化磁性材料良好的磁性分離、生物兼容性及較大的結(jié)合容量等性能，已經(jīng)被廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中蛋白、肽段分離富集。對于糖蛋白、肽分離富集，親水型磁性基質(zhì)的研究較少。報道的磁性親水型基質(zhì)主要是磁核包覆親水復(fù)合物如糖、兩性離子聚合物等，但是種類少、制備條件苛刻、操作繁瑣等問題有待解決。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，本發(fā)明提供一種親水型聚合物功能化磁性納米微球及其制備方法和應(yīng)用，以解決磁性親水型基質(zhì)種類少、制備條件苛刻、操作繁瑣的問題。

本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，該磁性納米微球是以四氧化三鐵為核心，對其表面雙鍵功能化以后，通過沉淀聚合反應(yīng)，于四氧化三鐵表面形成親水聚合物。

該磁性納米微球的制備方法，包括以下步驟：

（1）、溶劑熱法合成四氧化三鐵磁性納米微球：

取2.0-3.0g六水合三氯化鐵溶解于70-140ml乙二醇，超聲5min，得到黃色透明狀液體，再加入7.0-8.0g乙酸銨與0.6-1.0g檸檬酸三鈉，室溫下機械攪拌1h，將所得均勻溶液置于150-190℃油浴中攪拌1-2h，加熱至160-200℃，反應(yīng)12-24h，冷卻至室溫得顆粒，顆粒依次用無水乙醇和水清洗，于40-60℃下干燥12h得磁性納米微球；

（2）、磁性納米微球表面雙鍵修飾：取400-600mg磁性納米微球分散于50-60ml乙醇、10-12.5ml水的混合溶液中，超聲分散均勻，機械攪拌下，逐滴加入0.8-1.0ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5ml濃氨水，于60℃下反應(yīng)24h，所得產(chǎn)物用無水乙醇清洗，于40-60℃下干燥12h，得到雙鍵修飾磁性納米微球；

（3）、親水功能化磁性納米微球制備:

取50-100mg雙鍵修飾磁性納米微球分散于30-50ml乙腈-水混合液中，乙腈和水的體積比為6:4，向混合液中加入200-300mg單體甲基丙烯酰乙基磺基甜菜堿、50-75mg交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺和5-10mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈，超聲溶解后放入油浴鍋，經(jīng)20-30min由室溫加熱至沸騰，蒸餾出20ml溶液停止反應(yīng)，用磁鐵回收微球，依次用乙醇和水洗滌，40-60℃下干燥12h，即得。

該磁性納米微球作為吸附劑用于糖肽或糖蛋白的分離富集。

本發(fā)明組分簡單，易于生產(chǎn)，反應(yīng)條件溫和，高效高選擇性的分離富集，并可以應(yīng)用于復(fù)雜生物樣品中糖肽或糖蛋白的富集，經(jīng)濟和社會效益顯著。

附圖說明

圖1（a）為IgG酶解樣品直接上樣人血清免疫球蛋白酶解液中糖肽與非糖肽分布圖；

圖1（b）為IgG酶解樣品經(jīng)親水磁性納米微球富集后人血清免疫球蛋白酶解液中糖肽與非糖肽分布圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例和具體情況對本發(fā)明的具體實施方式做詳細說明，

本發(fā)明在具體實施中可由以下實施例給出：

實施例1：該磁性納米微球是以四氧化三鐵為核心，對其表面雙鍵功能化以后，通過沉淀聚合反應(yīng)，于四氧化三鐵表面形成親水聚合物。

該磁性納米微球的制備方法，包括以下步驟：

（1）、溶劑熱法合成四氧化三鐵磁性納米微球：

取2.70g六水合三氯化鐵溶解于140ml乙二醇，超聲5min，得到黃色透明狀液體，再加入7.70g乙酸銨與0.80g檸檬酸三鈉，室溫下機械攪拌1h，將所得均勻溶液置于170℃油浴中攪拌1h，加熱至200℃，反應(yīng)16h，冷卻至室溫得顆粒，顆粒依次用無水乙醇和水各清洗3次，于60℃下干燥12h得磁性納米微球；

（2）、磁性納米微球表面雙鍵修飾：取400mg磁性納米微球分散于50ml乙醇、12.5ml水的混合溶液中，超聲分散均勻，機械攪拌下，逐滴加入0.8ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5ml濃氨水，于60℃下反應(yīng)24h，所得產(chǎn)物用無水乙醇清洗3次，于50℃下干燥12h，得到雙鍵修飾磁性納米微球；

（3）、親水功能化磁性納米微球制備：

取50mg雙鍵修飾磁性納米微球分散于40ml乙腈-水混合液中，乙腈和水的體積比為6:4，向混合液中加入200mg單體甲基丙烯酰乙基磺基甜菜堿、50mg交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺和5mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈，超聲溶解后放入油浴鍋，經(jīng)20min由室溫加熱至沸騰，蒸餾出20ml溶液停止反應(yīng)，用磁鐵回收微球，依次用乙醇和水各洗滌3次， 60℃下干燥12h，即得。

該磁性納米微球作為吸附劑用于糖肽或糖蛋白的分離富集。

實施例2：該磁性納米微球是以四氧化三鐵為核心，對其表面雙鍵功能化以后，通過沉淀聚合反應(yīng)，于四氧化三鐵表面形成親水聚合物。

該磁性納米微球的制備方法，包括以下步驟：

（1）、溶劑熱法合成四氧化三鐵磁性納米微球：

取2.0g六水合三氯化鐵溶解于70ml乙二醇，超聲5min，得到黃色透明狀液體，再加入7.0g乙酸銨與0.6g檸檬酸三鈉，室溫下機械攪拌1h，將所得均勻溶液置于150℃油浴中攪拌1h，加熱至160℃，反應(yīng)12h，冷卻至室溫得顆粒，顆粒依次用無水乙醇和水各清洗3次，于40℃下干燥12h得磁性納米微球；

（2）、磁性納米微球表面雙鍵修飾：取400mg磁性納米微球分散于50ml乙醇、10ml水的混合溶液中，超聲分散均勻，機械攪拌下，逐滴加入0.8ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5ml濃氨水，于60℃下反應(yīng)24h，所得產(chǎn)物用無水乙醇清洗3次，于40℃下干燥12h，得到雙鍵修飾磁性納米微球；

（3）、親水功能化磁性納米微球制備:

取50mg雙鍵修飾磁性納米微球分散于30ml乙腈-水混合液中，乙腈和水的體積比為6:4，向混合液中加入200mg單體甲基丙烯酰乙基磺基甜菜堿、50mg交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺和5mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈，超聲溶解后放入油浴鍋，經(jīng)20min由室溫加熱至沸騰，蒸餾出20ml溶液停止反應(yīng)，用磁鐵回收微球，依次用乙醇和水各洗滌3次，40℃下干燥12h，即得。

該磁性納米微球作為吸附劑用于糖肽或糖蛋白的分離富集。

實施例3：該磁性納米微球是以四氧化三鐵為核心，對其表面雙鍵功能化以后，通過沉淀聚合反應(yīng)，于四氧化三鐵表面形成親水聚合物。

該磁性納米微球的制備方法，包括以下步驟：

（1）、溶劑熱法合成四氧化三鐵磁性納米微球：

取3.0g六水合三氯化鐵溶解于140ml乙二醇，超聲5min，得到黃色透明狀液體，再加入8.0g乙酸銨與1.0g檸檬酸三鈉，室溫下機械攪拌1h，將所得均勻溶液置于190℃油浴中攪拌2h，加熱至200℃，反應(yīng)24h，冷卻至室溫得顆粒，顆粒依次用無水乙醇和水各清洗3次，于60℃下干燥12h得磁性納米微球；

（2）、磁性納米微球表面雙鍵修飾：取600mg磁性納米微球分散于60ml乙醇、12.5ml水的混合溶液中，超聲分散均勻，機械攪拌下，逐滴加入1.0ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5ml濃氨水，于60℃下反應(yīng)24h，所得產(chǎn)物用無水乙醇清洗3次，于60℃下干燥12h，得到雙鍵修飾磁性納米微球；

（3）、親水功能化磁性納米微球制備:

取100mg雙鍵修飾磁性納米微球分散于50ml乙腈-水混合液中，乙腈和水的體積比為6:4，向混合液中加入300mg單體甲基丙烯酰乙基磺基甜菜堿、75mg交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺和10mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈，超聲溶解后放入油浴鍋，經(jīng)30min由室溫加熱至沸騰，蒸餾出20ml溶液停止反應(yīng)，用磁鐵回收微球，依次用乙醇和水各洗滌3次， 60℃下干燥12h，即得。

該磁性納米微球作為吸附劑用于糖肽或糖蛋白的分離富集。

在親水色譜模式下，高有機相上樣溶液中親水納米微球與蛋白酶解物樣品中的糖肽結(jié)合，通過洗滌除去非糖肽，而后通過洗脫液洗脫糖肽，所富集到的糖肽經(jīng)PNGase F酶切去糖鏈后釋放出的肽段或蛋白可直接用質(zhì)譜進行分析。

透射電鏡表征：四氧化三鐵磁球相對比較均一，粒徑主要分布在200-300 nm，進行親水功能化后形貌差異顯著，磁核表面包親水覆聚合較均勻，厚度約40 nm左右。

有關(guān)試驗資料如下：

一、樣品的制備：

（1）標準蛋白，稱取1 mg標準糖蛋白（IgG），溶解于1 mL 50 mmol L^-1碳酸氫銨（pH=8.3）溶液，沸水中加熱15 min進行變性，加入20 mmol二硫蘇糖醇，60 ℃孵育還原1 h。加入7.2 mg碘代乙酰胺，室溫下避光烷基化反應(yīng)40 min，按酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比為1: 40比率加入胰蛋白酶，37 ℃酶解16 h。酶解結(jié)束后，分裝凍干，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）五種標準混合糖蛋白（IgG, TRF, BF, COV, AGP），各取2 mg混合，首先用含8 M 尿素的100 mM 碳酸氫銨緩沖液（pH 8.3）溶解，然后40 mMDTT 在60 ℃時還原1 h，再加入20 mM IAA 室溫下避光反應(yīng)40 min。反應(yīng)結(jié)束后，加入100 mM 碳酸氫銨緩沖液（pH 8.3）將溶液中的尿素濃度稀釋至1 M ，隨后按照酶和底物的質(zhì)量比為1:40的比例加入胰蛋白酶，37 ℃下反應(yīng)16 h 。蛋白酶解液經(jīng)TFA酸化后除鹽，冷凍干燥后置于-20 ℃下保存。

(3) 人血清樣品的制備與五種標準混合糖蛋白相同。

二、蛋白樣品中糖肽的分離富集

（1）IgG蛋白酶解樣品中糖肽富集：稱取親水磁性納米微球50 μg用上樣液(ACN/H2O/TFA, 88 : 11.9 : 0.1, v/v/v)洗滌兩次，然后加入200 μL上樣液（含有2 μg IgG 酶解液），室溫孵育30 min，磁鐵回收材料，依次用上樣液（100μL）洗滌三次，除去非糖肽異吸附。然后加入20 μL洗脫液(ACN/H2O/TFA, 30 : 69.9 : 0.1, v/v/v)室溫孵育10 min，洗脫被吸附糖肽。收集洗脫液用MALDI-TOF MS分析。分析結(jié)果：如圖1(a)所示，IgG酶解樣品直接上樣分析，人血清免疫球蛋白酶解液中存在大量非糖肽，糖肽峰質(zhì)譜信號被高豐度非糖肽峰質(zhì)譜信號所抑制和掩蓋，MALDI-TOF MS質(zhì)譜圖中僅有兩個糖肽可以清晰鑒定。用親水磁性納米微球富集后如圖1(b)，絕大多數(shù)非糖肽信號消除，糖肽信號顯著增強。

（2）用于富集由五個標準蛋白酶解組成半復(fù)雜樣品，操作流程同標準蛋白，富集后樣品經(jīng)過去乙?；?，上樣10μg用nano LC-MS/MS進行分析。數(shù)據(jù)通過UniProt數(shù)據(jù)庫匹配篩選。五個蛋白總共23個N糖基化位點鑒定，親水磁球富集后鑒定到所有特征N糖基化位點中的17個，五個目標糖蛋白均被鑒定，鑒定到糖基化位點覆蓋了絕大多數(shù)特征位點。以上結(jié)果再次證明親水磁性納米微球?qū)μ请膬?yōu)良的富集能力。

（3）把親水磁球用于人血清中N糖基化蛋白組學(xué)分析。將1μL血清用親水磁球富集后，用PNGase F酶切除糖鏈后，凍干后用0.1% FA復(fù)溶，用nano LC-MS/MS分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索，根據(jù)肽段序列匹配鑒別N糖基化肽段，若肽段序列為NXS/T且X不為脯氨酸，則認證為N糖基化肽段。三次實驗重復(fù)總共鑒定到347個N糖基化位點、414條糖肽和159個糖蛋白。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

(1)采用蒸餾沉淀聚合以甲基丙烯酰乙基磺基甜菜堿兩性離子為單體制備親水型磁性納米微球，制備方法簡單，親水磁性納米微球復(fù)合物呈規(guī)則的核殼結(jié)構(gòu)，且具有良好的親水性，水接觸角為31度。

(2)甲基丙烯酰乙基磺基甜菜堿已被大量文獻證實具有良好的生物兼容性，所以本發(fā)明所制備的親水型聚合物功能化磁性納米微球具有良好的生物兼容性。

(3)磁性納米微球的超順磁性使得材料在外磁場作用下容易從溶液中分離出來，磁場撤銷后容易分散開，因而操作簡單，操作過程綠色環(huán)保，而且可以減少離心等前處理步驟帶來的樣品損失。

(4）磁性納米微球有較大的比表面積，且親水復(fù)合物呈規(guī)則核殼結(jié)構(gòu)，使得磁性親水納米微球具備了高效的富集能力，對富集糖肽有良好的選擇性、高靈敏度，對糖肽的富集容量為40μg mg^-1。