本發(fā)明涉及一種肝細胞交聯(lián)劑材料，該材料用于體外三維肝細胞的培養(yǎng)，屬于組織工程領(lǐng)域。

技術(shù)背景

目前，全球的原發(fā)性肝癌死亡率在惡性腫瘤中居第三位，我國肝癌的發(fā)病率和死亡率均占全球的半數(shù)以上(L.A.Torre,F.Bray,R.L.Siegel,J.Ferlay,J.Lortet-Tieulent,A.Jemal,Global cancer statistics,2012,CA.Cancer J.Clin.65(2015)87–108.doi:10.3322/caac.21262.)。近年來隨著手術(shù)技術(shù)的進步和規(guī)范的放化療方案的推廣,肝癌的臨床治療水平有了很大提高,但肝癌的5年生存率并未得到有效改善。究其原因,除了肝癌高侵襲性和易復發(fā)的惡性特征外,臨床藥物治療的局限性也是制約肝癌治療效果的重要因素。導致上述現(xiàn)象的主要原因是現(xiàn)有藥物篩選系統(tǒng)中常用的體外腫瘤細胞模型難以模擬體內(nèi)腫瘤組織的生長方式和行為特點,因此導致臨床試驗結(jié)果與前期體外實驗結(jié)果相去較遠。臨床前體外腫瘤細胞模型通常建立在傳統(tǒng)2D細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上,這種培養(yǎng)方法難以模擬體內(nèi)腫瘤立體生長模式,不易形成促腫瘤生長的局部微環(huán)境,因此也無法如實反映體內(nèi)腫瘤的生物學行為和對藥物的反應(yīng)性。

文獻證實,在癌癥研究中三維細胞培養(yǎng)(three-dimensional cell culture，3D)方法可以彌補二維細胞培養(yǎng)無法模擬細胞體內(nèi)生存環(huán)境的缺陷,并可實現(xiàn)腫瘤干細胞的體外分離和擴增(Fitzgerald K A,Malhotra M,Curtin C M,et al.Life in 3D is never flat:3D models to optimise drug delivery[J].Journal of controlled release:official journal of the Controlled Release Society,2015,215,39-54)。與二維的單層細胞培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)的細胞的形態(tài)和功能更加類似于生物體內(nèi)的組織和器官。因此，三維細胞培養(yǎng)作為體外細胞模型能夠更好的模擬體內(nèi)真實的細胞外生理環(huán)境，在藥物研發(fā)過程中可以有效提高藥物研發(fā)的成功率，降低新藥研發(fā)的成本(Elliott,Nelita T.；Yuan,Fan.A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies[J].Journal of pharmaceutical sciences,2011,100(1):59-74)。同時，由于三維培養(yǎng)細胞的近似于生物體內(nèi)細胞生理功能的特點，有望被用于混合人工器官的構(gòu)建(Mironov V,Kasyanov V,Drake C,Markwald RR，organ printing:From bioprinter to organ biofabrication line[J].Current opinion in Biotechnology,2011,22(5):667-673)。

傳統(tǒng)的三維細胞培養(yǎng)方法有：細胞支架培養(yǎng)，微流體法和水凝膠法(Jun Yanga M G,HirohikoIsec,Chong-SuChod,Toshihiro Akaikea,c,.Galactosylated alginate as a scaffold for hepatocytes entrapment[J].Biomaterials,2002,23(471-479；Xu Z,Gao Y,Hao Y,et al.Application ofa microfluidic chip-based 3D co-culture to test drug sensitivity for individualized treatment oflung cancer[J].Biomaterials,2013,34(16):4109-4117；Wang Y,Wang J.Mixed hydrogel bead-based tumor spheroid formation and anticancer drug testing[J].The Analyst,2014,139(10):2449-2458)。細胞支架培養(yǎng)法雖然能夠培養(yǎng)出具有三維結(jié)構(gòu)的細胞在細胞活性、生理行為等方面較2D細胞培養(yǎng)表現(xiàn)出顯著的改善，但是無法精確的控制細胞培養(yǎng)過程中的各個變量；微流體法進行三維細胞培養(yǎng)，雖然可以實現(xiàn)高通量的培養(yǎng)以及多組織的共培養(yǎng)，但是微流體培養(yǎng)法需要較為精細的實驗裝置，導致成本較高，一直限制了微流體法進行三維細胞培養(yǎng)的廣泛應(yīng)用；水凝膠培養(yǎng)法在材料的制備上，步驟繁雜，實驗靈活性差。以上三種傳統(tǒng)的三維細胞培養(yǎng)方法存在批次的差異，缺乏可重復性，無法滿足實驗中對科學、可重復性實驗結(jié)果獲取的要求，并且細胞球制備周期較長，影響著三維細胞模型在實驗中的廣泛應(yīng)用。為加快三維細胞培養(yǎng)環(huán)境的構(gòu)建，細胞交聯(lián)劑法作為一種新的三維細胞培養(yǎng)方法具有實驗操作簡單易行等優(yōu)點，有望成為簡便有效的三維肝細胞培養(yǎng)方法。前人報道的樹枝狀細胞交聯(lián)劑具有促進細胞聚集的能力，但是該方法需要對細胞膜進行化學修飾，這會對細胞產(chǎn)生損傷，同時，樹枝狀大分子的合成復雜，使該方法(Deqiang Zhao,Siew-Min Ong,Zhilian Yue,Dendrimer hydrazides as multivalent transient inter-cellular linkers[J].Biomaterials,2008,29,3693-3702)具有使用的局限性；另外也有研究者們通過將與細胞膜具有相互作用的功能性配體(如油基、RGD、特異性配體等)修飾在線性PEG鏈兩端用于橋連細胞(Michiko Ito,Tetsushi Taguchi；Enhanced insulin secretion of physically crosslinked pancreaticβ-cells by using a poly(ethylene glycol)derivative with oleyl groups[J].ActaBiomaterialia,2009,5,2945-2952；Zhi Rao,Makoto Sasaki,Tetsushi Taguchi；Development of amphiphilic,enzymatically-degradable PEG-peptide conjugate as cell crosslinker for spheroid formation[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2013，101，223-227)。但該體系存在以下缺點：線性PEG鏈雙端必須完全功能化，反應(yīng)條件控制困難；交聯(lián)劑與細胞單位點作用，結(jié)合能力較差；兩端的功能基團作用在同一個細胞幾率較大，從而降低了細胞的橋連率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：解決現(xiàn)有三維細胞培養(yǎng)技術(shù)中交聯(lián)劑結(jié)構(gòu)控制嚴格，合成條件苛刻，交聯(lián)劑與細胞結(jié)合能力弱，細胞交聯(lián)率低等問題。設(shè)計一種基于簡便有效的三維肝細胞模型的構(gòu)建方法，既可以高效的構(gòu)建三維細胞培養(yǎng)環(huán)境，也可以進行大批量的三維細胞模型的制備；提供一種用于三維肝細胞培養(yǎng)的細胞交聯(lián)劑材料。利用細胞交聯(lián)劑進行三維細胞培養(yǎng)是一種理想的三維細胞培養(yǎng)的方法，通過細胞交聯(lián)劑拉近細胞間的距離，從而使得細胞的聚集形成三維的細胞培養(yǎng)環(huán)境。

本設(shè)計將具有良好肝細胞相容性的甘草次酸衍生物修飾到海藻酸鈉側(cè)基，使得每條交聯(lián)劑鏈上存在多個配體，從而使得交聯(lián)劑與細胞間形成多點相互作用，有效解決了單位點交聯(lián)劑橋連率低、細胞結(jié)合力不足的問題。此外，該方法對功能基團的修飾量也不需要進行嚴格的控制，還可通過調(diào)整配體種類、修飾量等調(diào)整細胞球的功能。因此本文首先制備了甘草次酸修飾的海藻酸鈉，并以其為細胞交聯(lián)劑并通過簡單的共混方法獲得了具有良好生理功能的肝細胞球。

本發(fā)明技術(shù)方案

一種用于三維肝細胞球培養(yǎng)的細胞交聯(lián)劑材料，所述的細胞交聯(lián)劑材料是以多糖海藻酸鈉(ALG)或磺化殼聚糖(SCTS)為載體，將親水改性后的甘草次酸(GA-N(CH₃)₂)修飾到海藻酸鈉(ALG)或磺化殼聚糖(SCTS)上制備而成，表達式分別為為ALG-GA-N(CH₃)₂或SCTS-GA-N(CH₃)₂，其結(jié)構(gòu)分別為：

具體是：將能夠與肝細胞膜相互作用的配體甘草次酸(GA)進行親水性改性，即通過在羥基上引入叔胺基團作為水溶性基團對GA進行親水改性，通過酯化反應(yīng)在甘草次酸的羥基上重新引入羧基，以便于向海藻酸鈉(ALG)和磺化殼聚糖(SCTS)上修飾，最后利用乙二胺為連接臂通過羧基的酰胺化反應(yīng)將親水改性后的甘草次酸(GA-N(CH₃)₂)修飾到海藻酸鈉糖鏈上，制備了甘草次酸衍生物修飾的海藻酸鈉，為ALG-GA-N(CH₃)₂，取代度DS＝2％-12％；

殼聚糖(Chitosan)和海藻酸鈉(Sodium alginate)都是天然聚多糖。殼聚糖鏈上氨基基團的存在，在特定條件下，殼聚糖能發(fā)生烷基化、?；?、羧甲基化、磺化、硝化、鹵化、氧化、還原、縮合和絡(luò)合等反應(yīng)，可以生成各種具有不同性能的殼聚糖衍生物。因此本發(fā)明通過改性甘草次酸的羧基和磺化殼聚糖上的胺基進行酰胺化反應(yīng)直接將改性甘草次酸修飾到磺化殼聚糖的糖鏈上，制備了甘草次酸衍生物修飾的磺化殼聚糖SCTS-GA-N(CH₃)₂，取代度為DS＝2％-10％，同樣可以實現(xiàn)三維肝細胞的構(gòu)建。

本發(fā)明所述細胞交聯(lián)劑材料ALG-GA-N(CH₃)₂的制備方法的具體步驟見實施例1；SCTS-GA-N(CH₃)₂的制備方法的具體步驟見實施例2。

本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果：

本發(fā)明和已有技術(shù)相比具有以下特點：本發(fā)明以胺基改性甘草次酸(GA-N(CH₃)₂)作為肝細胞親和配體，不僅保留了其肝靶向能力而且顯著提高了其親水性，有利于細胞交聯(lián)劑的實際應(yīng)用；將GA-N(CH₃)₂引入到海藻酸鈉主鏈，通過與肝細胞簡單共混即可以有效的促進細胞的聚集，加快三維肝細胞球的制備；該細胞交聯(lián)劑無需精確控制GA-N(CH₃)₂的取代度以及交聯(lián)劑的分子量，與現(xiàn)有細胞交聯(lián)劑相比在實際應(yīng)用中具有更大的優(yōu)勢。本發(fā)明可能作為一種用于三維細胞培養(yǎng)的細胞交聯(lián)劑，在組織工程領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。

相對于已有的細胞交聯(lián)劑，這種將可與肝細胞膜相互作用的配體修飾到高分子鏈側(cè)基上的交聯(lián)劑為細胞提供結(jié)合位點，并且不需要對功能性配體的數(shù)量進行嚴格的限制，并且由于一條高分子鏈上可以修飾多個配體，有效增強了交聯(lián)劑與細胞的相互作用。并且通過細胞攝取實驗證明改性后的GA對肝細胞具有較好的選擇性；由MTT測試結(jié)果可以知道本發(fā)明所制備的肝細胞交聯(lián)劑材料具有較好的生物相容性；活/死細胞染色實驗可以證明細胞球內(nèi)部細胞的活性。因此簡單將HepG2細胞與ALG-GA-N(CH₃)₂懸浮共培養(yǎng)，可以有效促進細胞的聚集，加快三維肝細胞球的構(gòu)建。

附圖說明

圖1是GA的親水改性合成圖。

圖2是合成細胞交聯(lián)劑的合成圖。

圖3是殼聚糖硫酸酯的合成示意圖。

圖4是SCTS-GA-N(CH₃)₂DE合成示意圖。

圖5是HepG2細胞與Hela細胞的流式結(jié)果對比圖。

圖6是ALG-GA-N(CH₃)₂的MTT測試結(jié)果圖。

圖7是細胞共培養(yǎng)24h后細胞形態(tài)圖，A,B,C,D為ALG-GA-N(CH₃)₂樣品，E,F為ALG對照組。

圖8是培養(yǎng)細胞的AO/EB染色結(jié)果圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

本說明書中公開的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個特征只是一系列等效或類似的特征中的一個例子而已。

實施例1、肝細胞交聯(lián)劑ALG-GA-N(CH₃)₂的制備

步驟1、GA親水改性：

GA-N(CH₃)₂的合成

將5.3g DCC和3.4g HOBt溶于二氯甲烷中，室溫下攪拌30min。向溶液中加入10g GA(化合物1)，攪拌20min。之后加入2.3mLN，N-二甲基乙二胺，室溫條件攪拌12h。反應(yīng)液利用旋蒸儀除去溶劑后使用色譜柱(體積比：CH₂Cl2:MeOH:NH₃H₂O＝15:1:1)提純，之后將產(chǎn)物溶解于乙酸乙酯中，0℃下靜置2h，過濾，濾液蒸干、真空干燥后得到白色粉末狀產(chǎn)物即化合物2(10.6g,92％)。

步驟2、肝細胞交聯(lián)劑ALG-GA-N(CH₃)₂(DS＝12％)的制備：

第1、scu-GA-N(CH₃)₂的合成

將3.2g化合物GA-N(CH₃)₂(化合物2)溶于30mL吡啶中，依次加入4.7g丁二酸酐，7.7g DMAP，90℃下加熱12h，得黑色粘稠液體，先加入一定量的二氯甲烷稀釋，然后利用稀鹽酸洗滌，將得到的二氯甲烷溶液濃縮后使用色譜柱洗脫，首先使用CH₂Cl₂:MeOH:NH₃H₂O＝15:1:1的洗脫液除去DMAP與未反應(yīng)的化合物2，之后使用CH₂Cl₂:MeOH:NH₃H₂O＝15:5:1洗脫得到棕色產(chǎn)物即化合物3(2.4g,65％)。

第2、N-GA-N(CH₃)₂的合成

將2.7g化合物scu-GA-N(CH₃)₂(化合物3)溶于20mL的二氯甲烷中，控制溫度在-10℃條件下，向溶液中加入1.05g DCC反應(yīng)30min，加入0.57g NHS投料摩爾比為M化合物3:MDCC:MNHS＝1:1.2:1.2，室溫攪拌12h；過濾除去DCU，將濾液滴加到30mL,含有70％乙二胺的二氯甲烷溶液中，室溫攪拌12h，反應(yīng)體系用稀鹽酸溶液洗滌一次，濃縮后使用色譜柱提純CH₂Cl₂:MeOH:NH₃H₂O＝15:1:1，得到白色粉末狀產(chǎn)物即N-GA-N(CH₃)₂(化合物4)(1.0g,40％)。

第3、ALG-GA-N(CH₃)₂的合成

將30mL濃度為0.6M的HCl加入到30mL乙醇中，再將2.0gALG-Na加入到混合溶液中，在4℃攪拌過夜；抽濾得到ALG-H，依次用乙醇，丙酮洗滌，在40℃真空干燥過夜；將干燥后的海藻酸分散在100mL蒸餾水中，在攪拌條件下逐滴滴加四丁基銨堿(TBAOH)到聚合物完全溶解，調(diào)節(jié)pH為7.0-10.0，透析，凍干得到白色的ALG-TBA；將1.0gALG-TBA溶于DMF中，冰浴條件下加入0.3g 2-氯-1-甲基吡啶(CMPI)，在N₂環(huán)境下攪拌反應(yīng)1h，撤去冰浴，加入0.8g化合物4并滴加適量的三乙胺，常溫反應(yīng)24h。加入30.0mL，2.5mol/L的NaCl溶液；將所得液體在乙醇中沉淀，過濾，洗滌，重新溶于蒸餾水中，轉(zhuǎn)入透析袋(截留分子量M_w＝3500)中透析兩天，凍干，得白色海綿狀固體即取代度為12％的ALG-GA-N(CH₃)₂。

步驟3、肝細胞交聯(lián)劑ALG-GA-N(CH3)2(DS＝8％)的制備：

方法同步驟2，其中ALG-TBA投料為：1.0g，2.2mmol；N-GA-N(CH₃)₂投料為：0.5g，0.731mmol。

步驟4、肝細胞交聯(lián)劑ALG-GA-N(CH3)2(DS＝4％)的制備：

方法同步驟2，其中ALG-TBA投料為：1.0g，2.2mmol；N-GA-N(CH₃)₂投料為：0.3g，0.439mmol。

步驟5、肝細胞交聯(lián)劑ALG-GA-N(CH3)2(DS＝2％)的制備：

方法同步驟2，其中ALG-TBA投料為：1.0g，2.2mmol；N-GA-N(CH₃)₂投料為：0.15g，0.220mmol。

實施例2、肝細胞交聯(lián)劑SCTS-GA-N(CH3)2的制備：

1、SCTS的合成

殼聚糖硫酸酯的合成示意圖如附圖3所示，在500mL的三口瓶中加入45mL的HSO₃Cl，在冰浴條件下，將90mL濃度為98％的濃硫酸緩慢的滴加到三口瓶中，攪拌15min。提高攪拌速度，將將3g殼聚糖固體緩慢的加入到反應(yīng)體系中，大約10min后，待體系穩(wěn)定后，撤去冰水浴；室溫反應(yīng)2h后，停止反應(yīng)；將反應(yīng)液緩慢滴加到1000mL的冰乙醚中(-26℃下令藏3h)中沉淀。然后，將沉淀減壓抽濾，先用乙醚洗滌一次，再用丙酮多次洗滌，收集固體并用適量的蒸餾水溶解，用1M NaOH調(diào)節(jié)pH至中性；之后將樣品溶液轉(zhuǎn)入透析袋(M_w＝12-14KD)中，對蒸餾水透析3天后，將透析液凍干得到淡黃色的固體即為合成的殼聚糖硫酸酯，產(chǎn)率為94％。

2、SCTS-GA-N(CH₃)₂的制備

SCTS-GA-N(CH₃)₂的制備反應(yīng)式如附圖4所示，稱取225mg SCTS，溶解在5mL水中，然后稱取256mg scu-GA-N(CH₃)₂，92mg EDC和55.2mg NHS溶解在45mL的DMF中，再將溶解好的溶液加入到SCTS的水溶液中，投料比為：MSuc-GA:MEDC:MNHS＝1:1.2:1.2?？刂茰囟仍?5℃條件下攪拌24h，反應(yīng)結(jié)束，用丙酮進行沉淀，過濾，凍干，得到產(chǎn)物即SCTS-GA-N(CH₃)₂。

實施例3、細胞攝取實驗：

(1)取對數(shù)生長期的HepG2細胞，用胰酶消化1min后，加入1mL的DMEM細胞培養(yǎng)基中和胰酶，吹打細胞使其從培養(yǎng)皿中剝離下來，轉(zhuǎn)入離心管中，離心后棄去培養(yǎng)基，重新移取新的DMEM培養(yǎng)基1mL，吹打使細胞分散均勻，計數(shù)，并按每孔2×10⁵個細胞的密度接種到12孔細胞培養(yǎng)盤中，用1mL移液槍將細胞吹打均勻，在37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

(2)用移液槍移走培養(yǎng)基，用PBS緩沖溶液洗滌一次。然后，加入按照1：1體積比混合的納米粒子溶液1mL。將其放置在37℃的細胞培養(yǎng)相中培養(yǎng)4h。

(3)用移液槍移走培養(yǎng)基，用PBS緩沖溶液洗滌三次，每次5min，1mL/盤，最后全部移除。加入200μL的胰酶消化，再加入200μL的DMEM培養(yǎng)基中和，用移液槍吹打細胞使其剝離。

(4)用移液槍將細胞混合液轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，再用200μL的DMEM培養(yǎng)基沖洗孔板，也轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中。

(5)調(diào)整轉(zhuǎn)速為800r/min，離心5min。棄掉上清液，重新加入900μL的PBS緩沖溶液，并用移液槍吹打細胞使其充分分散開。

(6)利用流式細胞儀進行檢測，以PBS與DMEM為等體積混合的培養(yǎng)基為空白對照組；以Hela細胞為平行對照組。

結(jié)果見附圖5，由圖可知HepG2細胞經(jīng)與納米粒子共培養(yǎng)后整體向右熒光強度高的方向平移，說明HepG2細胞整體對納米粒子都有攝取且攝取較為平均；由此也體現(xiàn)了HepG2細胞對納米粒子的攝取是由兩者之間的相互作用介導的。而Hela細胞經(jīng)過共培養(yǎng)后，部分細胞群與空白對照組的峰重疊，說明其中的細胞對納米粒子的攝取量為零；同時，也有部分細胞的群的熒光強度峰向右平移，說明細胞對納米粒子有攝??；但是，細胞攝取的熒光強度卻不是單峰，說明了細胞對納米粒子攝取的不均勻性。所以，改性后的GA對肝細胞具有較好的選擇性。

實施例3、MTT實驗：

HepG2細胞的接種密度為0.8×10⁴cells/孔，DMEM培養(yǎng)基400μL，細胞于37℃,5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育24h，然后，分別將配置好的樣品的DMEM溶液濃度依次為1mg/L，2mg/L，4mg/L加入到培養(yǎng)盤中，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，棄去上層培養(yǎng)基，用PBS洗去死細胞，加入含有0.5mg/mL的MTT的DMEM培養(yǎng)基400μL繼續(xù)孵育，4h后棄去上層溶液，加入150μL的DMSO充分溶解甲臢沉淀，然后取出80μL加到96孔板中，使用酶標儀在540nm處測定各孔的吸光度，即OD值。每種材料平行3孔，實驗重復2次。數(shù)據(jù)以mean+SD表示，作t檢測，P<0.05認為有顯著性差異。見附圖6，由實驗結(jié)果可知，制備的材料有良好的細胞相容性。

實施例4、肝細胞球交聯(lián)劑細胞成球?qū)嶒灒?/p>

本發(fā)明中細胞實驗均為HepG2細胞，HepG2細胞來源于人肝癌組織，廣泛用于肝組織工程的體外研究中。使用的培養(yǎng)基為90％的DMEM培養(yǎng)液加10％的胎牛血清，再加1％的雙抗，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，5％CO₂)。將制備的不同取代度的交聯(lián)劑以不同濃度溶解在DMEM細胞培養(yǎng)基中，然后將細胞栽種到六孔PS細胞培養(yǎng)盤中，40萬cell/孔，2mL培養(yǎng)基每孔，培養(yǎng)24h后觀察細胞形態(tài)。見附圖7。不同取代度及濃度樣品形成細胞球情況如表一所示，其中，在取代度為4％時，成球大小均一，細胞形態(tài)良好，此時形成細胞球效果最好。

表一、不同取代度及濃度樣品形成細胞球情況

注：–表示不能形成細胞球；√表示可以形成細胞球

實施例5、AO/EB染色實驗：

配置濃度均為50μg/mL的AO/EB混合溶液，棄去細胞培養(yǎng)基，加入已配置好的AO/EB染色液，細胞培養(yǎng)箱中孵化15min(37℃，5％CO₂)，利用倒置熒光顯微鏡觀察細胞存活情況。見附圖8，由圖可知細胞球內(nèi)的細胞有良好的細胞活性。