本發(fā)明涉及一種豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒單鏈抗體及其制備方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的急性、高度接觸性傳染性傳染病，豬感染TGEV主要臨床癥狀為嘔吐、水樣腹瀉和脫水。TGE首先在1946年首次由Dolye和Hutching在美國報(bào)道，隨后在歐洲、美洲、亞洲等多個(gè)國家相繼報(bào)道發(fā)生病例，現(xiàn)在已經(jīng)成為一種全世界性豬的疾病。同時(shí)TGE發(fā)病率高，各年齡段的豬均可發(fā)病，尤其是兩周齡內(nèi)仔豬，死亡率高達(dá)100％。PED的頻發(fā)給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗接種是預(yù)防本病發(fā)生的途徑之一，但是已研制出的PED滅活和弱毒疫苗效果并不理想。單鏈抗體是一種基因工程抗體，以其分子量小、特異性高、穿透力強(qiáng)、易于改造等特點(diǎn)，顯示了巨大的應(yīng)用潛力，越來越受到人們的重視。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒的基因工程單鏈抗體，該單鏈抗體能夠與豬傳染性胃腸炎病毒特異性結(jié)合，可用于阻斷豬傳染性胃腸炎病毒的感染和入侵。

本發(fā)明提供的一種豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒的單鏈抗體，所述單鏈抗體具有如SEQ ID No.1所示的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列、如SEQ ID No.2所示的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列和位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之間的連接肽；所述連接肽為(GGGGSGGGGSGGGGS)。

上述單鏈抗體具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

本發(fā)明的另一目的是提供一種編碼上述豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒的單鏈抗體的基因，其具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

為了方便地對(duì)單鏈抗體篩選和表達(dá)純化，在上述序列的基礎(chǔ)上進(jìn)一步設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)和識(shí)別序列，進(jìn)一步含有內(nèi)切酶位點(diǎn)SfiI和NotI識(shí)別序列，SfiI的序列為GGCCCAGCCGGCC，NotI的序列為GCGGCCGC。

本發(fā)明還提供一種表達(dá)上述豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒的單鏈抗體的表達(dá)載體，所述載體為原核表達(dá)載體。優(yōu)選的，所述載體為pCANTAB-5e-ScFv載體。

本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒的單鏈抗體的方法，具體步驟如下：

(1)采用RT-PCR法直接從豬傳染性胃腸炎病毒感染的豬外周血RNA中擴(kuò)增出抗體編碼基因的重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因；

(2)利用SOE-PCR法將連接肽與重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因相連構(gòu)建豬源性單鏈抗體基因；

(3)將步驟(2)的豬源性單鏈抗體基因克隆到噬菌粒載體中，構(gòu)建重組噬菌粒；

(4)將步驟(3)的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入E.coli TG1感受態(tài)細(xì)胞(北京普如汀生物技術(shù)有限公司)，培養(yǎng)、建立噬菌體單鏈抗體庫；

(5)將步驟(4)表達(dá)的單鏈抗體用豬傳染性胃腸炎病毒作為包被抗原，進(jìn)行富集淘選，陽性克隆即為抗豬傳染性胃腸炎病毒單鏈抗體的噬菌體。

(6)將步驟(5)所得陽性單鏈抗體噬菌體，即獲得所述豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒的單鏈抗體。

本發(fā)明的技術(shù)原理是采用RT-PCR直接從豬傳染性胃腸炎病毒感染的豬外周血RNA中擴(kuò)增出抗體編碼基因的重鏈可變區(qū)(VH)基因和輕鏈可變區(qū)(VL)基因。利用SOE-PCR(重組鏈延伸反應(yīng))法將linker與VH基因和VL基因相連構(gòu)建豬源性單鏈抗體(ScFv)基因，并將其克隆到噬菌粒載體pCANTAB5e中，phage-ELISA篩選抗ETEC單鏈抗體的陽性克隆，測(cè)序后使用DNAstar的MegAlin進(jìn)行序列分析，證明該單鏈抗體屬于豬源性抗豬傳染性胃腸炎病毒的單鏈抗體。

和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：抗豬傳染性胃腸炎病毒的基因工程抗體能與豬傳染性胃腸炎病毒特異性結(jié)合，能夠用于豬傳染性胃腸炎病的預(yù)防和治療。

附圖說明

圖1為VH-Linker-VL PCR電泳圖；M為2000bp DNA ladder marker；1、2為VH-Linker-VL基因PCR產(chǎn)物。

圖2為pCANTAB5e-ScFv雙酶切鑒定；M為2000bp DNA ladder marker；1、2為重組質(zhì)粒經(jīng)Sfi I和Not I雙酶切。

圖3為重組原核表達(dá)載體pCANTAB5e-ScFv質(zhì)粒圖譜。

圖4為噬菌體抗體庫的多樣性分析。

圖5為抗傳染性胃腸炎病毒單鏈抗體的純化電泳圖；M為預(yù)染蛋白Marker；1為純化后的單鏈抗體。

圖6為單鏈抗體對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒的體外中和效果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例中各步驟采用的實(shí)驗(yàn)材料均為正規(guī)公司獲得的標(biāo)準(zhǔn)材料,所用方法均為標(biāo)準(zhǔn)試劑盒產(chǎn)品說明書所述方法(見相應(yīng)的實(shí)施例),各步驟獲得的中間產(chǎn)品及最后的終產(chǎn)品均經(jīng)過多次試驗(yàn)證明可以重復(fù)獲得,其生物學(xué)性質(zhì)保持穩(wěn)定一致。說明本發(fā)明各試驗(yàn)步驟所涉及的中間產(chǎn)品和終產(chǎn)品均可以按照本發(fā)明所陳述的發(fā)法準(zhǔn)確獲得。

實(shí)施例1豬源性抗傳染性胃腸炎病毒的單鏈抗體的制備

1：對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)腹瀉癥狀的仔豬進(jìn)行豬傳染性胃腸炎病毒抗原檢測(cè)(陽性抗原系本實(shí)驗(yàn)室保存的TGEV毒株)，用常規(guī)(參照F.M.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》)ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)大于1:20000時(shí)，采集該豬血液，裂解紅細(xì)胞后獲得白細(xì)胞(紅細(xì)胞裂解液上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，用Trizol法(TRIZOL Reagent購自美國Invitrogen公司)提取總RNA。以提取的總RNA為模版，采用Oligo primer，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(cDNA第1鏈合成試劑盒購自TaKaRa公司)的產(chǎn)品說明操作步驟，合成第1鏈cDNA。

2：對(duì)GenBank已公布的豬抗體編碼基因重鏈可變區(qū)序列(AF064686.1；AF064687.1；AF064688.1；AF064689.1；AF064690.1)和輕鏈可變區(qū)序列(KF561242.1；GQ867594.1；GQ867595.1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增抗體輕、重鏈的引物(表1)，其中VH1F分別與VH1R、VH2R用于擴(kuò)增VH區(qū)；VL1F、VL2F、VL3F和VL1R用于擴(kuò)增VL區(qū)；VH3F、VH3R用于VH基因加入酶切位點(diǎn)和Linker序列；VL4F、VL5F、VL6F在VL1F、VL2F、VL3F擴(kuò)增的VL基因基礎(chǔ)上加入酶切位點(diǎn)，VL2R用于VL基因加入Linker序列。其中，VH3F含有Sfi I酶切位點(diǎn)，VL 2R含有Not I酶切位點(diǎn)；VH3R、VL4F、VL5F、VL6F含互補(bǔ)的Linker序列(酶切位點(diǎn)和Linker序列在表1中用下劃線標(biāo)示出)。Linker采用(GGGGS)₃，其對(duì)應(yīng)的編碼核苷酸序列為：GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGGTCT。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 擴(kuò)增抗體可變區(qū)的引物及其擴(kuò)增片段大小

注：下劃線代表Sfi I或Not I酶切位點(diǎn)，方框代表連接肽序列。

3：VH和VL基因的擴(kuò)增

以cDNA為模版，VH1F、VH1R為引物擴(kuò)增VH基因。引物VL1F、VL2F、VL3F分別與引物VL1R配對(duì)，擴(kuò)增VL基因。PCR反應(yīng)體系為25μL：2×PCR mix12.5μL，模版cDNA 2μL，上下游引物(25μM)各1μL，ddH₂O 8.5μL。擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性3min；94℃變性40s，50℃退火40s，72延伸1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定產(chǎn)物并回收目的基因(根據(jù)Thermo公司提供的膠回收說明書操作)。

4：ScFv基因的獲得

分別以VH和VL基因?yàn)槟０?，VH2F、VH2R為引物PCR擴(kuò)增帶有Linker的重鏈可變區(qū)基因，VH4F、VL5F、VL 6F分別與VL2R配對(duì)，PCR擴(kuò)增帶有Linker的輕鏈可變區(qū)基因，PCR條件同上。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收目的基因(含有Linker序列的VH和VL基因)。以VH2 F、VL 2R為引物，通過重組鏈延伸反應(yīng)(SOE-PCR)將含有Linker序列的VH和VL基因連接為ScFv基因，并加入Sfi I和Not I酶切位點(diǎn)，VH-Linker-VL擴(kuò)增產(chǎn)物大小為714bp(見圖1)。

5：豬源性ScFv噬菌體原始文庫的構(gòu)建

根據(jù)常規(guī)分子克隆方法(參照J(rèn).薩姆布魯克等主編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)，ScFv基因和pCANTAB-5e載體分別經(jīng)Sfi I和Not I雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳并用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物(見圖2)。將ScFv基因插入pCANTAB-5e載體(北京普如汀生物技術(shù)有限公司)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒(見圖3)，并將其電轉(zhuǎn)化E.coliTG1感受態(tài)細(xì)胞(北京普如汀生物技術(shù)有限公司)，連續(xù)電轉(zhuǎn)化50次，構(gòu)建豬源性ScFv噬菌體原始文庫。挑取單克隆菌落PCR驗(yàn)證其陽性率，菌落PCR驗(yàn)證正確的克隆進(jìn)行測(cè)序分析來確定文庫的多樣性(見圖4)。

6：ScFv的富集篩選

取密度梯度離心獲得的高濃度豬傳染性胃腸炎病毒(本實(shí)驗(yàn)室保存)，用抗原包被液(50mmol/L碳酸氫鈉鹽溶液，pH＝9.6)稀釋至5μg/mL，加入96孔板，每孔100μL，4℃包被過夜；每孔加入5％脫脂奶粉溶液200μL，37℃封閉1h，PBS洗滌3次；每孔加入100μL噬菌體ScFv原始文庫，37℃孵育2h，PBS洗滌10次；每孔加入洗脫緩沖液(Gly-HCl pH＝2.2)100μL洗脫，再加入50μL(Tris-HCl pH＝9.0)進(jìn)行中和。將部分洗脫的噬菌體感染對(duì)數(shù)生長期的大腸桿菌TG1，測(cè)定第一輪的捕獲的噬菌體滴度，其余洗脫的噬菌體進(jìn)行第二輪富集篩選；捕獲的噬菌體滴度需要達(dá)到10⁶cfu/mL；挑取最后一輪淘選的單菌落，即為抗豬傳染性胃腸炎病毒的陽性ScFv菌落。

7：ScFv的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取陽性ScFv菌落至含氨芐抗生素(終濃度為100μM)和葡萄糖(終濃度為(2M)的2YT液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)，菌液OD₆₀₀至0.6時(shí)感染輔助噬菌體M13KO7(北京普如汀生物技術(shù)有限公司)。12h后離心，吸取上清，即為陽性ScFv的噬菌體。陽性ScFv的噬菌體感染對(duì)數(shù)生長期的HB2151菌液(北京普如汀生物技術(shù)有限公司)，培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀為0.6。將菌液分為兩份，分別為誘導(dǎo)組、和非誘導(dǎo)組。誘導(dǎo)組在菌液中加入IPTG(終濃度100μM)，于30℃誘導(dǎo)過夜，離心收集菌液。用PBS懸浮菌液，超聲波裂解，離心后收集上清。采用Ni-NTA his band Rasin純化ScFv，純化過程參照默克公司的《pET System Manual》。純化后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳(見圖5)。

實(shí)施例2抗原特異性ScFv的間接ELISA篩選

取超速離心濃縮的豬傳染性胃腸炎病毒(本實(shí)驗(yàn)室保存)，用抗原包被液(50mmol/L碳酸氫鈉鹽溶液，pH＝9.6)稀釋至5μg/mL，加入96孔板，每孔100μL，4包被過夜；每孔加入5％脫脂奶粉溶液200μL，37封閉1h，PBS洗滌3次；將純化蛋白的上清50μL與4％脫脂奶粉溶液50μL混勻后加入上述孔中，37℃孵育2h，PBST洗滌3次；加入E-Tag Mouse mAb(E-tag標(biāo)簽鼠單克隆抗體購自RayBiotech公司)100μL(1:2000)，37℃反應(yīng)2h，PBST洗滌3次；加入過氧化氫標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(購自美國Invitrogen公司)1000μL(1:4000)，37℃反應(yīng)1h，PBST洗滌3次；TMB顯色15min，2mol/L硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀(美國Thermo公司讀取OD₄₅₀處吸光值，將設(shè)未誘導(dǎo)菌液上清為表達(dá)陰性對(duì)照。以P/N(P為陽性孔的OD450值，N為陰性孔的OD450值)表示，P/N≥2.1為陽性；1.5≤P/N＜2.1為可疑；P/N＜1.5為陰性。陽性克隆經(jīng)3次重復(fù)性試驗(yàn)驗(yàn)證，同時(shí)設(shè)豬傳染性胃腸炎病毒、豬沙門菌、豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌作為對(duì)照，驗(yàn)證ScFv的特異性。結(jié)果證明單鏈抗體A能夠特異性的識(shí)別豬傳染性胃腸炎病毒，但不與豬流行性腹瀉病毒、豬沙門菌、豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌發(fā)生交叉免疫反應(yīng)。

實(shí)施例3

對(duì)獲得的單鏈抗體編碼基因進(jìn)行測(cè)序，證明其由747個(gè)核苷酸及據(jù)此推測(cè)的249個(gè)氨基酸組成，所述核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

實(shí)施例4

檢測(cè)單鏈抗體對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒的中和活性分析(見表1)。首先采用Reed-Muench方法檢測(cè)TGEV感染PK15細(xì)胞的TCID50。TCID50的測(cè)定在96孔中進(jìn)行，將5×10⁵個(gè)/孔Vero細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度為80％；在1.5mL Eppendorf管中將病毒液分別從10^-1到10^-10作連續(xù)10倍梯度稀釋；以無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次后將稀釋好的病毒液分別入96孔板中，每一個(gè)稀釋梯度接種一個(gè)縱排，每孔加入100μL病毒稀釋液，最后一孔加入空白培養(yǎng)基做為陰性對(duì)照；37℃培養(yǎng)1h后，每孔補(bǔ)加一滴含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；放置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變情況，結(jié)果按照Reed-Muench法計(jì)算。公式如下：

距離比例＝(高于50％病變率的百分?jǐn)?shù)-50％)/(高于50％病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50％病變率的百分?jǐn)?shù))

lgTCID₅₀＝距離比例×稀釋度對(duì)數(shù)之間的差+高于50％病變率的稀釋度的對(duì)數(shù)

然后測(cè)定單鏈抗體的體外中和活性，分為三組。單鏈抗體處理組，將100μL純化的單鏈抗體(100ng/μL)與100μL 1MOI病毒混合，預(yù)先作用30min，然后感染細(xì)胞；無關(guān)單鏈抗體處理組(證實(shí)不與TGEV結(jié)合的單鏈抗體)，將100μL純化的所述單鏈抗體(100ng/μL)與100μL 1MOI病毒混合，預(yù)先作用30min，然后感染細(xì)胞；病毒處理組，將100μL PBS與1MOI病毒混合，預(yù)先作用30min，然后感染細(xì)胞；每組三個(gè)重復(fù)，分別在感染后6、12、18、24、30、36h收集細(xì)胞上清，測(cè)定病毒滴度，分析單鏈抗體的中和效果(見圖6)。從結(jié)果可以看出，TGEV感染后18-36h，單鏈抗體處理組的病毒滴度顯著低于PBS和陰性ScFv處理組(P<0.05)，說明ScFv具有中和病毒的活性。統(tǒng)計(jì)方法使用Student’s T test。