本發(fā)明涉及一種利用玉米蛋白制備具有高抗氧化活性玉米糖肽的方法。屬于農(nóng)產(chǎn)品深加工領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

玉米是我國重要的農(nóng)作物之一，種植歷史早，種植面積大，年產(chǎn)量超過2.2億噸。玉米曾是人類最重要的一種食物來源，隨著人們生活水平的不斷提高，玉米的主食地位已經(jīng)逐漸被其它種類繁多的食品所取代，致使玉米的主要用途從食用轉(zhuǎn)向了工業(yè)利用。

玉米黃粉（Corn Gluten Meal, CGM），是濕法玉米淀粉加工中產(chǎn)量最大、蛋白質(zhì)含量最高的副產(chǎn)物。玉米黃粉中約含62-71%的蛋白質(zhì)，其主要組分是玉米醇溶蛋白（65-68%）和谷蛋白（22-33%），還有少量的球蛋白（1.2%）和白蛋白。由于玉米蛋白具有氨基酸組成不平衡、水溶性差等特點(diǎn)，限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。目前，主要作為飼料使用。如果能對玉米蛋白進(jìn)行改性并應(yīng)用于食品工業(yè)，則玉米蛋白的市場價值將大大提高。

近年來, 對玉米蛋白的研究工作主要集中在用蛋白酶切割釋放其功能性和具有生理功能性肽段的分離與分析方面。

在用蛋白酶酶切玉米蛋白使其生理功能性有效釋放方面，采用多種蛋白酶單獨(dú)或協(xié)同酶切玉米蛋白, 使玉米蛋白溶解性顯著增加、加工性能顯著提高的同時, 玉米蛋白水解物表現(xiàn)出促進(jìn)乙醇代謝、抗氧化、抗高血壓等生物活性。具有抗氧化活性的玉米蛋白水解物，可以作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品工業(yè)，防止食品發(fā)生氧化變質(zhì)；也可以作為保健食品基料，顯著降低機(jī)體內(nèi)自由基的水平，在維持健康和預(yù)防疾病方面發(fā)揮重要作用。

但是，利用蛋白酶水解玉米蛋白提高其生理功能性的方法普遍存在的問題是：隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行, 一些疏水性氨基酸基團(tuán)暴露在肽段一端, 玉米蛋白水解物呈現(xiàn)一定苦味, 苦味值與肽段一端的疏水性氨基酸基團(tuán)數(shù)呈正相關(guān)。如果降低蛋白水解程度, 其苦味顯著降低, 但是又會帶來反應(yīng)轉(zhuǎn)化率低、玉米蛋白生理功能的釋放程度不夠的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種新型的、具有抗氧化活性的玉米糖肽，該產(chǎn)品不僅可以為玉米蛋白提供一條有效的利用途徑，而且這種玉米糖肽還具有安全性高、抗氧化活性高、苦味值低等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種該抗氧化活性玉米糖肽的制備方法。

本發(fā)明產(chǎn)品抗氧化活性玉米糖肽是先用蛋白酶水解玉米蛋白獲得玉米肽混合物，再向反應(yīng)體系中加入殼寡糖和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化玉米肽與殼寡糖之間的糖基化反應(yīng)，制備出具有高抗氧化活性的玉米糖肽。在濃度為2mg/mL時，玉米糖肽的還原力、DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率和Fe²⁺-螯合率分別為0.962、66.7%、19.37%和81.28%，分別比糖基化反應(yīng)前的玉米肽高0.707、20.8%、16.45%和20.21%。另外，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化多肽鏈中谷氨酰胺γ-酰胺基與氨基糖的共價交聯(lián)反應(yīng)，生成以谷氨酰胺-糖為基本單位的N-型糖肽，該類糖肽的基本結(jié)構(gòu)與常見的N-型糖肽（天冬酰胺的側(cè)鏈酰胺基與乙酰氨基葡萄糖通過一個β-N-糖苷鍵連接構(gòu)成）和O-型糖肽（糖與肽鏈中的羥基氨基酸通過O-糖苷鍵相連）的基本結(jié)構(gòu)均不同，與美拉德反應(yīng)生成的Shiff堿式糖蛋白/糖肽（碳水化合物的醛基與蛋白質(zhì)的氨基縮合反應(yīng)）也不同，是一類新型的糖肽。

本發(fā)明所使用的蛋白酶具有高度的安全性，符合FAO/WHO/JECFA/FCC推薦的食品級酶制劑標(biāo)準(zhǔn)。微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶屬于酰基轉(zhuǎn)移酶，在食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用于乳制品及肉類加工中。這兩種類型的酶在國內(nèi)均已能工業(yè)化生產(chǎn)，價格便宜，適應(yīng)本發(fā)明水解玉米蛋白和制備高抗氧化活性糖肽的要求。

本發(fā)明產(chǎn)品抗氧化活性玉米糖肽是先用蛋白酶水解玉米蛋白獲得玉米肽混合物，再后向反應(yīng)體系中加入殼寡糖和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化玉米肽與殼寡糖之間的糖基化反應(yīng)，制備出新型的、具有高抗氧化活性的玉米糖肽。

本發(fā)明產(chǎn)品制備的具體方法：

1、玉米肽的制備

蛋白酶在最適水解條件下或限制水解條件下水解玉米蛋白，制備玉米肽混合物。

2、玉米糖肽的制備

向制備好的玉米肽混合物中添加殼寡糖，保證反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)?；w與殼寡糖酰基受體的摩爾比為1:1-1:5。攪拌使殼寡糖徹底溶解，用2mol/L NaOH調(diào)初始pH至7.0-8.0。按添加量為40-80U/g蛋白加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，放入30-45℃恒溫水浴振蕩器中開始糖基化反應(yīng)。糖基化反應(yīng)5-10h后立即于85℃水浴中滅酶5min。冷卻至室溫，樣品經(jīng)離心分離獲取上清液，上清液冷凍干燥后獲得具有高抗氧化活性的玉米糖肽。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明將蛋白酶酶切法與酶法糖基化反應(yīng)有機(jī)結(jié)合起來，在合理控制玉米蛋白水解物苦味的基礎(chǔ)上，使反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性得到更多的釋放與提高。在濃度為2mg/mL時，新型玉米糖肽的還原力、DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率和Fe²⁺-螯合率分別為0.962、66.7%、19.37%和81.28%，分別比糖基化反應(yīng)前的玉米肽高0.707、20.8%、16.45%和20.21%。因此，新型玉米糖肽具有預(yù)防疾病、抗衰老等功能，可以用作保健食品基料或食品、化妝品等添加劑使用。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步加以說明。以下具體實(shí)施方式僅用于說明本發(fā)明，并非用以限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的以下實(shí)施實(shí)例還可以做出各種變化。在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。

圖1是本發(fā)明的生產(chǎn)工藝流程圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

1、玉米肽的制備

取3g玉米醇溶蛋白于150mL燒杯中，加入100mL蒸餾水，配制成底物濃度為3%（w/v）的懸浮液，加入大小合適的轉(zhuǎn)子后將燒杯放入60℃水浴磁力攪拌器中央，將pH計(jì)電極插入懸浮液中，用移液槍少量多次加入0.5mol/L NaOH調(diào)pH至8.5，立即加入0.09g Alcalase堿性蛋白酶開始酶解反應(yīng)。酶解過程中，通過不斷滴加0.5mol/L NaOH使pH維持在8.5，酶解120min后取出立即放入沸水浴中滅酶10min。

2、玉米糖肽的制備

（1）向制備好的3%玉米肽混合物中添加殼寡糖（脫乙酰度＞90%，平均分子量1500Da），保證反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)?；w與殼寡糖?；荏w的摩爾比為1:3。攪拌使殼寡糖徹底溶解，用2mol/L NaOH調(diào)初始pH至7.7。

（2）按添加量為60U/g蛋白稱取轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，放于離心管中，移取1mL蒸餾水，上下顛倒搖勻。將酶液加入到玉米肽混合物中，放入37℃恒溫水浴振蕩器中開始糖基化反應(yīng)。

（3）糖基化反應(yīng)8h后立即于85℃水浴中滅酶5min。

（4）冷卻至室溫，樣品經(jīng)4000r/min離心15min，取上清液放于超低溫冰箱中凍結(jié)，冷凍干燥48h，獲得新型玉米糖肽。

實(shí)施例2：

1、玉米肽的制備

取5g玉米黃粉于150mL燒杯中，加入100mL蒸餾水，配制成底物濃度為5%（w/v）的懸浮液，加入大小合適的轉(zhuǎn)子后將燒杯放入60℃水浴磁力攪拌器中央，將pH計(jì)電極插入懸浮液中，用移液槍少量多次加入0.5mol/L NaOH調(diào)pH至8.5，按加酶量E/S=0.5%加入堿性蛋白酶Alcalase開始酶解反應(yīng)。酶解過程中，通過不斷滴加0.5mol/L NaOH使pH維持在8.5，當(dāng)消耗的NaOH的體積為600μL時酶解反應(yīng)結(jié)束，取出放入沸水浴中滅酶10min。

2、玉米糖肽的制備

（1）向制備好的5%玉米肽混合物添加殼寡糖（脫乙酰度75%，平均分子量1000Da），保證反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)?；w與殼寡糖?；荏w摩爾比為1:4。攪拌使殼寡糖徹底溶解，用2mol/L NaOH調(diào)初始pH至7.5。

（2）按添加量為80U/g蛋白稱取轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，放于離心管中，移取2mL蒸餾水，上下顛倒搖勻。將酶液加入到玉米肽混合物中，放入37℃恒溫水浴振蕩器中開始糖基化反應(yīng)。

（3）糖基化反應(yīng)6h后立即于85℃水浴中滅酶5min。

（4）冷卻至室溫，樣品經(jīng)4000r/min離心15min，取上清液放于超低溫冰箱中凍結(jié)，冷凍干燥48h，獲得新型玉米糖肽。