本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥用高分子材料技術領域，特別涉及基于叔氨基的pH響應嵌段聚合物及其制備方法和基于其得到的混合膠束系統與應用。

背景技術：

癌癥或惡性腫瘤是由于細胞生長增殖控制機制失常而引起的疾病。世界衛(wèi)生組織指出，目前在全球每年癌癥奪去700多萬人的生命，而且這一數字還將增加，到2030年將可能超過1310萬。在我國每年因癌癥死亡病例達到270萬之多，是僅次于心血管疾病的“第二號殺手”。目前，化療法是臨床上治療癌癥最常用的手段。但是由于癌癥細胞的異質性、多耐藥性和抗癌藥物本身存在的水溶性差、生物分布不均勻和易發(fā)生副作用等缺陷，降低了化療法的療效。

為了提高癌癥治療的療效，近年來，一些新型的藥物載體被廣泛研究，如聚合物膠束。許多兩親性的多嵌段共聚物、接枝共聚物、超支化共聚物和非線型共聚物等通過自組裝構建結構有序的膠束，用作抗癌藥物載體。聚合物膠束作為一種新型抗癌藥物載體，具有很多優(yōu)點。比如，能增溶疏水性抗癌藥物，避免被網狀內皮系統(RES)吞噬，利用高通透性和滯留效應實現被動靶向，降低抗癌藥物對正常組織的毒副作用。

通常，高分子聚合物膠束是由單一的聚合物組裝形成，往往為了賦予膠束更多的功能性，復雜的合成方法和步驟被用于合成多嵌段聚合物。直接使用多種嵌段結構簡單的、易于合成的聚合物制備多功能性混合膠束是一種較有前景的方法。首先，通過合成簡單的嵌段聚合物或者直接購買工業(yè)產品制備混合膠束，在賦予膠束更多的功能性的同時，簡化了制備工藝流程；其次，可通過調節(jié)各嵌段共聚物的比例，這種簡單的方法改善混合膠束的穩(wěn)定性、大小、形貌、載藥能力和響應性等；再者，可以通過便捷的化學方法對膠束表面進行修飾，如接枝一些功能性分子葉酸、熒光素和染料等賦予膠束主動靶向功能和自發(fā)熒光功能。

聚甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(PDEAEMA)是一種陽離子聚堿類聚合物，pKb為6.9，其側鏈的叔氨基可以在酸性條件下發(fā)生質子化作用變?yōu)榭扇芮抖?，而在中性或堿性條件下去質子化表現為疏水性，從而響應腫瘤組織的弱酸性條件。而且含有叔氨基的聚合物膠束載體在中性條件下表觀帶正電，有利于聚合物膠束穿透細胞膜，改善細胞內吞效果。

Yang[Acta biomaterialia,9(2013):7679-7690]合成了4/6均臂星型聚合物，其臂為三嵌段的PCL-b-PDEAEMA-b-PPEGMA，該聚合物形成的納米膠束用于包載疏水性的抗癌藥物阿霉素(DOX)。載藥膠束具有較低的臨界膠束濃度和靈敏的pH敏感性能。在pH7.4下藥物釋放緩慢，當pH值下降到5.0時，藥物的釋放速率有了明顯的加快，且通過細胞毒性實驗證明了材料基本無毒。郎美東等[Journal of colloid and interface science,364(2011):92-99]使用星型嵌段共聚物S(PCL-b-PDEAEMA)和線型的mPEG-b-PCL制備了一種混合膠束，考察了不同聚合物質量比對混合膠束粒徑的影響，隨著mPEG-b-PCL的增加，粒徑逐漸減小，同時研究了其對吲哚美辛的包載和體外釋放性能。韓國的李斗成等[Bioconjugate chemistry,21(2010):208-213]使用線型AP-b-PEG-b-PLA和線型的mPEG-b-PAE制備了一種混合膠束，用于抗癌藥物阿霉素(DOX)的包載和緩控釋，比較了混合膠束與單組分mPEG-b-PAE膠束的性能，研究混合膠束和單組分膠束的體外和體內釋放行為和毒性。

專利申請CN201510191330.8公布一種pH響應聚合物混合膠束及其應用。專利申請CN200910024899.X公布了一種采用ATRP方法合成嵌段聚合物的方法，嵌段的長度易于調控，反應的機理成熟，各種反應條件溫和可行。專利申請CN20131014153.1和CN201510191330.8均公布了包載疏水性抗癌藥物靶向聚合物膠束的制備方法，由于腫瘤組織環(huán)境和正常組織環(huán)境pH值的差異，實現藥物的定點控制釋放。

目前，從現有研究報道來看，不同親疏水嵌段組分比例的混合膠束的穩(wěn)定性、其對疏水藥物的包載能力、體外釋放性能和體外細胞毒性均有待研究，需要進一步對比討論。

技術實現要素：

為了探討膠束中親疏水組分對膠束的穩(wěn)定性，藥物包載量和體外釋放性能的影響，克服上述現有技術的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供基于叔氨基的pH響應嵌段聚合物，包括一種三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA和兩種兩嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA和PPEGMA-b-PDEAEMA中的至少一種。

本發(fā)明另一目的在于提供上述基于叔氨基的pH響應嵌段聚合物的制備方法。

本發(fā)明方法采用酰溴化反應，以2-溴異丁酰溴為溴化試劑，與大分子聚乙二醇單甲醚進行酰溴化反應，制備大分子引發(fā)劑(mPEG-Br)；再采用電子轉移活化再生原子轉移自由基聚合法(ARGET ATRP)，以溴化聚乙二醇單甲醚(mPEG-Br)為大分子引發(fā)劑，依次引發(fā)單體甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(DEAEMA)及甲基丙烯酸甲酯(MMA)得到pH響應三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA(聚乙二醇單甲醚-b-聚甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯-b-聚甲基丙烯酸甲酯)。采用電子轉移活化再生原子轉移自由基聚合法(ARGET ATRP)，以2-溴異丁酸乙酯(EBriB)為小分子引發(fā)劑，依次引發(fā)單體甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(DEAEMA)及甲基丙烯酸甲酯(MMA)得到pH響應兩嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA(聚甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯-b-聚甲基丙烯酸甲酯)。采用電子轉移活化再生原子轉移自由基聚合法(ARGET ATRP)，以2-溴異丁酸乙酯(EBriB)為小分子引發(fā)劑，依次引發(fā)單體甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(DEAEMA)及聚甲基丙烯酸單甲氧基聚乙二醇酯(PEGMA)得到pH響應兩嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA(聚甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯-b-聚甲基丙烯酸單甲氧基聚乙二醇酯)。

本發(fā)明的再一目的在于提供基于上述叔氨基的pH響應嵌段聚合物的混合膠束系統，該混合膠束系統由三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA，以及兩種兩嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA和PPEGMA-b-PDEAEMA中的至少一種溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，然后在水溶液中自組裝得到。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述混合膠束系統在生物醫(yī)藥領域中的應用，特別適用于制備包載疏水性抗癌藥物。

本發(fā)明基于叔氨基的pH響應嵌段聚合物的混合膠束系統，各個聚合物組分中均含有pH響應官能團叔氨基，保障改變聚合物比例的同時，盡量維持其pH響應性能，保障其對于疏水性抗癌藥物的輸送效率。采用透析法制備含有疏水內核，pH響應中間層和親水外殼的納米級聚合物膠束，實現對疏水抗癌藥物的包載。在弱酸性的腫瘤部位，膠束系統中的pH響應官能團叔氨基發(fā)生質子化作用，膠束結構膨脹或者解體，從而實現被包載藥物的智能響應控制釋放。

本發(fā)明的目的通過下述方案實現：

基于叔氨基的pH響應嵌段聚合物，包括一種三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA和兩種兩嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA和PPEGMA-b-PDEAEMA中的至少一種；

一種三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA，具有下式所示結構：

其中n＝100～130，x＝10～20，y＝15～25；

一種兩嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA，具有下式所示結構：

其中x＝35～45，y＝20～30；

一種兩嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA，具有下式所示結構：

其中x＝8～12，y＝20～30，z＝6～10。

本發(fā)明的基于叔氨基的pH響應嵌段聚合物，包括一種三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA和兩種兩嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA和PPEGMA-b-PDEAEMA中的至少一種；

其中，所述三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA的數均分子量為9335～11771g/mol；

所述兩嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA的數均分子量為6276～7936g/mol；

所述兩嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA的數均分子量為5276～9231g/mol。

本發(fā)明提供了一種上述基于叔氨基的pH響應嵌段聚合物的制備方法，各反應物的量以摩爾份數計：

(1)三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA的制備方法，包括以下具體步驟：

1)制備大分子引發(fā)劑：將1.54～1.74份催化劑、1～2份聚乙二醇單甲醚(mPEG)溶于溶劑中，再加入2～4份縛酸劑攪拌均勻，逐滴加入1.5～3份溴化劑，室溫下反應，得到大分子引發(fā)劑(mPEG-Br)；

2)制備pH響應三嵌段聚合物：將0.8～1.2份步驟1)制備得到的大分子引發(fā)劑(mPEG-Br)、15～25份單體甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(DEAEMA)、0.08～0.12份催化劑、0.8～1.2份配體1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)溶于溶劑中，再加入0.8～1.2份還原劑，加熱反應后，再加入10～20份單體甲基丙烯酸甲酯(MMA)，恒溫反應，得到pH響應三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA。

步驟1)中所述的室溫反應時間優(yōu)選為12～36h。

步驟1)中所述的溴化劑優(yōu)選在1h內滴加完，更優(yōu)選在冰水浴中滴加。

步驟1)中所述的溶劑優(yōu)選為二氯甲烷。

步驟1)中所述的催化劑優(yōu)選為4-二甲氨基吡啶(DMAP)。

步驟1)中所述的縛酸劑可為本領域常用的任意縛酸劑，優(yōu)選為三乙胺(TEA)。

步驟1)中所述的溴化劑可為本領域常用的任意溴化劑，優(yōu)選為2-溴異丁酰溴(BMPB)。

步驟2)中所述的催化劑優(yōu)選為CuBr₂。

步驟2)中所述的還原劑優(yōu)選為Sn(Oct)₂。

步驟2)中所述的加熱反應的條件優(yōu)選為加熱至60～90℃，反應5～10h。所述的恒溫反應的時間優(yōu)選為5～10h。

步驟2)中所述的溶劑優(yōu)選為甲苯。

優(yōu)選地，步驟1)中反應完成后，分別使用5wt％NaHSO₄、Na₂SO₄、去離子水萃取反應液3次，得到純化后的大分子引發(fā)劑。更優(yōu)選萃取完后在無水硫酸鎂中干燥過夜后過濾，旋轉蒸發(fā)除去濾液中的大部分溶劑，再用10倍體積冷乙醚溶液沉淀，離心，并用冷乙醚洗滌三次，然后真空干燥。將干燥后的樣品溶解在無水乙醇中，過夜重結晶，再真空干燥后即得產物mPEG-Br大分子引發(fā)劑白色固體。

優(yōu)選地，步驟2)所述恒溫反應完成后，將反應體系冷卻、純化、干燥，得到純化后的產物。所述的純化是指將反應產物溶解于四氫呋喃后，過中性氧化鋁層析柱，四氫呋喃洗脫，除去催化劑，再將洗脫液旋蒸濃縮，滴入10倍體積的0℃正己烷進行沉淀，過濾得到純化后產物。

優(yōu)選地，上述反應均優(yōu)選在惰性氣體氛圍、無水條件下進行。

(2)兩嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA的制備方法，包括以下具體步驟：

將0.8～1.2份小分子引發(fā)劑、20～30份單體甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(DEAEMA)、0.08～0.12份催化劑、0.8～1.2份配體1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)溶于溶劑中，再加入0.8～1.2份還原劑，加熱反應后，再加入35～45份單體甲基丙烯酸甲酯(MMA)，恒溫反應，得到pH響應兩嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA；

所述的小分子引發(fā)劑優(yōu)選為EBriB。

所述的催化劑優(yōu)選為CuBr₂。

所述的還原劑優(yōu)選為Sn(Oct)₂。

所述的加熱反應的條件優(yōu)選為加熱至60～90℃，反應5～10h。所述的恒溫反應的時間優(yōu)選為5～10h。

所述的溶劑優(yōu)選為甲苯。

優(yōu)選地，所述恒溫反應完成后，將反應體系冷卻、純化、干燥，得到純化后的產物。所述的純化是指將反應產物溶解于四氫呋喃后，過中性氧化鋁層析柱，四氫呋喃洗脫，除去催化劑，再將洗脫液旋蒸濃縮，滴入10倍體積的0℃正己烷進行沉淀，過濾得到純化后產物。

優(yōu)選地，上述反應均優(yōu)選在惰性氣體氛圍、無水條件下進行。

(3)兩嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA的制備方法，包括以下具體步驟：

將0.8～1.2份小分子引發(fā)劑、20～30份單體甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(DEAEMA)、0.08～0.12份催化劑、0.8～1.2份配體1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺(HMTETA)溶于溶劑中，再加入0.8～1.2份還原劑，加熱反應后，再加入8～12份單體甲基丙烯酸單甲氧基聚乙二醇酯(PEGMA)，恒溫反應，得到pH響應兩嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA；

所述的小分子引發(fā)劑優(yōu)選為EBriB。

所述的催化劑優(yōu)選為CuBr₂。

所述的還原劑優(yōu)選為Sn(Oct)₂。

所述的加熱反應的條件優(yōu)選為加熱至60～90℃，反應5～10h。所述的恒溫反應的時間優(yōu)選為5～10h。

所述的溶劑優(yōu)選為甲苯。

優(yōu)選地，所述恒溫反應完成后，將反應體系冷卻、純化、干燥，得到純化后的產物。所述的純化指將反應產物溶解于四氫呋喃后，過中性氧化鋁層析柱，四氫呋喃洗脫，除去催化劑，再將洗脫液旋蒸濃縮，滴入10倍體積的0℃正己烷進行沉淀，過濾得到純化后產物。

優(yōu)選地，上述反應均優(yōu)選在惰性氣體氛圍、無水條件下進行。

本發(fā)明還提供一種基于上述基于叔氨基的pH響應嵌段聚合物的混合膠束系統，該混合膠束系統由三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA，以及兩種兩嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA和PPEGMA-b-PDEAEMA中的至少一種溶于有機溶劑中，然后在水溶液中自組裝得到。

在其中一個實施例中，本發(fā)明的基于上述叔氨基的pH響應嵌段聚合物的混合膠束系統，由三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA和兩嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA混合后溶解于有機溶劑中，在水溶液中自組裝得到。

在其中一個實施例中，上述兩種共聚物的質量比為1:1。

在其中一個實施例中，本發(fā)明的基于上述叔氨基的pH響應嵌段聚合物的混合膠束系統，由三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA和兩嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA混合后溶解于有機溶劑中，在水溶液中自組裝得到。

在其中一個實施例中，上述兩種共聚物的質量比為1:1。

所述的有機溶劑優(yōu)選為二甲基亞砜或二甲基甲酰胺。

本發(fā)明還提供上述混合膠束系統在生物醫(yī)藥領域中的應用，如疏水性藥物的包載中，特別適用于制備包載疏水性抗癌藥物。具體包括以下步驟：將基于上述叔氨基的pH響應嵌段聚合物溶于有機溶劑中得到混合膠束系統；將疏水性藥物溶于相同的有機溶劑中，再與上述膠束系統混合，攪拌，透析，過濾，干燥，得到包載疏水性藥物膠束系統。

所述的攪拌優(yōu)選為4～6h。

所述的透析優(yōu)選用去離子水透析48h，更優(yōu)選地，透析過程中的前12h每2h換一次水，12～24h每4h時換一次水，24～48h每6h換一次水。

所述的疏水性藥物是指在1L水中溶解度小于或者等于1g的藥物。

所述的有機溶劑優(yōu)選為二甲基亞砜或二甲基甲酰胺中。

本發(fā)明制備得到的包載疏水性藥物膠束系統可控制包載的藥物，在正常組織(pH 7.4)下，膠束結構保持緊湊完好，膠束中所包載藥物緩慢釋放；在腫瘤細胞弱酸性條件(pH 5～6)下，膠束中的叔氨基發(fā)生質子化作用，膠束發(fā)生解離，從而實現被包載藥物的快速可控釋放。這種pH響應嵌段聚合物結構的混合膠束可以有效的調控載藥膠束的穩(wěn)定性和藥物包載量，提高治療效率，可廣泛應用于醫(yī)藥領域中。

本發(fā)明相對于現有技術，具有如下的優(yōu)點及有益效果：

(1)本發(fā)明設計、合成得到三嵌段聚合物和兩嵌段聚合物，可以通過聚合物中的PDEAEMA嵌段側鏈的叔氨基響應環(huán)境pH的變化，實現聚合物載藥膠束對所包載藥物的控制釋放，避免藥物在達到病灶前大量突釋，減少藥物對正常組織的毒副作用。

(2)本發(fā)明聚合物形成的膠束可調節(jié)膠束中聚合物的比例，提高其對藥物的包載能力和在體內血液循環(huán)過程中的穩(wěn)定性。根據應用環(huán)境的不同，可調節(jié)膠束中的聚合物的比例，選擇包載不同的藥物并實現其可控釋放。

(3)本發(fā)通過簡易的方法制備簡單結構的聚合物，減少聚合物合成過程中有機溶劑的使用量，降低以其制備的混合膠束對人體的毒副作用。

附圖說明

圖1為實施例1中的mPEG-Br的GPC洗脫曲線，流動相為四氫呋喃。

圖2為實施例1中的mPEG-Br的¹H NMR譜，溶劑為氘代氯仿。

圖3為實施例2、3和4合成的聚合物的GPC洗脫曲線，流動相為四氫呋喃。

圖4為實施例2、3和4中的合成的聚合物的¹H NMR譜，溶劑為氘代氯仿。

圖5為實施例5中的混合膠束的臨界膠束濃度測試曲線。

圖6為實施例6中的混合膠束的電位滴定曲線。

圖7為實施例7中的混合膠束的粒徑、zeta電位與pH的關系。

圖8為實施例8中的混合膠束的透射電鏡圖。

圖9為實施例9中的混合膠束的體外釋放曲線。

圖10為實施例10中混合膠束的體外細胞毒性。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

下列實施例使用的試劑均可從商業(yè)渠道獲得。

實施例1：大分子引發(fā)劑mPEG-Br的合成

合成反應式如下：

大分子引發(fā)劑mPEG-Br的合成：于250mL圓底反應瓶中裝入磁力攪拌子，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氬氣三次，放置在冰水中。將0.15g(1.232mmol)DMAP(上海共價化學)和0.7mL(5.0mmol)TEA溶解于10mL二氯甲烷中，將溶液通過注射器加入到反應瓶中。將4g(0.8mmol)mPEG(Sigma-Aldrich)溶解在40mL二氯甲烷中，通過注射器將mPEG溶液注入反應瓶中。用注射器向反應瓶中逐滴滴加0.4mL(1.60mmol)BMPB(J&K，百靈威)，在1h內加完，保持0℃下反應2h，撤掉冰浴，繼續(xù)在室溫下反應24h。反應完成后分別用5wt％NaHSO₄、Na₂SO₄萃取3次，然后再用蒸餾水洗滌3次，置于無水硫酸鎂中干燥過夜。通過旋轉蒸發(fā)除去大部分的溶劑，再將濃縮液緩慢滴入10倍體積的冷乙醚中沉淀，離心，離心得到的固體在35℃、35mbar下真空干燥48h得到mPEG-Br白色固體。利用GPC測定其分子量，并進行核磁分析，見圖1和圖2。產率為75％，M_n＝5204，M_w/M_n＝1.13。

實施例2：三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA的合成

于50mL干燥茄形瓶中裝入磁力攪拌子、26.8mg(0.12mmol)溴化銅和5.2g(1mmol)大分子引發(fā)劑mPEG-Br，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氬氣三次，依次用注射器注入將甲苯20mL、單體DEAEMA(4.02mL，20mmol)(J&K，百靈威)、配體HMTETA(0.31ml，1.2mmol)(J&K，百靈威)加入瓶中，攪拌10min使催化劑配合物形成。隨后將0.486g(1.2mmol)還原劑Sn(Oct)₂溶于2mL甲苯并加入反應瓶中。然后將反應瓶轉移到60℃反應7h后，加入1.6mL(15mmol)單體MMA(J&K，百靈威)，繼續(xù)反應12h。將反應液冷卻至室溫，加入50mL THF并攪拌使其溶解，然后用中性氧化鋁柱子過濾除去催化劑CuBr₂(以THF作洗脫劑)。得到的洗脫液濃縮后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀。沉淀產物在35℃、35mbar下真空干燥48h。利用GPC測定其分子量，并進行核磁分析，見圖3和圖4。產率為95％，M_n＝10151，M_w/M_n＝1.18。

合成反應式如下：

實施例3：三嵌段聚合物mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA的合成

于50mL干燥茄形瓶中裝入磁力攪拌子、26.8mg(0.12mmol)溴化銅和6.24g(1.2mmol)大分子引發(fā)劑mPEG-Br，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氬氣三次，依次用注射器注入將甲苯20mL、單體DEAEMA(5.02mL，25mmol)(J&K，百靈威)、配體HMTETA(0.31ml，1.2mmol)(J&K，百靈威)加入瓶中，攪拌10min使催化劑配合物形成。隨后將0.486g(1.2mmol)還原劑Sn(Oct)₂溶于2mL甲苯并加入反應瓶中。然后將反應瓶轉移到60℃反應7h后，加入2.13mL(20mmol)單體MMA(J&K，百靈威)，繼續(xù)反應12h。將反應液冷卻至室溫，加入50mL THF并攪拌使其溶解，然后用中性氧化鋁柱子過濾除去催化劑CuBr₂(以THF作洗脫劑)。得到的洗脫液濃縮后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀。沉淀產物在35℃、35mbar下真空干燥48h。利用GPC測定其分子量，并進行核磁分析。產率為95％，M_n＝11171，M_w/M_n＝1.25。

實施例4：兩嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA的合成

合成反應式如下：

于50mL干燥茄形瓶中裝入磁力攪拌子、26.8mg(0.12mmol)溴化銅和165μL(1mmol)大分子引發(fā)劑EBriB，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氬氣三次，依次用注射器注入將甲苯20mL、單體DEAEMA(5.02mL，25mmol)(J&K，百靈威)、配體HMTETA(0.31ml，1.2mmol)(J&K，百靈威)加入瓶中，攪拌10min使催化劑配合物形成。隨后將0.486g(1.2mmol)還原劑Sn(Oct)₂溶于2mL甲苯并加入反應瓶中。然后將反應瓶轉移到60℃反應7h后，加入4.27mL(40mmol)單體MMA(J&K，百靈威)，繼續(xù)反應12h。將反應液冷卻至室溫，加入50mL THF并攪拌使其溶解，然后用中性氧化鋁柱子過濾除去催化劑CuBr₂(以THF作洗脫劑)。得到的洗脫液濃縮后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀。沉淀產物在35℃、35mbar下真空干燥48h。利用GPC測定其分子量，并進行核磁分析，見圖3和圖4。產率為90％，M_n＝6835，M_w/M_n＝1.28。

實施例5：兩嵌段聚合物PDEAEMA-b-PMMA的合成

于50mL干燥茄形瓶中裝入磁力攪拌子、26.8mg(0.12mmol)溴化銅和198μL(1.2mmol)大分子引發(fā)劑EBriB，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氬氣三次，依次用注射器注入將甲苯20mL、單體DEAEMA(6.03mL，30mmol)(J&K，百靈威)、配體HMTETA(0.31ml，1.2mmol)(J&K，百靈威)加入瓶中，攪拌10min使催化劑配合物形成。隨后將0.486g(1.2mmol)還原劑Sn(Oct)₂溶于2mL甲苯并加入反應瓶中。然后將反應瓶轉移到60℃反應7h后，加入4.8mL(45mmol)單體MMA(J&K，百靈威)，繼續(xù)反應12h。將反應液冷卻至室溫，加入50mL THF并攪拌使其溶解，然后用中性氧化鋁柱子過濾除去催化劑CuBr₂(以THF作洗脫劑)。得到的洗脫液濃縮后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀。沉淀產物在35℃、35mbar下真空干燥48h。利用GPC測定其分子量，并進行核磁分析。產率為90％，M_n＝7936，M_w/M_n＝1.26。

實施例6：兩嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA的合成

合成反應式如下：

于50mL干燥茄形瓶中裝入磁力攪拌子、26.8mg(0.12mmol)溴化銅和165μL(1mmol)大分子引發(fā)劑EBriB，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氬氣三次，依次用注射器注入將甲苯20mL、單體DEAEMA(6.03mL，30mmol)(J&K，百靈威)、配體HMTETA(0.31ml，1.2mmol)(J&K，百靈威)加入瓶中，攪拌10min使催化劑配合物形成。隨后將0.486g(1.2mmol)還原劑Sn(Oct)₂溶于2mL甲苯并加入反應瓶中。然后將反應瓶轉移到60℃反應7h后，加入5.28mL(12mmol)單體PEGMA(J&K，百靈威)，繼續(xù)反應12h。將反應液冷卻至室溫，加入50mL THF并攪拌使其溶解，然后用中性氧化鋁柱子過濾除去催化劑CuBr₂(以THF作洗脫劑)。得到的洗脫液濃縮后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀。沉淀產物在35℃、35mbar下真空干燥48h。利用GPC測定其分子量，并進行核磁分析，見圖3和圖4。產率為92％，M_n＝9231，M_w/M_n＝1.36。

實施例7：兩嵌段聚合物PPEGMA-b-PDEAEMA的合成

于50mL干燥茄形瓶中裝入磁力攪拌子、26.8mg(0.12mmol)溴化銅和165μL(1mmol)大分子引發(fā)劑EBriB，用反口橡皮塞封口，抽真空-通氬氣三次，依次用注射器注入將甲苯20mL、單體DEAEMA(5.02mL，25mmol)(J&K，百靈威)、配體HMTETA(0.31ml，1.2mmol)(J&K，百靈威)加入瓶中，攪拌10min使催化劑配合物形成。隨后將0.486g(1.2mmol)還原劑Sn(Oct)₂溶于2mL甲苯并加入反應瓶中。然后將反應瓶轉移到60℃反應7h后，加入4.4mL(10mmol)單體PEGMA(J&K，百靈威)，繼續(xù)反應12h。將反應液冷卻至室溫，加入50mL THF并攪拌使其溶解，然后用中性氧化鋁柱子過濾除去催化劑CuBr₂(以THF作洗脫劑)。得到的洗脫液濃縮后緩慢加入到十倍量(體積比)的冷正己烷中沉淀。沉淀產物在35℃、35mbar下真空干燥48h。利用GPC測定其分子量，并進行核磁分析。產率為92％，M_n＝7263，M_w/M_n＝1.33。

實施例8：測定混合膠束的CMC值

利用熒光探針法測試實施例2產物分別與實施例4產物PDEAEMA-b-PMMA(混合膠束A)和實施例6產物PPEGMA-b-PDEAEMA (混合膠束B)混合的膠束的臨界膠束濃度。

(1)芘溶液的配置：用丙酮溶解芘，配置濃度為12×10^-5M的芘溶液。

(2)樣品溶液的配置：稱取mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA與PDEAEMA-b-PMMA各4mg，混合后溶于10mL丙酮中將溶液加入到80mL去離子水中，攪拌24h以揮發(fā)掉丙酮，得到濃度為0.1mg/mL的聚合物母液，稀釋成一系列濃度(濃度范圍為0.0001～0.1mg/mL；稱取mPEG-b-PDEAEMA-b-PMMA與PPEGMA-b-PDEAEMA各4mg，混合后溶于10mL丙酮中將溶液加入到80mL去離子水中，攪拌24h以揮發(fā)掉丙酮，得到濃度為0.1mg/mL的聚合物母液，稀釋成一系列濃度(濃度范圍為0.0001～0.1mg/mL。取20支10mL容量瓶，分別加入0.1mL步驟(1)配置的芘溶液，然后分別加入上述不同濃度的共聚物溶液定容，搖勻，得到樣品溶液。樣品溶液中芘的濃度為12×10^-7M。

(3)熒光光譜測試：以373nm為發(fā)射波長，在300～350nm掃描樣品溶液的熒光激發(fā)光譜。取波長為338nm和336nm的強度比值(I₃₃₈/I₃₃₆)對聚合物濃度對數作圖，如圖5所示，曲線突變點所對應的橫坐標即為lg(CMC)。測得混合膠束A和混合膠束B的臨界膠束濃度分別為1.95mg/L和4.11mg/L。

實施例9：電位滴定法測定混合膠束的pK_b區(qū)間

將實施例2制備的產物分別與實施例4和6的產物按照質量比1:1的比例混合30mg并充分溶解于30mL去離子水中，通過加入少許HCl溶液(0.1M)和超聲的方法使聚合物溶解為濃度1mg/mL的聚合物溶液。用NaOH或HCl溶液(0.1M)調節(jié)膠束溶液的pH值約為3，攪拌平衡一段時間至pH穩(wěn)定，選用NaOH(0.1M)作為滴定液，往聚合物溶液中逐滴加入，讀取各pH值，如圖6所示。聚合物溶液的pKb區(qū)間為6.5～7.4。

實施例10：混合膠束系統的pH響應自組裝行為

將實施例2制備的產物分別與實施例4和6的產物按照質量比1:1的比例混合充分溶解于20mL丙酮中，在快速攪拌下快速加入到50mL去離子水中，室溫下攪拌24h以揮發(fā)掉丙酮，制備最終濃度為0.1mg/mL的混合聚合物膠束溶液A和B。用NaOH或HCl溶液(0.1M)調節(jié)膠束溶液的pH值，攪拌平衡一段時間至pH穩(wěn)定，讀取此時的pH值。同時采用DLS測試不同pH值下膠束的粒徑和zeta電位。由圖7(a)可知，當pH>8時，PDEAEMA嵌段完全去質子化，分子鏈收縮并與PMMA共同組成膠束內核，使得膠束的結構非常緊密且基本保持穩(wěn)定，因而改變pH對粒徑的變化較小，只有小幅度的增大，且增大的主要原因可能是由于聚合物膠束的聚集。隨著pH逐漸從7降至4，PDEAEMA的側鏈叔氨基逐漸質子化，膠束內核親水性增強，PDEAEMA伸展到溶液相中，膠束發(fā)生溶脹；另一方面，質子化的PDEAEMA鏈帶較強的正電荷，分子鏈段間的靜電排斥作用也會促進膠束的溶脹過程，因而膠束的粒徑出現顯著的增大。pH繼續(xù)降低至小于4，粒徑出現輕微的下降，表明由于PDEAEMA嵌段完全質子化，聚合物鏈間極強的靜電排斥作用引起膠束聚集數的減少，甚至導致膠束結構的輕微解離。且從圖中可以看出，混合膠束A和混合膠束B表現出相同的變化趨勢。從整體上看，混合膠束A的粒徑略大于混合膠束B的粒徑，主要原因是由于混合膠束A中PMMA嵌段的長度大于混合膠束B中的PMMA嵌段長度，進而導致的膠束內核略大，所以粒徑略大。由圖7(b)可知，zeta電位表現出與粒徑幾乎相同的變化趨勢。隨著pH逐漸降低，由于DEAEMA逐漸發(fā)生質子化，并最終完全變?yōu)橛H水狀態(tài)，zeta電位從接近負電荷逐漸升高到強正電荷，當pH<4時會有略微的下降。當pH>8時，相較于粒徑由于聚集而變大，zeta電位仍然表現出繼續(xù)下降的趨勢。pH對混合膠束A和混合膠束B的zeta電位的影響，表現出一致的趨勢。

實施例11：混合載藥膠束系統形貌表征

制備單組分載藥膠束和混合載藥膠束，并表征形貌。采用透析法制備載藥膠束。準確稱取15mg阿霉素(DOX)溶于20mL DMSO中，加入2倍摩爾量的TEA 20μL，攪拌過夜。同時稱取30mg實施例2產物分別與實施例4和6產物按照1:1比例的混合物溶于20mL DMSO中。將兩者混合室溫下攪拌4～6h，然后用去離子水透析48h(前12h每2h換一次水，12～24h每4h換一次水，24～48h每6h換一次水)，再用0.45μm過濾頭過濾，冷凍干燥，得到DOX載藥單組分膠束和混合載藥膠束粉末。采用TEM觀察其形貌為球形，如圖8所示。

實施例12：混合載藥膠束的體外釋放性能測試

基于叔氨基的pH響應嵌段聚合物混合載藥膠束的體外釋放性能采用藥物溶出儀和紫外測定。具體步驟如下：分別精確稱取5mg DOX混合載藥膠束(實施例11中制備)分散在5mL緩沖液(pH 7.4、pH 6.5、pH 5.0)中，然后置于透析袋中，轉入45mL相同pH值的緩沖液中置于藥物溶出儀在37℃，110rpm轉速下進行體外釋放，定時取4mL袋外的緩沖液進行分析，并加入4mL新鮮緩沖液。用紫外分光光度法測定不同時間釋放液中DOX濃度，繪制其體外釋放曲線。

由圖9可知，在正常生理條件(pH 7.4)下，由于膠束結構比較緊湊，12h混合膠束和單組分膠束均只釋放10％左右的DOX，隨后釋放速率基本不變，96h的累積DOX釋放量少于25％。表明載藥膠束中的藥物很好的被保護，減少DOX在血液循環(huán)條件下的釋放，降低DOX對正常組織的毒性。在腫瘤細胞外間隙的微酸性(pH 6.5)條件下，PDEAEMA的側鏈叔氨基發(fā)生部分質子化，部分膠束發(fā)生溶脹，這種略松散的膠束結構不會導致DOX急劇釋放，因而DOX的釋放速率僅有一定程度的加快。在酸性更強(pH 5.0)的腫瘤細胞內環(huán)境，幾乎所有的PDEAEMA側鏈叔氨基都發(fā)生了質子化，膠束內核的疏水性急劇下降，PDEAEMA鏈段間的靜電排斥作用急劇增大，引起膠束溶脹程度的顯著提高，甚至于部分膠束發(fā)生解離，因而DOX的釋放速率明顯加快。

實施例13：混合載藥膠束和空白膠束的體外細胞毒性評價

評價基于叔氨基的pH響應嵌段聚合物混合載藥膠束和空白膠束(實施例11中制備)體外細胞毒性。取96孔平底組織培養(yǎng)板，將四周孔板中分別加入200μL細胞培養(yǎng)基(DMEM)作為空白組。中間60個孔中每孔以1×10⁴細胞/ 孔(200μL)的細胞濃度接種HepG2細胞(購于ATCC，USA)，其中第2列作為對照，將96孔板放置到37℃，飽和濕度，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。隨后將游離阿霉素、凍干的空白或載藥膠束用細胞培養(yǎng)介質稀釋成不同的聚合物濃度(空白膠束1～400mg/L)或藥物濃度(游離阿霉素或載阿霉素膠束，0.1～20mg/L)。在移走96孔板中從第2列到第11列所有孔中的細胞培養(yǎng)介質后，在第2列中加入新鮮的培養(yǎng)介質，作為對照。從第3列到第10列，向所有的孔中分別加入200μL的樣品溶液，每個濃度的樣品加入到6個孔中進行重復。

在經過24h或者48h的培養(yǎng)后，吸走所有含有細胞的孔中的上清液，加入200μL的PBS潤洗細胞，然后吸走PBS。從第2列到第11列，分別向每個孔中加入20μL的MTT溶液和180μL的培養(yǎng)介質，然后將96孔板放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h。隨后吸走未還原的MTT溶液和培養(yǎng)介質。每個孔用200μL的PBS洗一遍，并吸走PBS。向每個孔中加入200μL的DMSO溶解MTT結晶。整個96孔板放在37℃搖床中振蕩10min，然后利用酶標儀測定490nm處每個孔的吸光度，進而計算細胞存活率。

從圖10(a)中可知，空白膠束對HepG2細胞沒有明顯的毒性作用。隨著膠束濃度的增加，毒性略有增加，但是在最高濃度(400mg/L)下，HepG2細胞在經過48h培養(yǎng)后的細胞存活率仍超過85％，表明兩種聚合物膠束均具有良好的生物相容性，毒性很低。由圖10(b)和(c)可知，無論是經過24h還是48h，游離阿霉素的抗癌活性均優(yōu)于混合聚合物膠束，因為阿霉素由聚合物膠束中釋放出來是一個持續(xù)的過程，而游離的阿霉素則可以快速的作用于癌細胞，而且根據體外釋放數據曲線可知，即使是48h，游離阿霉素仍然不能完全從聚合物膠束中釋放出來?；旌夏z束體A和混合膠束B具有類似的電荷負載量，因此細胞攝取作用效率基本相當，但是由于混合膠束A含有較少的親水基團包裹在聚合物膠束的外層，因而在24h的時候可以明顯的看到混合膠束A的細胞存活率低于混合膠束B，。但是在48h時候基本沒有太大差距，是由于在48h的時候，兩種混合膠束體系中的大部分阿霉素均已經釋放，因而細胞的存活率很接近。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。