本發(fā)明涉及抗病毒藥物領(lǐng)域，更特別地，涉及用于表達(dá)恒河猴干擾素γ的載體和系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

恒河猴(也叫普通獼猴)原產(chǎn)于印度北部、孟加拉、巴基斯坦、尼泊爾、緬甸、泰國、阿富汗、越南和中國南部。該物種是世界各國用于科學(xué)試驗(yàn)的重要品種，甚至是太空之旅的參與者。我國將恒河猴列入國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，《中國國家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄》和《中國瀕危動(dòng)物紅皮書》易危物種。

然而隨著生態(tài)及環(huán)境變化、動(dòng)物遷移與與行為的改變和微生物由于環(huán)境的選擇造成的變異，以及生態(tài)環(huán)境變化增加了人與恒河猴等野生動(dòng)物接觸的機(jī)率，使新發(fā)傳染病不斷出現(xiàn)。2006年至2009年期間，我國廣西、湖北、云南等地養(yǎng)猴場(chǎng)、動(dòng)物園和靈長類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心暴發(fā)多起無明顯季節(jié)性的群體性恒河猴、食蟹猴感染類似麻疹樣疾病。研究結(jié)果，表明此次大規(guī)模猴群發(fā)病為與CDV中國狐貍EF042819.1遺傳關(guān)系最近的麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)跨種感染所致，而不是變異的麻疹病毒所致犬瘟熱的暴發(fā)對(duì)猴群構(gòu)成的嚴(yán)重的威脅。由于爆發(fā)疾病的猴飼養(yǎng)廠是中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用的猴源，對(duì)相關(guān)的科學(xué)研究工作的開展造成困難。發(fā)明人同期從患病的恒河猴分離得到CDV病毒，并且制備了臟器滅活苗、分離強(qiáng)毒的滅活苗和弱毒苗，為該病的防制提供了有效手段。

干擾素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)是一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生。IFN-γ對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用，是機(jī)體發(fā)揮免疫功能、清除體內(nèi)病原體不可缺少的成分。

IFN-γ能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)種具有酶活性的抗病毒蛋白(AVP)，干擾病毒的基因轉(zhuǎn)錄或病毒蛋白質(zhì)的翻譯。IFN-γ與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生具有酶活性的抗病毒蛋白。此外，IFN-γ通過提高細(xì)胞表面MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)，有助于向T細(xì)胞提呈抗原，引起靶細(xì)胞的溶解，可以增強(qiáng)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞對(duì)病毒的殺傷和吞噬作用，抑制病毒在新感染的細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。

目前動(dòng)物干擾素在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用還處于初級(jí)階段，只用于一些常見的難以治愈的病毒性傳染病，一般用于緊急應(yīng)急，當(dāng)接種某一疫苗后而免疫效力還未產(chǎn)生的一段時(shí)間內(nèi)，輔助接種干擾素會(huì)起到緊急防治病毒性傳染病的效果。對(duì)于恒河猴的干擾素-γ而言，GENBANK上已經(jīng)公開了恒河猴干擾素-γ的氨基酸序列和基因序列(序列號(hào)為NM_001032905，編碼序列長度為495bp(SEQ ID NO:3)，編碼165個(gè)氨基酸(SEQ ID NO:4))，但是，時(shí)下尚未有人建立一個(gè)能高效表達(dá)恒河猴干擾素γ蛋白的生物表達(dá)系統(tǒng)。

因此，需要一種新的生物表達(dá)系統(tǒng)來高效表達(dá)恒河猴干擾素γ蛋白，獲得具有抗病毒活性的恒河猴干擾素γ，以期可用于恒河猴的一些病毒性疾病的預(yù)防和治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上問題，發(fā)明人通過分析，發(fā)現(xiàn)N端的前20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，用于幫助蛋白的分泌，而非蛋白結(jié)構(gòu)所需，由于后續(xù)研究需要在原核生物中表達(dá)，真核生物的信號(hào)肽在原核細(xì)胞環(huán)境中由于缺少相應(yīng)受體而不能發(fā)揮作用，因此去掉信號(hào)肽序列，剩下165個(gè)氨基酸(SEQ ID NO:2)，其編碼序列長度為435bp(SEQ ID NO:1)。此外，為了使該基因能夠順利地在原核細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)明人對(duì)該編碼序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化(圖1)。

基于此，本發(fā)明提供了一種用于表達(dá)恒河猴干擾素γ的載體，其包含原核啟動(dòng)子和順著所述原核啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向連接于所述原核啟動(dòng)子下游的重組恒河猴干擾素γ基因，所述重組恒河猴干擾素γ基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

優(yōu)選地，所述原核啟動(dòng)子為可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，例如IPTG可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。通過使用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，可先將細(xì)胞培養(yǎng)至高濃度，然后再進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，使得不會(huì)因?yàn)樵谏L過程中表達(dá)蛋白質(zhì)而影響細(xì)胞的生長。

優(yōu)選地，所述用于表達(dá)恒河猴干擾素γ的載體通過將所述重組恒河猴干擾素γ基因的序列插入表達(dá)質(zhì)粒pET32α的多克隆位點(diǎn)處得到。

優(yōu)選地，所述重組恒河猴干擾素γ基因的序列插入于NdeI與XhoI之間。

pET32α是專門用于原核表達(dá)的質(zhì)粒載體，其上有IPTG可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，可在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)插入于其下游的多克隆位點(diǎn)的基因。

本發(fā)明還提供了一種用于表達(dá)恒河猴干擾素γ的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)通過將上述用于表達(dá)恒河猴干擾素γ的載體導(dǎo)入原核表達(dá)宿主中得到。

優(yōu)選地，所述原核表達(dá)宿主為用于表達(dá)的經(jīng)遺傳改造的大腸桿菌，例如BL21(DE3)。這樣的大腸桿菌專門為原核表達(dá)而設(shè)計(jì)，可進(jìn)行高效表達(dá)。

本發(fā)明還提供了一種用于表達(dá)恒河猴干擾素γ的方法，使用上述系統(tǒng)表達(dá)恒河猴干擾素γ，然后將提純所述恒河猴干擾素γ。

進(jìn)一步地，所述方法包括以下步驟：

S1：將所述表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，然后使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)恒河猴干擾素γ，離心收集細(xì)胞；

S2：對(duì)所收集的細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎，提取粗制包涵體，洗滌，并制備成變性恒河猴干擾素γ溶液，然后使所述變性的恒河猴干擾素γ進(jìn)行復(fù)性，并進(jìn)行微孔過濾，即得到純化的復(fù)性恒河猴干擾素γ。

進(jìn)一步地，S2包括以下步驟：

S2.1：超聲破碎，將S1中收集的細(xì)胞用PBS重懸，在冰浴下，400W功率超聲10s間隔10s，反復(fù)80次后，離心棄上清，得到的沉淀即為粗制包涵體；

S2.2：用濃度為2M的尿素溶液重懸所述粗制包涵體，12000rpm離心15min，棄上清，并用濃度為8M的尿素重懸沉淀，于30℃水浴充分溶解所述沉淀，離心后上清即為變性恒河猴干擾素γ溶液；

S2.3：將所述變性恒河猴干擾素γ溶液加入透析袋中，于4℃下依次放入含4M、2M、1M、0.75M、0M的PBS溶液中透析，每個(gè)濃度梯度透析2h，得到復(fù)性恒河猴干擾素γ溶液，將所述復(fù)性恒河猴干擾素γ溶液用0.45μm孔徑的濾膜過濾，得到純化的復(fù)性恒河猴干擾素γ溶液。

通過使用本發(fā)明的載體、系統(tǒng)和方法，可高效表達(dá)并得到高純度的恒河猴干擾素γ，由此得到的恒河猴干擾素γ可用于預(yù)防和治療恒河猴的一些病毒性疾病。

附圖說明

圖1為優(yōu)化序列與原始序列的對(duì)比圖；

圖2為優(yōu)化后序列密碼子的在大腸桿菌中的適應(yīng)指數(shù)(Codon Adaptation Index,CAI)；

圖3為優(yōu)化后序列最優(yōu)密碼子使用頻率(Frequency of Optimal Codons,FOP)；

圖4為優(yōu)化后序列GC堿基含量(GC curve)；

圖5為重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32α-MaIFN-γ的雙酶切鑒定(NdeI+XhoI，質(zhì)粒載體片段5.4kb，目的條帶約447bp)；

圖6為重組恒河猴干擾素γ原核表達(dá)的SDS-PAGE電泳照片；

圖7為重組恒河猴干擾素γ的可溶性鑒定照片；

圖8為組恒河猴干擾素γ純化效果SDS-PAGE電泳圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.重組恒河猴干擾素γ的基因優(yōu)化及全基因合成

根據(jù)從Genbank上檢索到的恒河猴干擾素γ的核酸序列(序列號(hào)為NM_001032905)，編碼區(qū)序列長度為495bp，經(jīng)分析恒河猴干擾素γ的N端1-20aa為信號(hào)肽，經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)其為幫助蛋白分泌的信號(hào)肽序列，非蛋白結(jié)構(gòu)所必須。由于后續(xù)研究需要在原核生物中表達(dá)，真核生物的信號(hào)肽在原核細(xì)胞環(huán)境中由于缺少相應(yīng)受體而不能發(fā)揮作用，因此去掉信號(hào)肽序列，剩下165個(gè)氨基酸(SEQ ID NO:2)，其編碼序列長度為435bp(SEQ ID NO:1)。此外，為了使該基因能夠順利地在原核細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)明人對(duì)該編碼序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化(圖1)。將恒河猴干擾素γ的編碼密碼子與大腸桿菌偏好密碼子進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)密碼子的兼并性，在不改變氨基酸組成和排列順序的基礎(chǔ)上，對(duì)已知的編碼恒河猴干擾素γ的基因序列進(jìn)行改造，替換為大腸桿菌喜歡的密碼子，旨在提高基因在大腸桿菌的表達(dá)水平，優(yōu)化后序列密碼子的在大腸桿菌中的適應(yīng)指數(shù)(Codon Adaptation Index,CAI)為0.98(圖2)，通常CAI＝1.0說明該基因在該表達(dá)系統(tǒng)中是最理想的高效表達(dá)狀態(tài)，因此可以看出經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的恒河猴干擾素γ基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中能夠高效表達(dá)。

最優(yōu)密碼子使用頻率(Frequency of Optimal Codons,FOP)：由圖3可知，通過密碼子優(yōu)化，本發(fā)明優(yōu)化的恒河猴干擾素γ基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中出現(xiàn)低利用率密碼子的頻率較低，小于5％。

GC堿基含量(GC curve)：GC含量理想的分布區(qū)域?yàn)?0％-70％，尤其以40％-60％最為理想。本發(fā)明優(yōu)化的恒河猴干擾素γ基因GC含量為46.9％(圖4)，能夠在大腸桿菌中高效表達(dá)。

在優(yōu)化序列的5’和3’端加上NdeI、XhoI酶切位點(diǎn)，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行全基因合成，并連入原核表達(dá)質(zhì)粒pET32α中，得到重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32α-MaIFN-γ，重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測(cè)(圖5)。

2.原核表達(dá)

(1)測(cè)序鑒定正確的陽性質(zhì)粒pET32α-MaIFN-γ轉(zhuǎn)入BL21(DE3)，挑取單菌落進(jìn)行雙酶切鑒定；

(2)陽性重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)：將重組陽性菌BL21-pET32a-IFN-γ劃線接種于LB培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單個(gè)菌落接種于接種于4ml(含50μg/ml氨芐青霉素)LB培養(yǎng)液中，37℃180r/min搖菌過夜。按1％的比例將過夜培養(yǎng)的菌液接種于含100μg/ml氨芐青霉素LB中，于37℃180r/min搖菌振蕩，培養(yǎng)3h至OD₆₀₀達(dá)到0.6-0.8，加入0.5mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別收集搖床培養(yǎng)2、4、6、8、10的菌液各1ml，將收集的菌液用PBS反復(fù)洗滌3次，對(duì)菌體超聲后進(jìn)行SDS-PAGE分析，以確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間(圖6)。

3.大腸桿菌表達(dá)的恒河猴干擾素γ蛋白的可溶性鑒定

取經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液，12000rpm離心5min，收集菌體，棄上清，沉淀經(jīng)PBS洗滌三次后超聲波破碎，破碎條件為功率400W，工作10s，間隔10s，反復(fù)80次。離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以鑒定目的蛋白的可溶性，目的蛋白主要表達(dá)于包涵體中圖(7)；

4.重組恒河猴干擾素γ的提取

(1)菌體破碎：離心收集誘導(dǎo)后的菌體，PBS洗滌三次，超聲破碎細(xì)胞，涂片鏡檢，觀察破碎效果，棄上清，得到粗制的包涵體；

(2)包涵體的洗滌：用2M的尿素洗滌包涵體，4℃，12000rpm，離心15min，棄上清；

(3)包涵體的變性：用8M的尿素重懸沉淀，30℃水浴充分溶解包涵體，離心取上清，既得變性蛋白液；

(4)目的蛋白的透析復(fù)性：將變性蛋白液加入透析袋中，分別放入含4M、2M、1M、0.75M、0M尿素的PBS溶液中進(jìn)行透析，每個(gè)溶度4℃攪拌透析2h，所得蛋白液離心，上清用直徑0.45μm濾膜過濾除菌及雜質(zhì)，既得重組恒河猴干擾素γ蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢驗(yàn)純化結(jié)果(圖8)，用BCA法測(cè)定蛋白濃度；

5.重組恒河猴干擾素γ抗病毒活性測(cè)定

Vero細(xì)胞接種24孔板，接種密度1.5×10⁵個(gè)/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h，加入10倍倍比稀釋的重組恒河猴干擾素γ，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)24h后棄上清，用10TCID50的犬瘟熱病毒(CDV)進(jìn)行攻毒，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照(只加10倍稀釋的重組恒河猴干擾素γ，不加病毒)、陽性對(duì)照(只加病毒，不加重組恒河猴干擾素γ)、空白對(duì)照(不加重組恒河猴干擾素γ，不加病毒)。倒置熒光顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞病變，待陽性對(duì)照孔出現(xiàn)75％病變時(shí)判定結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)陰性對(duì)照孔細(xì)胞生長與空白對(duì)照一致，說明本發(fā)明得到的干擾素對(duì)細(xì)胞本身沒有毒害作用；(2)經(jīng)稀釋100倍的重組恒河猴干擾素γ能夠100％抑制細(xì)胞病變，而10⁴稀釋的重組恒河猴干擾素γ出現(xiàn)細(xì)胞病變，得出重組恒河猴干擾素γ具有抗CDV感染的活性。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。