技術(shù)領域：

本發(fā)明屬于食品安全的分子生物學檢測方法領域，特別涉及一種單增李斯特菌的LAMP引物組及檢測試劑盒的應用。

背景技術(shù)：
：

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）簡稱單增李斯特菌，是一種能夠引起人畜共患病的食源性致病菌，屬李斯特菌屬。在自然界中廣泛分布，主要存在于土壤、動植物體和水產(chǎn)品中，食用了被單增李斯特污染的食物，可導致人和動物敗血癥、流產(chǎn)、腦膜炎等，病死率高達30%～70%，是人類最重要的食源性病原菌之一。單增李斯特菌對食品企業(yè)威脅最大，它能夠存活在高鹽分、冷藏以及低水分活度的食品生產(chǎn)環(huán)境中，由于巴氏殺菌能將其殺死，所以主要存在于后巴氏殺菌過程中。它可以附著在非生物質(zhì)表面，形成生物膜，因此極易污染連續(xù)生產(chǎn)過程中的產(chǎn)品。

目前，單增李斯特菌的檢測方法主要依賴于傳統(tǒng)分離鑒定、免疫學檢測和PCR方法等。傳統(tǒng)培養(yǎng)法耗時大約5到7天，檢測周期長，不適用于現(xiàn)場快速檢測需求；免疫學檢測如ELLSA法雖然快速靈敏，但特異性低，易出現(xiàn)假陽性，而且成本較高；PCR法具有特異性強、靈敏度高和速度快等優(yōu)點，但對儀器設備要求高，需要專門的操作人員進行后續(xù)的電泳操作和紫外觀察，限制了其在基層實驗室的應用。因而，急需開發(fā)一種既簡單快速，又靈敏特異的檢測方法以滿足對食品中單增李斯特菌的實時檢測要求。

環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是由Notomi等建立的一種體外核酸特異性擴增技術(shù)。LAMP法是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異的引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA ploymerase）在恒溫條件（65℃左右）保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。該方法具有特異性強、靈敏度高、操作簡單、檢測快速等優(yōu)點，適用于實驗條件相對薄弱的基層地區(qū)開展食源性致病菌的快速檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的一個目的是在于提供一種的LAMP引物。根據(jù)單增李斯特氏菌的溶血素基因（hlyA）保守區(qū)序列設計環(huán)介導等溫擴增引物，應用PrimerExplorer V4（http://primerexplorer. jp/elamp4.0.0/index.html）在線設計特異引物組，利用LAMP技術(shù)擴增靶基因的特定區(qū)域，從分子水平上實現(xiàn)單增李斯特菌的快速檢測，為單增李斯特菌檢測提供了有效且快速的核酸篩查檢測方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種單增李斯特菌的LAMP檢測試劑盒的應用方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP引物組，包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示：

hlyA-F3:CGCAATCAGTGAAGGGAA

hlyA-B3:GTAAGTCTCCGAGGTTGC

hlyA-FIP: GCCGTATGCCACACTTGAGAAACCTACAAGACCTTCCAGA

hlyA-BIP: TTGATGCTGCCGTAAGTGGACGGCTTTGAAGGAAGAATT

hlyA-LF:GCGCTTGCAACTGCTCTT

hlyA-LB:AATCTGTCTCAGGTGATGTAGA。

一種LAMP檢測試劑盒，包括以下物質(zhì)：（1）DNA聚合酶；（2）2×反應緩沖液；（3）熒光染料；（4）密封液；（5）標準陽性模板；（6）陰性對照；（7）上述的LAMP引物組。

在上述的LAMP檢測試劑盒中，所述LAMP引物組的濃度比例如下：外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物的摩爾比為：1-2：4-8：2-4。

在上述的LAMP檢測試劑盒中，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶。

在上述的LAMP檢測試劑盒中，所述2×反應緩沖液包含buffer緩沖液、甜菜堿和dNTPs，三者體積比為10：8：7。

在上述的LAMP檢測試劑盒中，所述熒光染料為濃度是0.02mM的SYTO-9。

在上述的LAMP檢測試劑盒中，所述密封液為礦物油。

在上述的LAMP檢測試劑盒中，所述的標準陽性模板為單增李斯特菌標準菌株基因組DNA；所述陰性對照為滅菌超純水。

使用上述LAMP試劑盒檢測單增李斯特菌的方法，包括以下步驟：

（1）待檢樣品的提?。翰捎盟蠓◤拇龣z樣品中提取DNA；

（2）恒溫基因擴增檢測反應體系及條件：25μl反應體系含有：SAnuc-F3 0.2μM，SAnuc-B3 0.2μM，SAnuc-FIP 0.8μM，SAnuc-BIP 0.8μM，SAnuc-LF 0.4μM，SAnuc-LB 0.4μM，2×反應液12.5μl，DNA聚合酶8U，SYTO-9 0.5μl，待檢樣品2μl，用超純水補齊至25μl；密封液加入體積為20μl；同時設置陽性對照和陰性對照；將配置好的PCR管混勻后離心，63℃反應45～60min，并在80℃持續(xù)2min；

（3）檢測結(jié)果判斷：將上述反應管置于熒光PCR儀（如ABI stepone、ZYD-S1）中，根據(jù)擴增曲線判斷檢測結(jié)果；如出現(xiàn)“S”形擴增曲線，檢測結(jié)果為陽性，即檢測樣品中含有單增李斯特菌；如無“S”形擴增曲線出現(xiàn)，檢測結(jié)果為陰性，即檢測樣品不含有單增李斯特菌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

（1）本發(fā)明采用的LAMP引物組在常規(guī)的LAMP檢測4條引物的基礎上增加了2條環(huán)引物，加快了擴增速度，并提高擴增效率。

（2）本發(fā)明采用STO-9染料作為熒光指示劑，可在配制反應體系中添加，避免了反應后打開蓋子添加造成的氣溶膠污染風險，并減少了反應步驟。

（3）本發(fā)明結(jié)果判斷簡單，可通過觀察擴增曲線判斷檢測樣品陰陽性，無需電泳等其他任何分析步驟，適合現(xiàn)場檢測。

附圖說明：

圖1為LAMP靈敏性實驗結(jié)果示意圖；其中，從左至右依次為濃度1ng/μl、100pg/μl和10 pg/μl單增李斯特菌基因組DNA模板LAMP反應結(jié)果。

圖2為LAMP特異性實驗結(jié)果示意圖；

具體實施方式：

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做詳細的說明，但不應該當作對本發(fā)明的限制。

實施例1：一種單增李斯特菌的LAMP引物的設計合成和檢測試劑盒的建立

（1）LAMP引物的設計合成

根據(jù)文獻報道，以單增李斯特菌hlyA基因作為靶基因，采用引物設計軟件Primer Explorer 4.0設計包括環(huán)引物在內(nèi)的6條LAMP引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，6條引物序列如下：

SEQ NO.1：hlyA-F3:CGCAATCAGTGAAGGGAA

SEQ NO.2：hlyA-B3:GTAAGTCTCCGAGGTTGC

SEQ NO.3：hlyA-FIP: GCCGTATGCCACACTTGAGAAACCTACAAGACCTTCCAGA

SEQ NO.4：hlyA-BIP: TTGATGCTGCCGTAAGTGGACGGCTTTGAAGGAAGAATT

SEQ NO.5：hlyA-LF:GCGCTTGCAACTGCTCTT

SEQ NO.6：hlyA-LB:AATCTGTCTCAGGTGATGTAGA

（2）阪崎腸桿菌LAMP檢測試劑盒除包括上述LAMP引物組外，還包括DNA聚合酶、2×反應液、熒光染料、密封液、陽性對照和陰性對照。其中反應液包含buffer緩沖液、甜菜堿和dNTPs，各成分體積比為10：8：7。

（3）檢測方法：

1）待檢樣品的提取：采用水煮法，將樣品稀釋液煮沸，上清液作為擴增反應DNA模板。

2）恒溫基因擴增檢測反應體系及條件：25μl反應體系含有：hlyA-F3 0.2μM，hlyA-B3 0.2μM，hlyA-FIP 0.8μM，hlyA-BIP 0.8μM，hlyA-LF 0.4μM，hlyA-LB 0.4μM，2×反應液12.5μl，DNA聚合酶8U，SYTO-9 0.5μl，待檢樣品2μl，用超純水補齊至25μl。密封液加入體積為20μl。同時設置陽性對照和陰性對照。

將配置好的PCR管混勻后離心，63℃反應45～60min，并在80℃持續(xù)2min。

3）檢測結(jié)果判斷：將上述反應管置于熒光PCR儀（如ABI stepone、ZYD-S1）中，根據(jù)擴增曲線來判斷檢測結(jié)果。擴增曲線呈“S”形，檢測結(jié)果為陽性，即檢測樣品中含有單增李斯特菌；無“S”形擴增曲線出現(xiàn)，檢測結(jié)果為陰性，即檢測樣品不含有單增李斯特菌。

實施例2： LAMP靈敏度實驗

將單增李斯特氏菌標準菌株接種于營養(yǎng)肉湯，36℃±1℃培養(yǎng)18小時。應用Magen細菌基因DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)產(chǎn)物中的細菌DNA。將單增李斯特氏菌標準菌株抽提的DNA進行10倍梯度稀釋，分別以1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl五個梯度濃度DNA作為模板和陰性對照（滅菌超純水）按照實施例1的反應體系和條件建立檢測方法，以確定試劑盒檢測方法的靈敏性。

參見圖1，結(jié)果表明：將單增李斯特氏菌基因組DNA進行10倍梯度稀釋后，建立的單增李斯特氏菌LAMP檢測試劑盒可檢測樣品中10pg/μl的單增李斯特氏菌DNA。

實施例3: LAMP特異性實驗

應用實施例1的LAMP檢測試劑盒對金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、阪崎腸桿菌、福氏志賀氏菌、大腸埃希氏菌及副溶血性弧菌進行檢測，檢測結(jié)果如圖2所示。設置單增李斯特菌DNA為陽性對照，滅菌超純水為陰性對照。從圖2中可以看出，只有單增李斯特氏菌出現(xiàn)陽性結(jié)果，其他菌株為陰性結(jié)果直至反應時間延長至60min。說明實施例1的LAMP反應體系只對單增李斯特氏菌有特異性。

SEQUENCE LISTING

<110> 中華人民共和國廣州機場出入境檢驗檢疫局，暨南大學，廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司

<120> 一種單核細胞增生李斯特氏菌的LAMP引物組及檢測試劑盒與使用方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列hlyA-F3

<400> 1

cgcaatcagt gaagggaa 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列hlyA-B3

<400> 2

gtaagtctcc gaggttgc 18

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列hlyA-FIP

<400> 3

gccgtatgcc acacttgaga aacctacaag accttccaga 40

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列hlyA-BIP

<400> 4

ttgatgctgc cgtaagtgga cggctttgaa ggaagaatt 39

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列hlyA-LF

<400> 5

gcgcttgcaa ctgctctt 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列hlyA-LB

<400> 6

aatctgtctc aggtgatgta ga 22