技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于食品安全的分子生物學(xué)檢測(cè)方法領(lǐng)域，特別涉及一種金黃色葡萄球菌的LAMP引物組及檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：
：

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于微球菌科葡萄球菌屬，是一種革蘭氏陽(yáng)性球菌，廣泛分布于自然界，如：空氣、水、灰塵、地面及人和動(dòng)物的排泄物中，是人類化膿性感染以及細(xì)菌性中毒中最常見(jiàn)的病原體之一。如條件適宜，金黃色葡萄球菌會(huì)大量繁殖，產(chǎn)生一定量的腸毒素，引起食物中毒。近年來(lái)，美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌，而我國(guó)每年由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居于全世界第四位。目前，世界各國(guó)都把金黃色葡萄球菌列為食品衛(wèi)生的法定檢測(cè)項(xiàng)目。金黃色葡萄球菌所引起的疾病已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，嚴(yán)重危害人類安全和健康。

目前我國(guó)對(duì)于金黃色葡萄球菌包括耐藥金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)及生化鑒定、免疫檢測(cè)和PCR檢測(cè)技術(shù)等。傳統(tǒng)檢測(cè)金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)方法操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且靈敏度較低；免疫學(xué)方法縮短了檢測(cè)時(shí)間，雖然靈敏度較高但特異性差。采用PCR技術(shù)可以快速、靈敏地從食品中檢測(cè)金黃色葡萄球菌，但因PCR技術(shù)對(duì)模板DNA的質(zhì)量有較高要求，需要的熱循環(huán)及凝膠電泳等設(shè)備價(jià)格昂貴而很難在基層得到推廣及現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是一種新型等溫核酸擴(kuò)增方法，主要利用4種不同的特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域，并利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（BstDNAploymerase），在恒溫條件（65℃左右）下快速擴(kuò)增核酸，保證了擴(kuò)增的高特異性和高效率，在1h內(nèi)能達(dá)到10⁹～10¹⁰靶序列拷貝。LAMP方法具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、靈敏度和特異性高且成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，已在核酸研究、疾病診斷、病原檢測(cè)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明的目的在于提供一種金黃色葡萄球菌的LAMP引物組。根據(jù)金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因（nuc）保守區(qū)序列設(shè)計(jì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，利用LAMP技術(shù)擴(kuò)增靶基因的特定區(qū)域，從分子水平上實(shí)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)，為金黃色葡萄球菌檢測(cè)提供一種更有效更快速的核酸篩查檢測(cè)方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述LAMP檢測(cè)試劑盒及使用方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種金黃色葡萄球菌的LAMP引物組，包括一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示：

SAnuc-F3:CGCTACTAGTTGCTTAGTGTTA，

SAnuc-B3:GCTAAGCCACGTCCATAT；

SAnuc-FIP:ACTGTTGGATCTTCAGAACCACCAAGTCTAAGTAGCTCAGCAA，

SAnuc-BIP:AGCGATTGATGGTGATACGGTTCAGGACCATATTTCTCTACACC；

SAnuc-LF:TACGCCGTTATCTGTTTGTGA，

SAnuc-LB:AGGTCAACCAATGACATTCAGA。

一種含有上述LAMP引物組的檢測(cè)試劑盒，包括以下物質(zhì)：（1）DNA聚合酶；（2）2×反應(yīng)緩沖液；（3）熒光染料；（4）密封液；（5）標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板；（6）陰性對(duì)照；（7）上述的LAMP引物組。

在上述檢測(cè)試劑盒中，所述LAMP引物組的濃度的比例如下：外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物的摩爾比為：1-2：4-8：2-4。

在上述檢測(cè)試劑盒中，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶。

在上述檢測(cè)試劑盒中，所述2×反應(yīng)緩沖液包含buffer緩沖液、甜菜堿和dNTPs，三者體積比為10：8：7。

在上述檢測(cè)試劑盒中，所述熒光染料為濃度是0.02mM的SYTO-9。

在上述檢測(cè)試劑盒中，所述密封液為礦物油。

在上述檢測(cè)試劑盒中，所述標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板為金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA；所述陰性對(duì)照為滅菌超純水。

使用上述LAMP試劑盒檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，包括以下步驟：

（1）待檢樣品的提?。翰捎盟蠓◤拇龣z樣品中提取DNA；

（2）反應(yīng)體系及條件：25μl反應(yīng)體系含有：SAnuc-F3 0.2μM，SAnuc-B3 0.2μM，SAnuc-FIP 0.8μM，SAnuc-BIP 0.8μM，SAnuc-LF 0.4μM，SAnuc-LB 0.4μM，2×反應(yīng)液12.5μl，DNA聚合酶8U，SYTO-9 0.5μl，待檢樣品2μl，用超純水補(bǔ)齊至25μl；密封液加入體積為20μl；同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；將配置好的PCR管混勻后離心，63℃反應(yīng)45～60min，并在80℃持續(xù)2min；

（3）檢測(cè)結(jié)果判斷：將上述反應(yīng)管置于熒光PCR儀（如ABI stepone、ZYD-S1）中，根據(jù)擴(kuò)增曲線來(lái)判斷檢測(cè)結(jié)果。擴(kuò)增曲線呈“S”形，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即檢測(cè)樣品中含有金黃色葡萄球菌；無(wú)“S”形擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果為陰性，即檢測(cè)樣品不含有金黃色葡萄球菌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

（1）特異性好：本發(fā)明根據(jù)金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因（nuc）設(shè)計(jì)六條特異引物，對(duì)靶基因6個(gè)區(qū)域進(jìn)行特異擴(kuò)增，特異性強(qiáng)，且與其他菌株無(wú)交叉反應(yīng)。

（2）快速高效：整個(gè)擴(kuò)增只用45～60min即可完成，擴(kuò)增產(chǎn)量可達(dá)10⁹～10¹⁰個(gè)拷貝；

（3）操作便捷：不需要使用昂貴、精密的設(shè)備，對(duì)儀器要求低，只需要一部恒定溫度儀就能反應(yīng)和檢測(cè)，條件比較簡(jiǎn)單；

（4）鑒定簡(jiǎn)單：可通過(guò)觀察擴(kuò)增曲線直接判斷陰陽(yáng)性，不需要繁瑣的電泳等其他任何分析步驟，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

附圖說(shuō)明：

圖1為L(zhǎng)AMP靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；其中，從左至右依次為濃度1ng/μl、100pg/μl、10 pg/μl和1 pg/μl金黃色葡萄球菌基因組DNA模板LAMP反應(yīng)結(jié)果。

圖2為L(zhǎng)AMP特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)的說(shuō)明，但不應(yīng)該當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：一種金黃色葡萄球菌的LAMP引物的設(shè)計(jì)合成和檢測(cè)試劑盒的建立

（1）LAMP引物的設(shè)計(jì)合成

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以金黃色葡萄球菌nuc基因作為靶基因，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer 4.0設(shè)計(jì)包括環(huán)引物在內(nèi)的6條LAMP引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，6條引物序列如下：

SEQ NO.1 :SAnuc-F3:CGCTACTAGTTGCTTAGTGTTA

SEQ NO.2 :SAnuc-B3:GCTAAGCCACGTCCATAT

SEQ NO.3 :SAnuc-FIP: ACTGTTGGATCTTCAGAACCACCAAGTCTAAGTAGCTCAGCAA

SEQ NO.4:SAnuc-BIP:

AGCGATTGATGGTGATACGGTTCAGGACCATATTTCTCTACACC

SEQ NO.5 :SAnuc-LF:TACGCCGTTATCTGTTTGTGA

SEQ NO.6 :SAnuc-LB:AGGTCAACCAATGACATTCAGA

（2）金黃色葡萄球菌LAMP檢測(cè)試劑盒除包括上述LAMP引物組外，還包括DNA聚合酶、2×反應(yīng)液、熒光染料、密封液、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。其中反應(yīng)液包含buffer緩沖液、甜菜堿和dNTPs，各成分體積比為10：8：7。

（3）檢測(cè)方法：

1）待檢樣品的提?。翰捎盟蠓ǎ瑢悠废♂屢褐蠓?，上清液作為擴(kuò)增反應(yīng)DNA模板。

2）恒溫基因擴(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)體系及條件：25μl反應(yīng)體系含有：SAnuc-F3 0.2μM，SAnuc-B3 0.2μM，SAnuc-FIP 0.8μM，SAnuc-BIP 0.8μM，SAnuc-LF 0.4μM，SAnuc-LB 0.4μM，2×反應(yīng)液12.5μl，DNA聚合酶8U，SYTO-9 0.5μl，待檢樣品2μl，用超純水補(bǔ)齊至25μl。密封液加入體積為20μl。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

將配置好的PCR管混勻后離心，63℃反應(yīng)45～60min，并在80℃持續(xù)2min。

3）檢測(cè)結(jié)果判斷：將上述反應(yīng)管置于熒光PCR儀（如ABI stepone、ZYD-S1）中，根據(jù)擴(kuò)增曲線來(lái)判斷檢測(cè)結(jié)果。擴(kuò)增曲線呈“S”形，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，即檢測(cè)樣品中含有金黃色葡萄球菌；無(wú)“S”形擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果為陰性，即檢測(cè)樣品不含有金黃色葡萄球菌。

實(shí)施例2： LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)

將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，36℃±1℃培養(yǎng)18小時(shí)。應(yīng)用Magen細(xì)菌基因DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)產(chǎn)物中的細(xì)菌DNA。將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株抽提的DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別以1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl五個(gè)梯度濃度DNA作為模板和陰性對(duì)照（滅菌超純水）按照實(shí)施例1的反應(yīng)體系和條件建立檢測(cè)方法，以確定試劑盒檢測(cè)方法的靈敏度。

參見(jiàn)圖1，結(jié)果表明：將金黃色葡萄球菌基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋后，建立的金黃色葡萄球菌LAMP檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)樣品中1pg/μl的金黃色葡萄球菌DNA。

實(shí)施例3: LAMP特異性實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用實(shí)施例1的LAMP檢測(cè)試劑盒對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、阪崎腸桿菌、單細(xì)胞增生李斯特氏菌、福氏志賀氏菌、大腸埃希氏菌及副溶血性弧菌按照上述反應(yīng)體系和條件進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。設(shè)置金黃色葡萄球菌基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，滅菌雙蒸水為陰性對(duì)照。從圖2中可以看出，只有金黃色葡萄球菌出現(xiàn)“S”形擴(kuò)增曲線，呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，其他菌株均未出現(xiàn)“S”形曲線，呈現(xiàn)陰性結(jié)果直至反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至60min。說(shuō)明實(shí)施例1的LAMP反應(yīng)體系只對(duì)金黃色葡萄球菌有特異性。

SEQUENCE LISTING

<110> 中華人民共和國(guó)廣州機(jī)場(chǎng)出入境檢驗(yàn)檢疫局，暨南大學(xué)，廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司

<120> 一種金黃色葡萄球菌的LAMP引物組及檢測(cè)試劑盒與使用方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列SAnuc-F3

<400> 1

cgctactagt tgcttagtgt ta 22

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列SAnuc-B3

<400> 2

gctaagccac gtccatat 18

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列SAnuc-FIP

<400> 3

actgttggat cttcagaacc accaagtcta agtagctcag caa 43

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列SAnuc-BIP

<400> 4

agcgattgat ggtgatacgg ttcaggacca tatttctcta cacc 44

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列SAnuc-LF

<400> 5

tacgccgtta tctgtttgtg a 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列SAnuc-LB

<400> 6

aggtcaacca atgacattca ga 22