本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種利用工程的化釀酒酵母生產(chǎn)3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸是重要的齊墩果烷型五環(huán)三萜類化合物。該類化合物屬于具有特殊價值的植物次生代謝產(chǎn)物，具有抗感染、抗輻射、抗干旱等多種抵御生物和非生物脅迫方面的重要功能，許多物質(zhì)具有抵御人類疾病的藥物活性。3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸廣泛分布在人參(Panax ginseng)、甘草(Glycyrrhiza uralensis)、中華雪膽(Hemsleya chinensis cogn)、女貞子(Glossy privet fruit)、油橄欖(Olea europaea)、楤木(Chinese aralis)、蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)等多種植物的葉片、果實及根莖中，具有抗炎、抗腫瘤、治療二型糖尿病及臨床上治療傳染性急性黃疸型肝炎等多種藥理活性，其中，齊墩果酸片作為一種非處方藥物已經(jīng)在中國境內(nèi)銷售超過20年，是一類具有重要藥理活性的天然產(chǎn)物。

目前獲得3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸的主要方式是從各種植物材料中提取。以乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等有機溶劑作為萃取液，通過超臨界二氧化碳萃取、溶劑萃取和色譜柱分離幾種方法的組合從植物材料中分離獲得3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸。然而3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸在植物中的積累量較少，如果直接從植物中提取存在工藝復雜、能耗高、生產(chǎn)周期較長等問題，且提取工藝往往需要高溫和有機溶劑，不僅提取成本高，也會造成環(huán)境污染。同時，植物材料中3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸的含量也受到季節(jié)，氣候，土地等因素的限制，是一種勞動密集型，土地占用率高的產(chǎn)業(yè)。此外，3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸由于其分子結(jié)構(gòu)的復雜性使得化學合成也難以實現(xiàn)。而利用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸生長周期短、過程可控，能夠緩解對植物資源的依賴，具有可觀的經(jīng)濟效益和綠色環(huán)保的社會效益。

與植物相比，微生物具有培養(yǎng)時間短，基因操作簡單，不受季節(jié)、氣候、土地等因素限制的優(yōu)點，能夠利用廉價的碳源，通過大規(guī)模發(fā)酵，獲得高附加值的天然產(chǎn)物。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為真核模式微生物，遺傳背景清晰，基因操作簡單，且具有完整的細胞內(nèi)膜系統(tǒng)有利于萜類合成相關(guān)環(huán)化酶、P450酶、糖基轉(zhuǎn)移酶的活性表達，同時釀酒酵母內(nèi)源的MVA途徑能夠提供更多的胞內(nèi)IPP，目前，釀酒酵母作為宿主已成功生產(chǎn)出倍半萜類化合物青蒿素、二萜類化合物紫杉二烯、三萜類化合物β-香樹脂醇及四萜類化合物β-胡蘿卜素等多種萜類化合物，被認為是萜類合成的適宜底盤宿主。通過在釀酒酵母中引入β-香樹脂醇合酶、齊墩果酸合酶、UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶實現(xiàn)利用釀酒酵母生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸，將為植物天然產(chǎn)物的微生物高效合成提供有效的技術(shù)支持。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為解決3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸在植物中積累量低和化學法難以合成的局限，提供一種利用釀酒酵母工程菌生產(chǎn)3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸的方法。

為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種能夠生產(chǎn)3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸的釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法。首先對來源于植物的細胞色素單加氧酶，細胞色素還原酶，以及UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的基因進行密碼子優(yōu)化并利用化學法合成相應(yīng)基因。其中包括分別來自蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)、葡萄(Vitis vinifera)和黨參(Maesa lanceolata)的P450細胞色素單加氧酶基因CYP716A12(Genbank注冊序列號為DQ335781.1)、CYP716A15(Genbank注冊序列號為AB619802.1)和CYP716A75(Genbank注冊序列號為KF318733.1)；分別來自蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)、青蒿(Artemisia annua)和人參(Panax ginseng)的細胞色素還原酶基因MtCPR(Genbank注冊序列號為XM_003602850.2)、AaCPR(Genbank注冊序列號為EF197890.1)和PgCPR(Genbank注冊序列號為KJ622356.1)以及來自歐洲山芥(Barbarea vulgaris)的UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因UGT73C10(Genbank注冊序列號為JQ291613.1)、UGT73C11(Genbank注冊序列號為JQ291614.1)和UGT73C12(Genbank注冊序列號為JQ291615.1)。然后利用釀酒酵母的啟動子(P)和終止子(T)分別構(gòu)建P450細胞色素單加氧酶基因表達盒(啟動子-細胞色素單加氧酶-終止子)，細胞色素還原酶基因表達盒(啟動子-細胞色素還原酶-終止子)以及UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因表達盒(啟動子-UDP葡萄糖轉(zhuǎn)移酶-終止子)。其中P450細胞色素單加氧酶基因表達盒P_GAL1-CYP716A12-T_CYC1、細胞色素還原酶基因表達盒P_GAL10-MtCPP-T_ADH1和UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因表達盒P_GAL1-UGT73C10-T_CYC1通過DNA大片段組裝構(gòu)建釀酒酵母表達載體pESC-URA-P_GAL1-CYP716A12-T_CYC1-P_GAL10-MtCPP-T_ADH1和pESC-TRP-P_GAL1-UGT73C10-T_CYC1。通過將這兩個表達載體共同轉(zhuǎn)化到能夠生產(chǎn)β-香樹脂醇的釀酒酵母中Sgib中，得到的工程菌SpUOpTG，能夠生產(chǎn)齊墩果酸，3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸。其中，Sgib是本實驗室早期構(gòu)建的一株能夠生產(chǎn)β-香樹脂醇的釀酒酵母，涉及本實驗室早期專利(專利授權(quán)公布號為CN 103509726 B)。

以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Sgib作為底盤宿主，通過外源導入兩個表達載體pESC-URA-P_GAL1-CYP716A12-T_CYC1-P_GAL10-MtCPP-T_ADH1和pESC-TRP-P_GAL1-UGT73C10-T_CYC1使其能夠生產(chǎn)齊墩果酸，3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸。其中啟動子P_GAL1為釀酒酵母半乳果糖激酶基因(GAL1)的啟動子，終止子T_CYC1釀酒酵母細胞色素C1基因(CYC1)的終止子，啟動子P_GAL10為釀酒酵母UDP-葡萄糖差向異構(gòu)酶基因(GAL10)的啟動子，所述終止子T_ADH1為釀酒酵母乙醇脫氫酶基因(ADH1)的終止子。由于啟動子P_GAL1和啟動子P_GAL10均為半乳糖誘導表達的誘導型啟動子，因此釀酒酵母工程菌SpUOpTG在發(fā)酵過程中通過添加半乳糖，能夠誘導P450細胞色素單加氧酶CYP716A12、細胞色素還原酶MtCPR和UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶UGT73C10的表達。其中P450細胞色素單加氧酶CYP716A12和細胞色素還原酶MtCPR共同作用于β-香樹脂醇，將其C28位的甲基氧化為羧基生成齊墩果酸；齊墩果酸在UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶UGT73C10的作用下，其C3位的羥基與UDP-葡萄糖結(jié)合后脫水生成3-O-葡萄糖基齊墩果酸；3-O-葡萄糖基齊墩果酸能夠在UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶UGT73C10的作用下進一步與UDP-葡萄糖反應(yīng)生產(chǎn)纖維二糖齊墩果酸，從而實現(xiàn)利用工程化釀酒酵母同時生產(chǎn)齊墩果酸，3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸。

本發(fā)明中所述表達盒均指能夠在釀酒酵母中有效表達目的基因的DNA序列，表達盒的結(jié)構(gòu)包括啟動目的基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，目的基因以及終止目的基因轉(zhuǎn)錄的終止子。

本發(fā)明的釀酒酵母工程菌具有以下優(yōu)點：

1、P450細胞色素單加氧酶CYP716A12、細胞色素還原酶MtCPR和UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶UGT73C10的表達受到半乳糖的誘導，從而實現(xiàn)在特定階段生產(chǎn)齊墩果酸，3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸，降低齊墩果酸，3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸這三種具有抑菌活性的物質(zhì)對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞的傷害，提高產(chǎn)量，優(yōu)化發(fā)酵工藝。

2、本發(fā)明的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌代謝葡萄糖和半乳糖直接合成齊墩果酸，3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸，實現(xiàn)了植物次生代謝產(chǎn)物齊墩果酸，3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸的釀酒酵母人工合成。

3、本發(fā)明利用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌代謝葡萄糖和半乳糖直接合成齊墩果酸，3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸。其中合成的3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸能夠透過釀酒酵母細胞膜直接進入發(fā)酵液中，簡化了下游的分離萃取工藝，降低了成本。

附圖說明

圖1是基因CYP716A12和MtCPR編碼的P450細胞色素單加氧酶和細胞色素還原酶將β-香樹脂醇轉(zhuǎn)化為齊墩果酸的反應(yīng)示意圖；

圖2是基因UTG73C10編碼的UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶對齊墩果酸進行糖基化生成3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸的反應(yīng)示意圖；

圖3是釀酒酵母工程菌株SpUOpTG的代謝網(wǎng)絡(luò)示意圖；

圖4是釀酒酵母工程菌株SpUOpTG生產(chǎn)齊墩果酸，3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸的高效液相質(zhì)譜分析圖，4-1：胞內(nèi)提取物中的齊墩果酸，4-2：胞內(nèi)提取物中的3-O-葡萄糖基齊墩果酸，4-3：胞內(nèi)提取物中的纖維二糖齊墩果酸，4-4：發(fā)酵液上清提取物中的3-O-葡萄糖基齊墩果酸，4-5轉(zhuǎn)化后發(fā)酵液上清提取物中的纖維二糖齊墩果酸。

圖5是釀酒酵母工程菌株SpUOpTG生產(chǎn)齊墩果酸氣相質(zhì)譜分析圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實施例中使用的PCR引物序列：

實施例1合成基因CYP716A12、MtCPR以及UGT73C10

基因CYP716A12編碼的P450細胞色素單加氧酶和基因MtCPR編碼的細胞色素還原酶，共同作用能夠?qū)ⅵ?香樹脂醇氧化生成齊墩果酸(見圖1)；基因UGT73C10編碼的UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)R墩果酸C-3位的羥基糖基化生成3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸(見圖2)。從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到來自蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)的P450細胞色素單加氧酶基因CYP716A12，來自蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)的細胞色素還原酶基因MtCPR以及來自歐洲山芥(Barbarea vulgaris)的UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的基因UGT73C10的序列，利用密碼子優(yōu)化軟件JCAT對三個基因進行密碼子優(yōu)化，使其氨基酸編碼序列符合釀酒酵母的密碼子偏好性。優(yōu)化后的P450細胞色素單加氧酶基因CYP716A12(SEQ ID NO.1)、細胞色素還原酶基因MtCPR(SEQ ID NO.2)、UGT73C10(SEQ ID NO.3)通過基因合成公司利 用化學法進行合成，并克隆到pUC57克隆載體上得到pUC57-CYP716A12、pUC57-MtCPR和pUC57-UGT73C10。

實施例2構(gòu)建基因CYP716A12、MtCPR以及UGT73C10的表達載體

以由公司合成的經(jīng)過密碼子優(yōu)化的pUC57-CYP716A12為模板，采用引物CYP716A12-F-BamHI和CYP716A12-R-SalI擴增蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)的P450細胞色素單加氧酶酶基因CYP716A12，得到長度1455bp的CYP716A12基因片段。通過限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI同時對基因片段和載體pESC-URA酶切，將上述所得基因片段與表達載體pESC-URA連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株，提取質(zhì)粒pESC-URA-P_GAL1-CYP716A12-T_CYC1，對質(zhì)粒上CYP716A12基因進行測序驗證，其序列如SEQ ID No.1所示，結(jié)果表明正確無誤。

以由公司合成的經(jīng)過密碼子優(yōu)化的pUC57-CPR為模板，采用引物MtCPR-F-ClaI和MtCPR-R-NotI擴增蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)細胞色素還原酶基因MtCPR，得到長度2100bp的MtCPR基因片段。通過限制性內(nèi)切酶ClaI和NotI同時對基因片段和載體pESC-URA-P_GAL1-CYP716A12-T_CYC1酶切，將上述所得基因片段與表達載體pESC-URA-P_GAL1-CYP716A12-T_CYC1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株，提取質(zhì)粒pESC-URA-P_GAL1-CYP716A12-T_CYC1-P_GAL10-CPR-T_ADH1，對質(zhì)粒上CPR基因進行測序驗證，其序列如SEQ ID No.2所示，結(jié)果表明正確無誤。

以由公司合成的經(jīng)過密碼子優(yōu)化的pUC57-UGT73C10為模板，采用引物對UGT73C10-F-BamHI和UGT73C10-R-KpnI擴增歐洲山芥(Barbarea vulgaris)的UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因UGT73C10，得到長度1504bp的UGT73C10基因片段。通過限制性內(nèi)切酶BamHI和KpnI同時對基因片段和載體pESC-TRP酶切，將上述所得基因片段與表達載體pESC-TRP連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株，提取質(zhì)粒pESC-TRP-P_GAL1-UGT73C10-T_CYC1，對質(zhì)粒上UGT73C10基因進行測序驗證，其序列如SEQ ID No.3所示，結(jié)果表明正確無誤。

實施例3：構(gòu)建生產(chǎn)齊墩果酸、3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸的工程化釀酒酵母

利用醋酸鋰化學轉(zhuǎn)化法將實施例2中構(gòu)建的表達載體pESC-URA-P_GAL1-CYP716A12-T_CYC1-P_GAL10-MtCPR-T_ADH1和pESC-TRP-P_GAL1-UGT73C10-T_CYC1，共轉(zhuǎn)化到能夠生產(chǎn)β-香樹脂醇的釀酒酵母菌株Sgib中。將化轉(zhuǎn)產(chǎn)物涂布于缺少尿嘧啶和色氨酸的含2％葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(SD-URA-TRP)篩選平板上，30℃培養(yǎng)2-5天。從篩選平板上隨機挑選6-10個克隆，分別提取其質(zhì)粒。以提取的質(zhì)粒為模板，采用引物對CYP716A12-F-BamHI和CYP716A12-R-SalI擴增蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)的P450細胞色素單加氧酶酶基因CYP716A12；引物對MtCPR-F-ClaI和MtCPR-R-NotI擴增蒺藜狀苜蓿(Medicago truncatula)的細胞色素還原酶基因MtCPR；引物對UGT73C10-F-BamHI和UGT73C10-R-KpnI擴增歐洲山芥(Barbarea vulgaris)的UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因UGT73C10驗證轉(zhuǎn)化結(jié)果，結(jié)果顯示兩個質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化到釀酒酵母Sgib菌株中，并將該菌株命名為SpUOpTG，其代謝網(wǎng)絡(luò)示意圖如圖3所示。

實施例4：利用釀酒酵母工程菌SpUOpTG生產(chǎn)齊墩果酸、3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸

挑取實施例3中構(gòu)建的釀酒酵母工程菌SpUOpTG的單菌落接于SD-URA-TRP液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)36小時后，以體積比5％的接種量接于新的SD-URA-TRP液體培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)48小時，添加半乳糖至2g/L，連續(xù)培養(yǎng)5天。發(fā)酵結(jié)束后，離心，分別收集菌體和上清。

將收集到的菌體置于1.5mL離心管中，添加600μL甲醇丙酮混合液(1:1)和直徑1mm的玻璃珠，珠打破碎三次，每次5分鐘；離心后收集上清，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃條件下蒸發(fā)1個小時將液體蒸干；用色譜級甲醇對蒸干后的白色固體重溶，經(jīng)0.2nm有機相濾膜過濾后利用注射器注入液相小瓶，利用液相 質(zhì)譜對胞內(nèi)產(chǎn)物進行檢測，產(chǎn)物中有齊墩果酸、3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸，檢測結(jié)果見圖4。將液相小瓶中的樣品再次蒸干后，利用N，O-雙(三甲基硅基)三氟代乙酰胺試劑對其進行烷基化降低齊墩果酸熔點，利用氣相質(zhì)譜對胞內(nèi)產(chǎn)物進行檢測，檢測結(jié)果如圖5所示.

將收集到的上清置于表面蒸發(fā)皿中，加熱蒸發(fā)至固體粉末；利用乙酸乙酯萃取后保留上清，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃條件下蒸發(fā)1個小時將液體蒸干；用色譜級甲醇對蒸干后的白色固體重溶，經(jīng)0.2nm有機相濾膜過濾后利用注射器注入液相小瓶，利用液相質(zhì)譜對胞內(nèi)產(chǎn)物進行檢測，檢測到3-O-葡萄糖基齊墩果酸和纖維二糖齊墩果酸，說明齊墩果酸的糖基化產(chǎn)物能夠跨過工程化釀酒酵母的細胞膜，檢測結(jié)果見圖4。