本發(fā)明涉及蓋塔病毒診斷和檢測領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于蓋塔病毒實時熒光定量PCR檢測體系及檢測方法。

背景技術(shù)：

蓋塔病毒(GETV)是一種RNA病毒，屬披蓋病毒科甲病毒屬成員，廣泛分布于亞洲及澳大利亞北部的太平洋沿岸地區(qū)，在中國、印度、巴基斯坦、東南亞、日本等國家和地區(qū)均有蓋塔病毒流行的報道。1955年，該病毒在馬來西亞首次分離到，一年后在日本也分離到這種病毒。六十年代，澳大利亞研究者進行了人和動物血清抗體檢查，證明了GETV對人和動物的感染性。1978年，甲野等首次在日本賽馬群中發(fā)現(xiàn)了由本病毒引起的傳染病，兩個月之內(nèi)感染了同群的大部分馬匹。病馬以體溫升高(38.5-41℃，持續(xù)1-4天)癥狀為主，約1/3的病馬伴隨發(fā)疹和浮腫，一周后可痊愈。痊愈馬血清中出現(xiàn)特異性中和抗體、補結(jié)抗體和血凝抑制抗體。當時采用組織培養(yǎng)病毒接種健康馬，能引起與自然病馬同樣的癥狀。1979和1983年，該病再次在日本流行，全國大約1/4的馬匹呈血清陽性，流行期間20％～70％的感染馬出現(xiàn)臨床癥狀。此后，滅活疫苗開始用于該病的預防。對馬致病性的發(fā)現(xiàn)，重新引起了學者們對GETV的興趣，尤其是GETV對人類和其它攜帶抗體動物的致病性方面。

目前，檢測蓋塔病毒的主要方法有病原分離、血凝和血凝抑制方法、間接免疫熒光(IFA)、普通的RT-PCR方法等等，但是病原分離的方法需要的時間比較長，需要在生物安全三級實驗室進行，而血凝抑制的特異性和敏感性并不能滿足檢驗檢疫的要求，另外間接免疫熒光法需要較昂貴的顯微鏡和有經(jīng)驗的實驗人員，且該方法經(jīng)驗性較強，耗時長，難度相對較大，不易操作，最后普通的RT-PCR方法相比于前兩種方法雖然具有操作簡便、速度快、以及特異性強等優(yōu)點，但是當病毒含量比較低時，會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，靈敏度比較低。

鑒于以上問題的存在，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種用于蓋塔病毒實時熒光定量PCR檢測的檢測體系，所述檢測體系中所包含的引物組特異性強，重復性好，靈敏度高，檢測的最低模板量可以達到2.61x10¹copies/μl，而普通的RT-PCR方法最低只能檢測到2.61x10⁵copies/μl，其靈敏度可以達到常規(guī)的RT-PCR技術(shù)的10000倍。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種蓋塔病毒的實時熒光定量PCR檢測方法，該檢測方法操作簡便，檢測效率高，當病毒含量非常低時，依然能進行準確的檢測，完全不會有假陰性的結(jié)果發(fā)生，避免了錯誤率，并且該檢測方法相對與常用的其他檢測方法具有更高的敏感性、特異性以及準確性，此外該檢測方法還具有很強的應用性，可良好的用于蓋塔病毒的檢測，彌補了蓋塔病毒實時熒光定量PCR檢測的相關(guān)技術(shù)空白。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種用于蓋塔病毒實時熒光定量PCR的檢測體系，包括包括用于擴增蓋塔病毒基因序列的引物組，所述引物組由具有SEQ ID No.1所示堿基序列的上游引物，具有SEQ ID No.2所示堿基序列的下游引物組成。

本發(fā)明提供的用于蓋塔病毒實時熒光定量PCR的檢測體系，特異性強，重復性好，靈敏度高，其靈敏度可以達到常規(guī)的RT-PCR技術(shù)的10000倍，該引物組是發(fā)明人通過參照GenBank收錄的所有蓋塔基因序列保守區(qū)進行特定設(shè)計的一對具有特異性的引物，因此特異性非常好，采用該引物組用于蓋塔病毒實時熒光定量PCR檢測在本領(lǐng)域中尚屬首創(chuàng)，現(xiàn)有技術(shù)中沒有任何記載。

另外，該檢測體系還包括熒光染料，所述熒光染料為SYBR Green I熒光染料，其中SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBR Green I的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。

本發(fā)明還提供了一種用于蓋塔病毒實時熒光定量PCR檢測方法，具體包括如下步驟：

以上述的檢測體系對待測樣品進行實時熒光定量PCR檢測。

本發(fā)明這種蓋塔病毒的實時熒光定量PCR檢測方法，操作簡便，檢測效率高，當病毒含量非常低時，依然能進行準確的檢測，完全不會有假陰性的結(jié)果發(fā)生，避免了錯誤率，并且該檢測方法相對與常用的其他檢測方法具有更高的敏感性、特異性以及準確性，此外該檢測方法具有很強的應用性，可良好的用于蓋塔病毒的檢測，彌補了蓋塔病毒實時熒光定量PCR檢測的相關(guān)技術(shù)空白，也為類似于蓋塔病毒的其他病原基因的檢測奠定了相關(guān)的定量分析基礎(chǔ)，給本領(lǐng)域技術(shù)人員以相關(guān)技術(shù)啟示。

優(yōu)選地，在進行實時熒光定量PCR檢測之前，需要先建立Ct值與標準樣品的不同拷貝數(shù)所構(gòu)成的標準曲線。

優(yōu)選地，實時熒光定量PCR檢測所用的待測樣品為蓋塔病毒的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。

因此，在真正的進行實時熒光定量PCR檢測的過程中，將待測樣品與標準樣品以相同的反應體系和PCR程序進行實時熒光定量PCR，得到的Ct值與所述標準曲線比對，即可得到待測樣品中蓋塔病毒基因的表達量。

其中，在相同的反應體系和PCR程序進行實時熒光定量PCR的檢測結(jié)果是可以直接由電腦軟件讀出的，不需要進行后續(xù)處理，這種操作步驟避免了檢測結(jié)果假陽性的產(chǎn)生及對環(huán)境的污染，實現(xiàn)了待測樣品的定量檢測，整個檢測過程大概只需1h左右，相對于常規(guī)的RT-PCR方法，大大簡化了操作步驟，縮短了檢測時間，提高了勞動效率。

并且，預先采用標準樣品制得標準曲線，然后將待測樣品以與標準樣品同樣的條件進行實時熒光定量PCR，得到的Ct值與標準曲線比對，即可得知待測樣品中蓋塔病毒基因的表達量，通過這種操作方式可以完全避免其他因素對表達量的影響，增加了測定蓋塔病毒基因的準確度，這也是采用實時熒光定量PCR檢測方法的優(yōu)勢所在。

更進一步的，標準樣品的制備方法包括：

(A)提取蓋塔病毒的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；

(B)采用上游引物、下游引物對cDNA進行PCR擴增，反應后進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目標片段，即得。

其中，對蓋塔病毒的總RNA進行實際提取操作時，一般是按照以下步驟進行：將Vero細胞置于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO₂的細胞培養(yǎng)箱，待細胞長到單層90％密度時，將培養(yǎng)基棄去，并用PBS溶液洗滌2次，按照MOI:0.5的量將GETV病毒液加入T25培養(yǎng)瓶中，并補充無血清的DMEM培養(yǎng)基至5mL，將培養(yǎng)瓶放入37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-5d，然后將培養(yǎng)瓶放入-80℃的冰箱中，反復凍融三次后將病毒液取出，離心轉(zhuǎn)速9000g，離心5min，取上清-80℃保存?zhèn)溆茫缓蟛捎迷噭┖嗅槍σ呀?jīng)離心的GETV病毒液上清進行總RNA提取，本發(fā)明采用的試劑盒一般為北京全式金生物技術(shù)有限公司ViralDNA/RNAKit試劑盒，按照上述操作步驟即可完成整個蓋塔病毒的總RNA的提取。

后續(xù)，經(jīng)在Genbank網(wǎng)站，查找GETV毒株M1NSP1的基因序列(GenBank登錄號為EU015061)，比對GenBank中GETV各亞型代表株，XY0904(JN582181)、HB0234(EU015062)、YN0540(EU015063)的NSP1序列，設(shè)計特異性引物，上游引物GETV-F，序列為：GAGAAAGAAGTGCTTGC，下游引物GETV-R，序列為：GGTGATCTTCTTTACCAC，擴增出的目標片段大小為150bp，以用于標準樣品的制作。

回收目標片段時，最好是先將目標片段連接至載體上，進行質(zhì)粒擴增，擴增后提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確后，該質(zhì)粒為標準樣品。

優(yōu)選地，上述步驟所用的載體為pMD18-T載體。

優(yōu)選地，質(zhì)粒擴增的具體步驟為：將回收的目標片段克隆至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，挑取生長良好的菌落培養(yǎng)。

挑取了生長良好的菌落進行測序鑒定，如果測序的結(jié)果與GETV毒株M1序列一致的情況下，說明本發(fā)明的目標基因片段擴增完全正確，該質(zhì)粒擴增的方法簡單易行，且容易獲得大量含有目標片段的質(zhì)粒。

優(yōu)選地，實時熒光定量PCR檢測的PCR反應體系為SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)10-13μl，上游引物1-2μl、下游引物1-2μl，檢測樣品1-2μl，ddH₂O補齊至25μL，其中，上游引物的濃度最好控制在0.1-0.2μmol之間，下游引物的濃度最好控制在0.1-0.2μmol之間。

待測樣品采用該PCR反應體系進行實時熒光定量PCR，得到的曲線穩(wěn)定。此外，PCR反應體系的選擇可以根據(jù)選用的試劑盒推薦進行，還可以選用其他體積，如常用的20μl體系、50μl體系等，其中成分的含量只需要相應地降低或升高即可。

優(yōu)選地，實時熒光定量PCR擴增程序為：94-95℃預變性30-35s，94-95℃變性5-7s，55-60℃退火20-30s，共35-40個循環(huán)。以該實時熒光定量PCR擴增程序進行擴增，擴增特異性好，擴增得到的數(shù)據(jù)穩(wěn)定。

此外，對標準樣品反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA采用相同的PCR反應體系和PCR擴增程序進行實時熒光定量PCR，可以得到標準曲線。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明的用于蓋塔病毒實時熒光定量PCR檢測的引物組特異性強，重復性好，靈敏度高，檢測的最低模板量可以達到2.61x10¹copies/μl，而普通的RT-PCR方法最低只能檢測到2.61x10⁵copies/μl，其靈敏度可以達到常規(guī)的RT-PCR技術(shù)的10000倍；

(2)本發(fā)明提供的蓋塔病毒的實時熒光定量PCR檢測方法，操作簡便，檢測效率高，當病毒含量非常低時，依然能進行準確的檢測，完全不會有假陰性的結(jié)果發(fā)生，避免了錯誤率，并且該檢測方法相對與常用的其他檢測方法具有更高的敏感性、特異性以及準確性；

(3)本發(fā)明的蓋塔病毒的實時熒光定量PCR檢測方法具有很強的應用性，可良好的用于蓋塔病毒的檢測，彌補了蓋塔病毒實時熒光定量PCR檢測的相關(guān)技術(shù)空白，也為類似于蓋塔病毒的其他病原基因的檢測奠定了相關(guān)的定量分析基礎(chǔ)，給本領(lǐng)域技術(shù)人員以相關(guān)技術(shù)啟示。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為本發(fā)明實施例1的蓋塔基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；

圖2為本發(fā)明實施例2的不同拷貝數(shù)濃度標準品的實時熒光定量RT-PCR擴增曲線圖；

圖3為本發(fā)明實施例2中實時熒光定量RT-PCR標準曲線圖；

圖4為本發(fā)明實施例3中不同拷貝數(shù)濃度標準品的常規(guī)RT-PCR電泳圖；

圖5為本發(fā)明實施例3中實時熒光定量RT-PCR特異性試驗結(jié)果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1

1、引物的設(shè)計與合成：

經(jīng)在Genbank網(wǎng)站，查找GETV毒株M1NSP1的基因序列(GenBank登錄號為EU015061)，比對GenBank中GETV各亞型代表株，XY0904(JN582181)、HB0234(EU015062)、YN0540(EU015063)的NSP1序列，設(shè)計特異性擴增引物，上游引物GETV-F，序列為：AGCATTTTCGCATCTGGCTAC，下游引物GETV-R，序列為：TCTGGGTCTTCCGCACTTTT。

2、總RNA的提取及cDNA的合成：

1)將Vero細胞置于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5％CO₂的細胞培養(yǎng)箱，待細胞長到單層90％密度時，將培養(yǎng)基棄去，并用PBS溶液洗滌2次，按照MOI:0.5的量將GETV病毒液加入T25培養(yǎng)瓶中，并補充無血清的DMEM培養(yǎng)基至5mL，將培養(yǎng)瓶放入37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4-5d，然后將培養(yǎng)瓶放入-80℃的冰箱中，反復凍融三次后將病毒液取出，離心轉(zhuǎn)速9000g，離心5min，取上清-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2)然后采用北京全式金生物技術(shù)有限公司ViralDNA/RNAKit試劑盒針對已經(jīng)離心的GETV病毒液上清進行總RNA提?。?/p>

3)按照北京全式金生物技術(shù)有限公司-UniOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix試劑盒說明書，將步驟b總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成總cDNA，總cDNA樣品保存至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、蓋塔病毒基因的常規(guī)PCR擴增：

以上述反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用引物GETV-F和GETV-R對蓋塔病毒基因進行常規(guī)PCR擴增。

常規(guī)PCR擴增體系如下：

PCR反應程序為：95℃預變性5min，再以35個循環(huán)進行PCR擴增，擴增條件為95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，最后再72℃延伸10min。

得到的PCR產(chǎn)物取10μL進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。圖1顯示有符合預期大小(約150bp)的條帶。

4、回收目標片段

得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀察到符合預期大小(約150bp)的目標片段，用手術(shù)刀片將其小心切下后，擴增產(chǎn)物采用OMEGAGelExtractionKit試劑盒純化回收，然后克隆到pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化到DH5α平板，挑取生長良好的菌落，進行測序鑒定，測序結(jié)果與GETV毒株M1序列一致，表明基因片段的擴增完全正確，并采用OMEGAPlasmidMiniKitI試劑盒提取陽性重組質(zhì)粒，即為標準樣品。

實施例2制作標準曲線

利用紫外分光光度計定量，將計算好拷貝數(shù)的標準DNA作為模板，以10倍系列稀釋，稀釋濃度在2.61x10¹⁰copies/μl，采用熒光定量PCR反應體系和反應程序，在定量熒光PCR儀上進行PCR擴增，繪制標準溶解曲線，儀器使用BIO-RADCFX96TMRealTimeSystem，在稀釋的線性濃度范圍內(nèi)，擴增曲線良好，呈光滑“S”型，具體擴增曲線如圖2所示，反應結(jié)束后，自動生成標準曲線，標準曲線圖如圖3所示。

從圖3中可以看出，模板量與對應的Ct值之間線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.99，說明本實施例建立的檢測方法可以準確檢測蓋塔病毒GETV，Ct值分別為28.59、25.17、22.41、19.46、15.71、12.85、10.93和8.73，標準曲線的斜率為-2.8887，截距為31.87，直線方程為y＝-2.8887x+31.87。

其中，實時熒光定量PCR檢測的反應體系為：

反應程序為：95℃預變性30s，95℃變性5s，55℃退火20s，共40個循環(huán)。

實施例3

1、實時熒光定量PCR與常規(guī)PCR靈敏度的對比

將GETV病毒液分別進行普通RT-PCR檢測與實時熒光定量RT-PCR檢測，但是普通RT-PCR檢測方法最低只能檢測到2.61x10⁵copies/μl，從圖4的普通RT-PCR檢測方法的敏感性電泳圖可以清楚的看到，但是采用實時熒光定量RT-PCR檢測的方法卻可以能檢測到最低模板量為2.61x10¹copies/μl，這一點從圖2的擴增曲線結(jié)果也可以清晰的得知，因此其敏感性比普通PCR檢測方法高10000倍，本發(fā)明的檢測方法具有更高的靈敏度。

其中圖4中，各樣品病毒拷貝數(shù)為：

1：2.61x10⁸copies/μl

2：2.61x10⁷copies/μl

3：2.61x10⁶copies/μl

4：2.61x10⁵copies/μl

5：2.61x10⁴copies/μl

6：2.61x10³copies/μl

7：2.61x10²copies/μl

2、實時熒光定量PCR的重復性

利用DPS軟件對不同濃度cDNA分別進行5批次的批內(nèi)和批間的重復性實驗，結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)均小于1％，批間變異系數(shù)均小于2％，說明本發(fā)明的方法具有較好的組間重復性，該方法獲得的數(shù)據(jù)比較穩(wěn)定。

表2實時熒光定量RT-PCR的重復性試驗結(jié)果

3、實時熒光定量PCR的特異性

利用本發(fā)明建立起來的實時熒光定量PCR方法對分別檢測了GETV、CDV、HSV、CPV和SIV病毒，具體結(jié)果參照圖5，發(fā)現(xiàn)只有GETV檢測結(jié)果為陽性(熒光信號超過閾值)，其他對照樣品檢測結(jié)果均為陰性(熒光信號均未超過閾值)，表明該方法中的引物具有較高的特異性，能夠特異地檢測到蓋塔病毒。

實施例4

制作標準曲線的方法步驟與實施例2基本相同，只是熒光定量PCR反應體系和反應程序具體如下：

實時熒光定量PCR檢測的反應體系為：

反應程序為：94℃預變性35s，94℃變性7s，60℃退火30s，共35個循環(huán)。

用該PCR反應體系進行了標準曲線的制作，以及待檢測樣品的檢測，結(jié)果與實施例2一致。

實施例5

制作標準曲線的方法步驟與實施例2基本相同，只是熒光定量PCR反應體系和反應程序具體如下：

實時熒光定量PCR檢測的反應體系為：

反應程序為：94℃預變性32s，94℃變性6s，60℃退火25s，共38個循環(huán)。

用該PCR反應體系進行了標準曲線的制作，以及待檢測樣品的檢測，結(jié)果與實施例2一致。

盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。