本發(fā)明涉及動物基因工程和遺傳修飾領(lǐng)域，具體涉及一種利用crispr/cas9系統(tǒng)共同敲除山羊mstn和fgf5基因的方法。
背景技術(shù)：
：crispr/cas系統(tǒng)是細菌和古細菌內(nèi)通過rna介導的特異性切外源遺傳物質(zhì)的獲得性免疫系統(tǒng)，可用來對抗入侵的病毒及外源dna。crispr/cas9系統(tǒng)通過將入侵噬菌體和質(zhì)粒dna的片段整合到crispr中，并利用相應(yīng)的crisprrnas(crrnas)來指導同源序列的降解，從而提供免疫性。ii型crispr/cas系統(tǒng)即crispr/cas9已經(jīng)被證明可以在試管中高效切割任意給定的dna。crispr/cas9與傳統(tǒng)的zfn和talen技術(shù)相比效率高、序列選擇限制小(只需要基因組上出現(xiàn)gg即可)，并且其構(gòu)建過程簡單，針對每個基因只需構(gòu)建合適的sgrna。但crispr/cas9在哺乳動物細胞中會引起嚴重的脫靶效應(yīng)，利用cas9切口酶加上兩個相背著的pam、距離比較近并且可以結(jié)合在不同鏈上的sgrna可以大大降低脫靶效率。傳統(tǒng)的育種方法存在著育種年限長、一次選擇性狀數(shù)量有限等缺點，分子標記輔助選擇仍處于理論發(fā)展迅速但是很難應(yīng)用于生產(chǎn)實踐的問題，轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)的結(jié)合顯得尤為重要。與生長相關(guān)的重要基因——mstn，即肌生成抑制素，又稱生長/分化因子-8(gdf-8)。哺乳動物中mstn基因主要在骨骼肌中表達，該基因在非翻譯區(qū)的變異位點(a＞g)產(chǎn)生了干擾的靶位點，抑制了mstn基因的翻譯過程和調(diào)控功能，從而影響了動物肌肉的發(fā)育。fgf5即成纖維生長因子5被證明是影響毛發(fā)長度的重要因子，通過抑制毛囊毛乳頭細胞的活性來阻礙毛發(fā)的生長。通過crispr/cas9系統(tǒng)對山羊基因組中抑制肌肉生長的mstn和抑制羊絨生長的fgf5基因進行共同敲除，生產(chǎn)出肌肉發(fā)達、絨毛長的絨、肉兼用型山羊?qū)ξ覈竽翗I(yè)的長足發(fā)展具有重要意義。肌生成抑制蛋白(mstn)是哺乳動物骨骼肌質(zhì)量的一個保守的負調(diào)節(jié)因子。然而，在家畜中是否能夠?qū)崿F(xiàn)mstn的精確敲除，能否被安全地用來提高產(chǎn)肉性能，目前還未得到證實。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種利用crispr/cas9系統(tǒng)共同敲除山羊mstn和fgf5基因的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種利用crispr/cas9系統(tǒng)共同敲除山羊mstn和fgf5基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)構(gòu)建特異性靶向mstn第二外顯子和第三外顯子、fgf5第一外顯子的sgrna的體外轉(zhuǎn)錄載體；通過體外轉(zhuǎn)錄得到mstn第二外顯子和第三外顯子的sgrna-1m、sgrna-2m，fgf5第一外顯子的sgrna-1f、sgrna-2f；(2)體外轉(zhuǎn)錄cas9蛋白的體外轉(zhuǎn)錄載體，得到cas9mrna；(3)將步驟(1)和步驟(2)的sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f及cas9mrna純化后測濃度，混合，注射入山羊受精卵細胞質(zhì)中，然后經(jīng)體外培養(yǎng)后移植入同種雌性山羊輸卵管中，用于生產(chǎn)共同敲除mstn和fgf5的轉(zhuǎn)基因山羊。上述所述的sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f與cas9mrna混合后，終濃度為cas9mrna20ng/μl、sgrna-1m5ng/μl、sgrna-2m5ng/μl、sgrna-1f5ng/μl、sgrna-2f5ng/μl。最上面所述的一種利用crispr/cas9系統(tǒng)共同敲除山羊mstn和fgf5基因的方法，其特征在于，所述的sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f的dna序列的體外轉(zhuǎn)錄載體為體外轉(zhuǎn)錄載體puc57-t7-grna。最上面所述的一種利用crispr/cas9系統(tǒng)共同敲除山羊mstn和fgf5基因的方法，其特征在于，特異性靶向為mstn第二外顯子和第三外顯子的兩對sgrna-1m、sgrna-2m寡核苷酸序列、fgf5第一外顯子的兩對sgrna-1f、sgrna-2f寡核苷酸。本發(fā)明還提供了上述利用crispr/cas9系統(tǒng)共同敲除山羊mstn和fgf5基因的方法的下列應(yīng)用：(1)將sgrna-1m、sgrna-2m共同或單獨與cas9mrna同時轉(zhuǎn)染至細胞，用于研究mstn基因的功能；(2)將sgrna-1m、sgrna-2m共同或單獨與cas9mrna同時注射入受精卵，然后通過胚胎移植用于生產(chǎn)靶向敲除mstn基因的轉(zhuǎn)基因山羊；(3)將sgrna-1m、sgrna-2m共同或單獨與cas9mrna同時轉(zhuǎn)染至細胞，篩選后用陽性細胞作為供核細胞通過核移植的方法生產(chǎn)靶向敲除mstn基因的轉(zhuǎn)基因山羊；(4)將sgrna-1f、sgrna-2f共同或單獨與cas9mrna同時轉(zhuǎn)染至細胞，用于研究fgf5基因的功能；(5)將sgrna-1f、sgrna-2f共同或單獨與cas9mrna同時注射入受精卵，然后通過胚胎移植用于生產(chǎn)靶向敲除fgf5基因的轉(zhuǎn)基因山羊；(6)將sgrna-1f、sgrna-2f共同或單獨與cas9mrna同時轉(zhuǎn)染至細胞，篩選后用陽性細胞作為供核細胞通過核移植的方法生產(chǎn)靶向敲除fgf5基因的轉(zhuǎn)基因山羊。(7)將sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f與cas9mrna同時注射入受精卵，然后通過胚胎移植用于生產(chǎn)共同敲除mstn基因和fgf5基因的轉(zhuǎn)基因山羊；(8)將sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f與cas9mrna同時轉(zhuǎn)染至細胞，篩選后用陽性細胞作為供核細胞通過胚胎移植用于生產(chǎn)共同敲除mstn基因和fgf5基因的轉(zhuǎn)基因山羊；(9)將sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f中任意兩個或兩個以上sgrna與cas9mrna同時注射入受精卵，然后通過胚胎移植用于生產(chǎn)特異靶向敲除的轉(zhuǎn)基因山羊；(10)將sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f中任意兩個或兩個以上sgrna與cas9mrna同時轉(zhuǎn)染至細胞，篩選后用陽性細胞作為供核細胞通過胚胎移植用于生產(chǎn)特異靶向敲除的轉(zhuǎn)基因山羊。此系統(tǒng)的工作原理是crrna(crispr-derivedrna)通過堿基配對與tracrrna(trans-activatingrna)結(jié)合形成tracrrna/crrna復合物，此復合物引導核酸酶cas9蛋白在與crrna配對的序列靶位點剪切雙鏈dna。而通過人工設(shè)計這兩種rna，可以改造形成具有引導作用的sgrna(singleguiderna)，足以引導cas9對dna的定點切割。作為一種rna導向的dsdna結(jié)合蛋白，cas9效應(yīng)物核酸酶是已知的第一個統(tǒng)一因子(unifyingfactor)，能夠共定位rna、dna和蛋白，從而擁有巨大的改造潛力。將蛋白與無核酸酶的cas9(cas9nuclease-null)融合，并表達適當?shù)膕grna，可靶定任何dsdna序列，而sgrna的末端可連接到目標dna，不影響cas9的結(jié)合。因此，cas9能在任何dsdna序列處帶來任何融合蛋白及rna，這為生物體的研究和改造帶來巨大潛力。本發(fā)明的基因序列：1、利用crispr/cas9系統(tǒng)共同敲除山羊mstn和fgf5基因的方法，針對山羊mstn第二外顯子和第三外顯子、fgf5第一外顯子特異性靶位點序列，其特征在于，其在基因組中的位置如表1所示。表12、特異性靶向mstn第二外顯子和第三外顯子的兩對sgrna-1m、sgrna-2m寡核苷酸序列、fgf5第一外顯子的兩對sgrna-1f、sgrna-2f寡核苷酸序列，其特征在于，其靶向位點如表1所示，其堿基序列如表2所示。sgrna-1mtopstrandtaggtctcagatatatccacagtsgrna-1mbottomstrandaaacactgtggatatatctgagasgrna-2mtopstrandtaggattttgaagcttttggatsgrna-2mbottomstrandaaacatccaaaagcttcaaaatsgrna-1ftopstrandtaggctgccacggagaggaaccsgrna-1fbottomstrandaaacggttcctctccgtggcagsgrna-2ftopstratndtaggcagcctctactgcagagtsgrna-2fbottomstrandaaacactctgcagtagaggctg表23、利用crispr/cas9系統(tǒng)共同敲除山羊mstn和fgf5基因的方法，表3為mstn和fgf5目的片段檢測及擴增所用引物序列；表3具體實施方式為了使本發(fā)明的的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明實施例提供了一種利用crispr/cas9系統(tǒng)共同敲除山羊mstn和fgf5基因的方法，包括以下步驟：(1)構(gòu)建特異性靶向mstn第二外顯子和第三外顯子、fgf5第一外顯子的sgrna的體外轉(zhuǎn)錄載體；通過體外轉(zhuǎn)錄得到mstn第二外顯子和第三外顯子的sgrna-1m、sgrna-2m，fgf5第一外顯子的sgrna-1f、sgrna-2f；(2)體外轉(zhuǎn)錄cas9蛋白的體外轉(zhuǎn)錄載體，得到cas9mrna；(3)將步驟(1)和步驟(2)的sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f及cas9mrna純化后測濃度，將sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f和cas9mrna混合，注射入山羊受精卵細胞質(zhì)中，然后經(jīng)體外培養(yǎng)后移植入同種雌性山羊輸卵管中，用于生產(chǎn)共同敲除mstn和fgf5的轉(zhuǎn)基因山羊。其中所述的sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f與cas9mrna混合后，終濃度為cas9mrna20ng/μl、sgrna-1m5ng/μl、sgrna-2m5ng/μl、sgrna-1fsng/μl、sgrna-2f5ng/μl。所述的sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f的dna序列的體外轉(zhuǎn)錄載體為puc57-t7-grna。特異性靶向為mstn第二外顯子和第三外顯子的兩對sgrna-1m、sgrna-2m寡核苷酸序列、fgf5第一外顯子的兩對sgrna-1f、sgrna-2f寡核苷酸。步驟一：針對mstn基因和fgf5基因的crispr/cas9系統(tǒng)的構(gòu)建1、根據(jù)ncbi中山羊基因組序列，選擇山羊基因組中mstn基因第二外顯子和第三外顯子作為靶位點設(shè)計sgrna-1m、sgrna-2m，fgf5基因的第一外顯子作為靶位點設(shè)計sgrna-1f、sgrna-2f，其靶位點序列如表1所示，sgrna序列如表2所示。表1表22、含有特定sgrna序列的puc57-t7-grna載體的構(gòu)建：(1)設(shè)計并合成識別mstn基因第二外顯子和第三外顯子的sgrna-1m、sgrna-2m及識別fgf5基因的第一外顯子作為靶位點設(shè)計sgrna-1f、sgrna-2f；(2)合成后的sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f成對寡核苷酸分別進行體外退火；(3)將sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f通過bsai位點進行酶切、連接，插入到puc57-t7-grna中，分別命名為puc57-t7-sgrna-1m、puc57-t7-sgrna-2m、puc57-t7-sgrna-1f、puc57-t7-sgrna-2f；針對mstn基因和fgf5基因的crispr/cas9系統(tǒng)即為：體外轉(zhuǎn)錄載體puc57-t7-sgrna-1m、puc57-t7-sgrna-2m、puc57-t7-sgrna-1f、puc57-t7-sgrna-2f和pst1374-nls-flag-linker-cas9。步驟二：體外轉(zhuǎn)錄利用構(gòu)建好的載體puc57-t7-sgrna-1m、puc57-t7-sgrna-2m、puc57-t7-sgrna-1f、puc57-t7-sgrna-2f和cas9mrna的體外轉(zhuǎn)錄載體pst1374-nls-flag-linker-cas9進行以t7啟動子介導的體外轉(zhuǎn)錄。(1)將puc57-t7-sgrna-1m、puc57-t7-sgrna-2m、puc57-t7-sgrna-1f、puc57-t7-sgrna-2f分別用drai線性化，pst1374-nls-flag-linker-cas9用age1線性化；(2)用megashortscriptkit(ambion)試劑盒按照說明書進行puc57-t7-sgrna-1m、puc57-t7-sgrna-2m、puc57-t7-sgrna-1f、puc57-t7-sgrna-2f、pst1374-nls-flag-linker-cas9的體外轉(zhuǎn)錄；(3)用megaclearkit(ambion)試劑盒按照說明書進行sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f、cas9mrna的純化。步驟三：利用針對mstn基因和fgf5基因的crispr/cas9系統(tǒng)mrna生產(chǎn)共同敲除mstn基因和fgf5基因的基因打靶山羊1、原核注射及胚胎移植從經(jīng)過同期發(fā)情后自然交配的供體母山羊體內(nèi)通過手術(shù)收集處于單細胞階段的胚胎(大約在受精后14h)，利用顯微注射儀將預混好的sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f、cas9mrna混合物(混合后終濃度為cas9mrna20ng/μl，sgrna-1m、sgrna-2m、sgrna-1f、sgrna-2f5ng/μl)注射入山羊受精卵的細胞質(zhì)中。注射后的受精卵轉(zhuǎn)移至quinn’sadvantagecleavagemedium(sagebiopharma，nj，usa)體外37℃培養(yǎng)24h，然后移植至受體母羊的輸卵管壺腹部與峽部連接處，生產(chǎn)共同敲除mstn基因和fgf5基因的基因打靶山羊。2、共同敲除mstn基因和fgf5基因的基因打靶山羊的鑒定受體母羊生產(chǎn)后，待羔羊長至1周齡后采羔羊的血樣，提取羔羊血液基因組dna。以羔羊血液基因組為模版，分別設(shè)計針對mstn基因第二外顯子和第三外顯子的引物，針對fgf5基因第一外顯子的引物。序列如表3，進行擴增，對獲得的pcr產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行產(chǎn)物體系回收，回收后的pcr產(chǎn)物進行t7en1酶切，酶切完后進行電泳檢測，檢測結(jié)果顯示兩條或多條條帶的可能為基因打靶成功；將回收后的pcr產(chǎn)物送測序并進行序列分析，結(jié)合t7en1酶切結(jié)果和測序結(jié)果分析確定陽性個體；對陽性個體的pcr產(chǎn)物克隆至t載體，轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆再次進行測序，根據(jù)測序結(jié)果更深一步確定基因敲除成功的陽性個體及陽性個體中堿基的變化方式。表3以上雖然已經(jīng)用一般性說明、具體實施方式對本發(fā)明做了詳盡的描述，但其僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁12