本發(fā)明涉及一種miRNA的標志物，特別涉及一種可檢測工頻電磁輻射的miRNA標志物。

背景技術：

microRNA(miRNA)是一類長度約為19-25nt的內源性非編碼RNA，廣泛參與基因轉錄后調控活動，具有重要的生命調節(jié)功能。細胞間的相互作用可通過釋放蛋白質、核酸、脂質等分子到胞外，與受體結合從而介導胞內信號轉導。除了這些單分子以外，細胞還可以釋放膜囊泡，通過水平轉移功能性的mRNA、miRNA和蛋白質到受體細胞，改變細胞的功能。外泌體和微泡就是其中的兩種，參與細胞通訊、細胞遷移、血管新生和腫瘤細胞生長等過程。

有研究顯示，10Hz極低頻電磁場可以誘導膜損傷，致鈣離子內流，相應地增加了微泡的釋放。旁效應可通過受照射的細胞與未照射細胞間的相互作用而誘導，而調節(jié)這種通信的信號分子可以是細胞因子、氧自由基、NO甚至是miRNA。由受照射的細胞培養(yǎng)基提取的外泌體可能會誘導旁效應，而miR-21，作為已知的參與DNA損傷的microRNA，受外泌體調控，在受照后表達上調，沉默miR-21后，旁效應明顯減弱，以上結果充分顯示外泌體攜帶的miRNA在射線誘導的旁效應中起到非常大的作用。

當電磁場強度超過人體可接受的極限值時,電磁場的短時間和長時間作用都對人體產生現(xiàn)實的危害性。目前沒有能及時監(jiān)測的指標?，F(xiàn)階段，還沒有關于工頻電磁場引起機體miRNA變化的相關研究。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是尋找機體受極低頻電磁場照射后的時間和劑量標志物，早期發(fā)現(xiàn)受損傷人群，提早防護或治療，并彌補現(xiàn)有技術的不足。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

1)將實驗動物置于輻射環(huán)境中；

2)抽取實驗動物血液，提取RNA；

3)檢測RNA中工頻miRNA標志物的含量，根據(jù)miRNA標志物的含量確定工頻電磁輻射情況。

優(yōu)選的，所述實驗動物為小鼠。

優(yōu)選的，所述工頻miRNA標志物為一種工頻電磁輻射照射時間的miRNA標志物的組合，由mmu-miR-200a-3p，mmu-miR-374b-5p中的至少一種組成。

優(yōu)選的，所述工頻miRNA標志物為一種工頻電磁輻射的照射劑量miRNA標志物：

1)0.1mT照射劑量的標志物為：mmu-miR-151-3p，mmu-miR-152-3p，mmu-miR-15b-3p，mmu-miR-181d-5p，mmu-miR-204-3p，mmu-miR-215-3p，mmu-miR-223-5p，mmu-miR-3969，mmu-miR-431-5p，mmu-miR-451a，mmu-miR-93-5p中的至少一種；

2)0.5mT照射劑量的標志物為：mmu-miR-133a-3p，mmu-miR-335-5p，mmu-miR-455-5p中的至少一種；

3)2.5mT照射劑量的標志物為：mmu-miR-142a-5p，mmu-miR-30b-5p，mmu-miR-374c-3p，mmu-miR-410-3p，mmu-miR-652-3p中的至少一種。

本發(fā)明提供的工頻電磁輻射檢測方法，具有準確度高，靈敏度好，應用簡便的特點。

附圖說明

圖1電鏡下血清外泌體形狀及粒徑。

圖2劑量組別microRNA集合圖；相關圖注：0.5mT和0.1mT共有的microRNA0.1mT劑量組和2.5mT劑量組共有的microRNA2.5mT劑量組，0.1mT劑量組和0mT劑量組共有的microRNA0.1mT劑量組和0mT劑量組共有的microRNA0.5mT劑量組，0.1mT劑量組和0mT劑量組共有的microRNA四個劑量組共有的microRNA0.5mT和2.5mT共有的microRNA0.5mT劑量組，2.5mT劑量組和0mT劑量組共有的microRNA0.5mT和0.1mT共有的microRNA2.5mT劑量組和0mT劑量組共有的microRNA只存在于0mT劑量組的microRNA。

圖3時間組別microRNA集合圖：相關圖注：只在存在于第10天的microRNA第10天和第90天共有的microRNA只在存在于第90天的microRNA第10天和第30天共有的microRNA第10天，第30天和第90天共有的microRNA第30天和第90天共有的microRNA只在存在于第30天的microRNA。

具體實施方式

實施例1.動物和工頻電磁場照射

本實驗采用了初始年齡為4-6周的雄性Balb/c小鼠，共130只。隨機分為13組，每組10只。本實驗共有0,0.1,0.5,2.5mT四個劑量，每個劑量按照射天數(shù)10天，30天，90天分為3組，每組每天照射8小時，照射期滿后取樣。初始未照射組作為對照組進行比較。

實施例2.血清的收集：

采用眼球后靜脈叢取血法對每只小鼠進行取血。每只小鼠約獲得800-1200ul外周血。樣品于4℃冰箱中靜置4-5小時后，4000rpm，4℃，離心15分鐘。每個樣品均吸取200ul的上清液，并匯總各組的10個樣品，收集于滅菌過的離心管中，共2ml。超速離心法提取外泌體。

實施例3.外泌體形狀分析

1)納米顆粒跟蹤分析技術鑒定提取外泌體的粒徑大小及分布

納米顆粒在其懸濁液中受到周邊溶液分子的撞擊而做無規(guī)則的布朗運動，然后通過斯托克斯-愛因斯坦方程，這些顆粒在單位時間內的移動速度與其本身的粒度、溶液的粘度和溫度存在數(shù)量上的關系。因此通過觀察溶液中的顆粒運動軌跡，得出與之相關的顆粒粒徑數(shù)據(jù)。同時，通過儀器內置的高速相機和軟件，對觀察到的每一個顆粒進行跟蹤分析，最終提供與常規(guī)粒度儀所不同的粒徑數(shù)量分布以及顆粒物濃度的分析結果。

2)透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)和大小

3)Western Blotting方法鑒定外泌體膜表面標志物TSG101，CD63

實施例4.Micro RNA深度測序和生物信息學分析

對于small RNA測序實驗，從總RNA到最終的cDNA文庫制備完成主要包括以下步驟：用電泳切膠法獲取長度范圍在18～30nt左右的RNA片段；片段進行末端修復并在其兩端分別連接5’-adapter和3’-adapter；隨后擴增，得到最終的cDNA文庫；DNA文庫上機測序。

實施例5.信息分析流程

Illumina HiSeqTM 2500測序所得51nt序列(Reads)集，通過去掉Reads兩端的接頭、去掉低質量Reads、去污染等過程完成數(shù)據(jù)初步過濾，得到干凈序列，對其進行序列長度分布的統(tǒng)計及樣本間公共序列統(tǒng)計。將清理之后的干凈序列進行分類注釋，可以獲得樣本中各組分及表達量信息。將所有小RNA片段注釋后，用剩下的未注釋片段進行新miRNA的預測。

結果如圖2和圖3所示：1)圖2表示的是劑量組別microRNA集合圖，四個橢圓分別代表0、0.1、0.5、2.5mT劑量組所包含的microRNA，數(shù)字代表所在獨立空間的microRNA數(shù)量，百分數(shù)字代表該區(qū)域microRNA占總體的百分比，如圖中所示13代表僅存在于0.1mT組的microRNA數(shù)量為13，占總體數(shù)量的20％；2)圖3表示時間組別microRNA集合圖：三個圓形分別代表第10、30、90天所包含的microRNA，數(shù)字代表所在獨立空間的microRNA數(shù)量，百分數(shù)字代表該區(qū)域microRNA占總體的百分比，如圖中所示12代表僅存在于第10天的microRNA數(shù)量為12，占總體數(shù)量的32.4％。