本發(fā)明具體涉及一種防治甘薯蔓割病的尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙?。

背景技術(shù)：

甘薯蔓割病是由尖孢鐮刀菌甘薯專化型fusariumoxysporumf.sp.batatas引起的甘薯維管束真菌病害。此病在我國(guó)主要分布在東南沿海各省，其中在浙江、福建危害最為嚴(yán)重，一般能使甘薯減產(chǎn)10％～20％，重者達(dá)50％。現(xiàn)有甘薯生產(chǎn)上采用最為主要的防治手段就是選育抗病品種，但是實(shí)際育種中總是難以將優(yōu)良的生產(chǎn)性狀與抗病性狀相結(jié)合，如在福建連城大規(guī)模種植的“90日早”、“巖薯7-3”不抗薯割病，需要采用藥劑等其他措施進(jìn)行甘薯蔓割病的防治。隨著人們對(duì)食品和環(huán)境安全要求的提高，生物防治作為一種綠色安全的措施越來(lái)越受到人們的重視，因而，探索甘薯蔓割病的生物防治技術(shù)有利于促進(jìn)甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

現(xiàn)階段尖孢鐮刀菌生防因子種類包括真菌(木霉trichoderma、叢枝菌根真菌arbuscularmycorrhizae、非致病尖孢鐮刀菌nonpathogenicfusariumoxysporum、淡紫擬青霉paecilomyceslilacinus)，細(xì)菌(假單胞桿菌pseudomonas、芽胞桿菌bacillus)、植物提取物、放線菌等。由于非致病型鐮刀菌菌株和致病菌株需要相似的生態(tài)條件，有相似的定殖行為和營(yíng)養(yǎng)需求，可與致病型菌株產(chǎn)生更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)作用，因而鐮刀菌非致病菌株是防效最好、最穩(wěn)定的生防因子之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題，在于提供一種防治甘薯蔓割病的尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙?。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種防治甘薯蔓割病的尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙?，所述菌株為尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4(fusariumoxysporumf.sp.batatas)，于2016年08月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccm2016435。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：對(duì)甘薯蔓割病具有生物防治效果，在pda培養(yǎng)基上表現(xiàn)出對(duì)致病菌營(yíng)養(yǎng)空間競(jìng)爭(zhēng)的拮抗效果，此生防菌株處理過(guò)甘薯后，能顯著降低蔓割病的發(fā)病率；在t-dna中加入了gfp綠色熒光蛋白標(biāo)記基因，便于生防菌的環(huán)境行為監(jiān)測(cè)；本發(fā)明為從自然環(huán)境中分離生防菌存在的問(wèn)題提供了解決的方法，也為其它作物上尖孢鐮刀菌引起病害的生防菌開(kāi)發(fā)提供借鑒。

附圖說(shuō)明

下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。

圖1是本發(fā)明中pcambia1300-ptrpc-hph-gfp用ecori和sali酶切后的電泳圖。

圖2是本發(fā)明中尖孢鐮刀菌甘薯專化型非致病突變菌株mg103-4的產(chǎn)孢能力的示意圖。

mg—尖孢鐮刀菌甘薯專化型菌株mg

mg50-5—尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4

具體實(shí)施方式

菌株保藏

尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4(fusariumoxysporumf.sp.batatasmg103-4)，于2016年08月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址為湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山，保藏編號(hào)為cctccm2016435

供試菌株:尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g(fusariumoxysporumf.sp.batatasmg)，于2016年08月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址為湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山，保藏編號(hào)為cctccm2016432。

尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4的具體制備方法如下：

1.1試驗(yàn)材料

甘薯品種新種花(蔓割病敏感型)由本研究室保存種植，pct74(上海北諾生物科技有限公司)，pcambia1300(北京華越洋生物科技有限公司)，pvok21由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)，pmd18-t購(gòu)自takara-寶生物工程(大連)有限公司；所有限制性內(nèi)切酶bstxi，sali，xhoi和ecori均購(gòu)自takara-寶生物工程(大連)有限公司，潮霉素b購(gòu)自roche公司，特美汀購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司，乙酰丁香酮、mes、混合纖維微孔濾膜均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，其余農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化用藥品均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2構(gòu)建雙元熒光載體pcambia1300-ptrpc-hph-gfp

首先用ecori和sali兩種限制性內(nèi)切酶分別酶切質(zhì)粒pct74和pcambia1300，回收獲得sali-ptoxa-gfp-nos-ecori和sali-pcambia1300-ecori，兩個(gè)片段相連接后構(gòu)建完成載體pcambia1300-gfp；然后用xhoi和bstxi兩種限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒pcambia1300-gfp(去除camv35s-hph片段)，并且以質(zhì)粒pkov21為模板(用真菌中常用的ptrpc啟動(dòng)子啟動(dòng)潮霉素b抗性基因表達(dá))，pcr擴(kuò)增ptrpc-hph片段，在片段首尾分別加入xhoi和bstxi酶切位點(diǎn)，引物為hphrc-f-xhoi和ptrpcrc-r-bstxi。

hphrc-f-xhoi：5′-ctcgagctatttctttgccctcggac-3′(如seqidno：1所示)；

ptrpcrc-r-bstxi：

5′-ccaacatggtgggtcgacagaagatgatattgaagg-3′(如seqidno：2所示)。

反應(yīng)體系：總體積50μl，2×gcbufferi25μl,dntpmixture(2.5mmol/leach)8μl,引物hphrc-f-xhoi(10μmol/l)1.25μl,引物ptrpcrc-r-bstxi(10μmol/l)1.25μl,模板pkov21(體系中質(zhì)粒終濃度為0.1-10ng)1.5μl,lataq0.5μl，用ddh2o補(bǔ)齊50μl，其中，試劑均購(gòu)自takara-寶生物工程(大連)有限公司。

反應(yīng)程序：第一步94℃預(yù)變性1min；第二步94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min，第二步30個(gè)循環(huán)；第三步72℃延伸10min。

pcr產(chǎn)物通過(guò)連接反應(yīng)插入pmd18-t載體后，獲得pmd18-ptrpc-hph并送往鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序，pmd18-ptrpc-hph序列如seqidno：3所示，進(jìn)行序列比對(duì)，測(cè)序結(jié)果正確后，用xhoi和bstxi酶切pmd18-ptrpc-hph質(zhì)粒并回收獲得bstxi-ptrpc-hph-xhoi片段。最后將pcambia1300-gfp骨架與bstxi-ptrpc-hph-xhoi片段連接獲得pcambia1300-ptrpc-hph-gfp載體。

在pcambia1300-ptrpc-hph-gfp質(zhì)粒構(gòu)建完成后，首先對(duì)pcambia1300-ptrpc-hph-gfp質(zhì)粒進(jìn)行ecori和sali酶切初步確定sali-ptoxa-gfp-nos-ecori片段已經(jīng)連入pcambia1300-ptrpc-hph骨架中(見(jiàn)圖1，其中標(biāo)識(shí)1代表marker標(biāo)準(zhǔn)分子量，標(biāo)識(shí)2是pcambia1300-ptrpc-hph-gfp質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證的條帶)，又進(jìn)行pcr擴(kuò)增ptrpc-hph片段(具體見(jiàn)1.2的試驗(yàn)方法)和gfp片段。

pcr擴(kuò)增gfp片段的反應(yīng)程序和反應(yīng)體系如下：

引物p28：5′-tagtggactgattggaatgcatggaggagt-3′；

引物p29：5′-gatagaacccatggcctatattcattcaat-3′。

反應(yīng)體系：總體積20μl，試劑均購(gòu)自takara-寶生物工程(大連)有限公司)：10×pcrbufferi2μl，dntpmixture(2.5mmol/leach)1.6μl，引物p28(10μmol/l)0.5μl,引物p29(10μmol/l)0.5μl,模板為pcambia1300-ptrpc-hph-gfp(體系中質(zhì)粒終濃度為0.1-10ng)1μl，rtaq0.2μl，用ddh2o補(bǔ)齊50μl。

反應(yīng)程序：第一步94℃預(yù)變性4min；第二步94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1.5min，第二步35個(gè)循環(huán)；第三步72℃延伸10min。

兩個(gè)pcr產(chǎn)物通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳及凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)，ptrpc-hph的pcr產(chǎn)物大小為1392bp，gfp的pcr產(chǎn)物大小為417bp，回收目的片段送往鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序，并進(jìn)行序列比對(duì)，gfp的pcr產(chǎn)物序列如seqidno：4所示，確定已經(jīng)將ptrpc-hph片段和gfp導(dǎo)入到載體pcambia1300中。

1.3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化情況檢測(cè)和轉(zhuǎn)化子單孢分離保存

尖孢鐮刀菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過(guò)程和使用的培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)(khangch,parksy,rhohs,etal.filamentousfungi(magnaporthegriseaandfusariumoxysporum)//agrobacteriumprotocols[m].totowa:humanapress,2007,403-420.)的方法略作改動(dòng)，改動(dòng)之處如下：

將尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g在pda固體培養(yǎng)基(1l培養(yǎng)基中含有200g馬鈴薯，15g葡萄糖，15g瓊脂粉)純化培養(yǎng)7d后，加入無(wú)菌水將分生孢子刮洗出來(lái)用2層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾，并用im液體培養(yǎng)基(見(jiàn)表1)將分生孢子濃度調(diào)整到1×10⁶cfu/ml，得尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g孢子懸浮液，備用。將轉(zhuǎn)入pcambia1300-ptrpc-hph-gfp載體的農(nóng)桿菌agl-1在mm液體培養(yǎng)基中(見(jiàn)表1)28℃，250r/min搖培2d后，用含200μmol/l乙酰丁香酮的im液體培養(yǎng)基將菌液濃度調(diào)整為od600＝0.15，接著搖培6h(od600約為0.6)，得農(nóng)桿菌液。將混合纖維微孔濾膜放置在含有200μmol/l乙酰丁香酮的cm固體培養(yǎng)基(見(jiàn)表1)上，之后將100μl尖孢鐮刀菌甘薯專化型菌株mg孢子懸浮液和100μl農(nóng)桿菌液混勻涂布在混合纖維微孔濾膜上，25℃，暗培養(yǎng)2d。共培養(yǎng)后將混合纖維微孔濾膜用刀劃成小塊分散擺放到篩選培養(yǎng)基(含潮霉素b濃度100μg/ml，特美汀濃度200μg/ml的pda培養(yǎng)基)上，28℃暗培養(yǎng)，得轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化過(guò)程所用各種菌均放置在隔水式恒溫培養(yǎng)箱gnp-9080型中培養(yǎng)。在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后，將轉(zhuǎn)化子整皿放置在bd-bgc1藍(lán)光切膠儀中，在藍(lán)色激發(fā)光下觀察菌落顏色。對(duì)于能發(fā)出綠色熒光的菌落挑取其孢子進(jìn)行單孢純化，將單孢形成的菌落再轉(zhuǎn)移到放置無(wú)菌濾紙片的篩選培養(yǎng)基上。待菌落長(zhǎng)到?jīng)]過(guò)濾紙后再將菌落放在藍(lán)光下觀察菌落顏色，若菌落依然發(fā)出綠色熒光，則將濾紙片放入無(wú)菌信封中保存。

表1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所需試劑及培養(yǎng)基配方表

構(gòu)建好的pcambia1300-ptrpc-hph-gfp載體通過(guò)agl-1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化入尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g，經(jīng)過(guò)潮霉素抗性篩選3d后長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子在藍(lán)色激發(fā)光下會(huì)發(fā)出綠色熒光，說(shuō)明帶gfp綠色熒光蛋白標(biāo)記基因的t-dna已成功整合入尖孢鐮刀菌甘薯?；突蚪M。轉(zhuǎn)化過(guò)程中一張5cm直徑混合纖維微孔濾膜上約涂布1×10⁶個(gè)分生孢子，最終每張膜約長(zhǎng)出10個(gè)轉(zhuǎn)化子，將發(fā)出綠色熒光的菌落挑取少量孢子單孢分離并濾紙片保存后，最終獲得了711個(gè)純化培養(yǎng)的尖孢鐮刀菌甘薯專化型突變體。

1.4尖孢鐮刀菌甘薯專化型非致病突變體的篩選(致病力初步檢測(cè))

生產(chǎn)上用5×10⁵cfu/ml尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g孢子懸浮液做致病力測(cè)定可以很好地區(qū)分不同抗性水平的甘薯，因此文中所有的尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g和轉(zhuǎn)化子接菌甘薯試驗(yàn)都是采用5×10⁵cfu/ml的孢子懸浮液濃度。配制好尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g孢子懸浮液和轉(zhuǎn)化子孢子懸浮液后，在田間剪取健康的新種花主莖頂部約20cm莖段，將傷口朝下浸泡入孢子懸浮液中20min后棄菌液，將莖段插入清水中培養(yǎng)(在賽福冷光源植物氣候箱中，溫度28℃，光周期16l:8d)，以尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g孢子懸浮液處理后新種花出現(xiàn)4級(jí)以上典型發(fā)病癥狀為準(zhǔn)開(kāi)始統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況(在合適條件下接種尖孢鐮刀菌甘薯專化型菌株mg孢子懸浮液5d即可發(fā)病至4級(jí)，7d后死亡)，以尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g孢子懸浮液和清水處理為對(duì)照，單個(gè)菌株處理10個(gè)莖段，3次重復(fù)。

蔓割病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：以株為單位，0(0.0)級(jí)：無(wú)??；1(0.1)級(jí)：地上部生長(zhǎng)正常，莖基部維管束變褐在3cm左右；2(0.2)級(jí)：地上部基本正常，莖基部維管束變褐在1/4左右；3(0.5)級(jí)：莖基部葉片變黃，維管束變褐在1/2以上；4(0.8)級(jí)：植株葉片多數(shù)變黃枯死，莖部維管束變褐?jǐn)U展及頂芽；5(1.0)級(jí)：全株枯死。

病情指數(shù)＝(0.1×n1+0.2×n2+0.5×n3+0.8×n4+1.0×n5)/n×100。

n為各級(jí)病株數(shù)；n為參試總株數(shù)。當(dāng)病情指數(shù)為0.0～20.5，植株表現(xiàn)高抗反應(yīng)時(shí)，認(rèn)定為突變體是非致病突變體。

對(duì)尖孢鐮刀菌甘薯專化型711個(gè)突變體進(jìn)行致病力檢測(cè)試驗(yàn)，獲得了40個(gè)致病力下降的突變體。對(duì)40個(gè)致病力下降的突變體非致病突變體的穩(wěn)定性檢測(cè)，包括平板轉(zhuǎn)接穩(wěn)定性和非致病性的穩(wěn)定性檢測(cè)，非致病突變體在pda固體培養(yǎng)基上至少轉(zhuǎn)接6代后，觀察菌落形態(tài)并放置在藍(lán)光下觀察是否能發(fā)出綠色熒光。性狀穩(wěn)定的突變體再接種新種花進(jìn)行致病力重復(fù)檢測(cè)，每次檢測(cè)10株，3次重復(fù)。最終得到尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4，且尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4致病力即病情指數(shù)為13.03，相對(duì)于野生型尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g的病情指數(shù)95.03顯著降低，新種花外觀未表現(xiàn)出發(fā)病癥狀。

1.5非致病突變體安全性檢測(cè)

將以尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g和尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4均配制成濃度約為2.67×10⁶cfu/ml的孢子懸浮液，分別取150ml與400ml滅菌土壤混勻裝盆，設(shè)置清水拌土對(duì)照。將田間采集的健康“新種花”莖段移栽至盆里，每盆10株，3次重復(fù)。將處理過(guò)的盆栽放在冷光源培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件設(shè)置為溫度28℃，濕度95％，光周期16l:8d。

由于上述步驟1.4的致病力初步檢測(cè)是僅用以無(wú)菌水為介質(zhì)的突變體孢子懸浮液處理新種花20min，而真正的生物防治菌株需要長(zhǎng)時(shí)間在土壤中作用于甘薯植株。因此試驗(yàn)又進(jìn)一步以尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4孢子懸浮液拌營(yíng)養(yǎng)土的方式接菌新種花以確定其安全性。以尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g孢子懸浮液拌土和無(wú)菌水拌土為對(duì)照，結(jié)果顯示相同培養(yǎng)條件下尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g處理的新種花在7d后發(fā)病在4級(jí)以上，無(wú)綠葉接近死亡，而尖孢鐮刀菌甘薯專化型非致病突變菌株mg103-4處理的新種花和水處理一樣未表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，病情指數(shù)顯著降低，相當(dāng)于甘薯高抗品種對(duì)于尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g的抗性反應(yīng)水平，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4這個(gè)突變體致病力喪失，持續(xù)接觸新種花依舊不會(huì)致病。

1.6轉(zhuǎn)化子產(chǎn)孢情況檢測(cè)

將單孢分離純化后的轉(zhuǎn)化子尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4在pda培養(yǎng)基上于28℃活化培養(yǎng)10～14d，在培養(yǎng)皿里加入無(wú)菌水用涂布器將分生孢子刮洗出來(lái)。刮洗液用2層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾制成孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，計(jì)算1皿(直徑為6cm)轉(zhuǎn)化子中所有的孢子數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次3皿。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

在pda培養(yǎng)基上，無(wú)論是尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g，還是非致病突變體尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4，正面菌絲質(zhì)地都呈現(xiàn)毛氈狀，背面色素分布深淺以及輪紋各不相同，并隨著不同培養(yǎng)時(shí)間批次有所差別。尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4的分生孢子產(chǎn)量也顯著下降(見(jiàn)圖2)。另外，尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4的孢子形態(tài)相對(duì)于野生型尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g并沒(méi)有發(fā)生顯著變化。

1.7生防效果檢測(cè)

1.7.1對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)將28℃暗培養(yǎng)5d的尖孢鐮刀菌甘薯專化型菌株mg和尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4的菌餅的邊緣用直徑為0.5cm的打孔器打孔，將尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g和尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4的菌餅分別對(duì)稱放置在pda培養(yǎng)基上距邊緣約直徑1/4處，28℃暗培養(yǎng)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7.2生防效果盆栽試驗(yàn)將尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4孢子配置濃度成5×10⁵cfu/ml的孢子懸浮液，將田間剪取的健康新種花主莖頂部20cm莖段傷口朝下浸泡其中，分別浸泡2、4、8、16、24h后取出，扦插于事先準(zhǔn)備好的含菌盆缽中(每盆約400ml的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)土與150ml2.67×10⁶cfu/ml濃度的尖孢鐮刀菌甘薯專化型菌株mg孢子懸浮液均勻混合)，每處理10株，重復(fù)3次，以清水浸苗扦插于相同尖孢鐮刀菌甘薯?；途阭g孢子濃度的土壤和無(wú)菌土為對(duì)照。將處理過(guò)的盆栽放在冷光源培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件設(shè)置為溫度28℃，濕度95％，光周期16l:8d。

對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果：

尖孢鐮刀菌甘薯專化型菌株mg和尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4在對(duì)峙培養(yǎng)5d后可以看到每一皿的兩菌落在培養(yǎng)皿中間出現(xiàn)明顯的呈直線菌落分界，菌絲間沒(méi)有互相融合，說(shuō)明尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4與尖孢鐮刀菌甘薯專化型菌株mg存在營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)和空間競(jìng)爭(zhēng)，菌絲擴(kuò)展速度相當(dāng)。但是，相對(duì)于尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4而言，尖孢鐮刀菌甘薯專化型菌株mg菌落更厚更稠密，生長(zhǎng)勢(shì)要更好。

表2不同預(yù)處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)甘薯蔓割病的防治效果

注：mg指代尖孢鐮刀菌甘薯?；途辏琺g55-7指代尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g55-7；病情指數(shù)列和防治效果列的不同大寫字母表示差異極顯著(p＜0.01)

生防效果盆栽試驗(yàn)結(jié)果：

非致病突變體尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4在處理新種花2h后，對(duì)蔓割病具有防治效果，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4的生防效果也逐漸明顯，處理16h后，生防效果趨于穩(wěn)定，在處理24h后，生防效果達(dá)到了86.98％(見(jiàn)表2)。

本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建尖孢鐮刀菌甘薯?；偷膖-dna插入突變體庫(kù)，篩選出非致病突變體作為生防資源，最終獲得了針對(duì)甘薯蔓割病的生防菌株尖孢鐮刀菌甘薯?；头侵虏⊥蛔兙阭g103-4。由于是直接對(duì)尖孢鐮刀菌甘薯專化型進(jìn)行改造，因此獲得的生防菌理論上與病原菌生態(tài)位重疊性最好，施用后環(huán)境適應(yīng)性最好，營(yíng)養(yǎng)空間競(jìng)爭(zhēng)也最為激烈。其次，由于t-dna插入位置可以通過(guò)tail-pcr進(jìn)行定位，因此可以明確了解非致病突變體的遺傳背景。再次，本發(fā)明還在t-dna中加入了gfp綠色熒光蛋白標(biāo)記基因，便于生防菌的環(huán)境行為監(jiān)測(cè)。本發(fā)明為從自然環(huán)境中分離生防菌存在的問(wèn)題提供了解決的方法，也為其它作物上尖孢鐮刀菌引起病害的生防菌開(kāi)發(fā)提供借鑒。