本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種控制水稻葉綠素合成的基因YL-1及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要器官，水稻籽粒中2/3以上的干物質(zhì)是開花后通過光合作用獲得的(王旭軍,徐慶國,楊知建(2005)水稻葉片衰老生理的研究進(jìn)展.中國農(nóng)學(xué)通報21:187-190)。光合作用的效率與葉綠體結(jié)構(gòu)和功能是否完整、光合作用復(fù)合體的穩(wěn)定性、葉綠素含量的高低都有著復(fù)雜的關(guān)系。近年來，水稻葉色的應(yīng)用價值備受關(guān)注，葉色變異可以作為標(biāo)記性狀，在水稻雜交育種和良種繁育中發(fā)揮重要作用，不但可以用于苗期剔除受外源花粉污染的種子和假雜種，還可以用于快速測定種子純度(章志興,陳善福(2001)葉色標(biāo)記技術(shù)在雜交水稻種子生產(chǎn)中的應(yīng)用.種子科技19:33-34)。另外，葉色突變體的研究對于利用基因工程有效提高水稻的光合能力，培育高光效水稻品種，增加水稻產(chǎn)量具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

目前，利用水稻葉色突變體，已經(jīng)克隆出多個參與或調(diào)控葉綠素代謝和葉綠體發(fā)育的基因，通過分析基因功能、表達(dá)模式、基因間互作以及核-質(zhì)信號傳導(dǎo)，初步了解了水稻葉色形成及調(diào)控機(jī)理。截止目前，在擬南芥中葉綠素合成過程的關(guān)鍵酶都已鑒定出來(Nagata N(2005)Identification of a Vinyl Reductase Gene for Chlorophyll Synthesis in Arabidopsis thaliana and Implications for the Evolution of Prochlorococcus Species.The Plant Cell Online 17:233-240)，但在水稻中只有部分基因被鑒定出來，其他基因還有待進(jìn)一步發(fā)掘。此外，葉綠素降解的調(diào)控機(jī)制尚未明朗，核-質(zhì)互作的機(jī)理尚不清晰，都有待深入進(jìn)一步研究。

植物鎂原卟啉IX單甲脂環(huán)化酶基因(Magnesium protoporphyrin IX monomethyl ester cyclase)是植物葉綠素合成過程中的關(guān)鍵酶，其功能是將鎂原卟啉IX單甲脂轉(zhuǎn)化成二乙烯基原葉綠素酸脂。該酶復(fù)合體是由催化亞基，輔因子調(diào)節(jié)亞基，降解亞基組合而成。在細(xì)菌和海藻類生物體內(nèi)，其同源基因編碼起催化作用的亞基已被鑒定。在單子葉模式植物水稻中，該基因的克隆及其功能研究還未見報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的問題是提供一種從水稻黃葉突變體中克隆新基因YL-1,該基因編碼一個鎂原卟啉IX單甲脂環(huán)化酶，調(diào)控葉綠素的合成。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種控制水稻葉綠素合成的基因YL-1，所述基因YL-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

進(jìn)一步的是：所述基因YL-1的核苷酸序列還包括在SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中添加、取代，插入或缺失一個或多個核苷酸而生成的突變體、等位基因或衍生物。

本發(fā)明還提供一種由控制水稻葉綠素合成的基因YL-1編碼的蛋白，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

進(jìn)一步的是：所述蛋白氨基酸序列還包括在SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸或其他物種的同源序列而生成的氨基酸序列或衍生物。

本發(fā)明還提供一種含有植物葉綠素合成相關(guān)蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

本發(fā)明還提供一種含有植物葉綠素合成相關(guān)蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)基因重組菌。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種用YL-1基因進(jìn)行高效的植物轉(zhuǎn)化方法，具體地說，本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO：1所示的序列片段載體。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明利用水稻黃葉突變體，通過圖位克隆法克隆到了YL-1基因，該基因編碼葉綠素合成相關(guān)鎂原卟啉IX單甲脂環(huán)化酶蛋白,通過轉(zhuǎn)基因過表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)鑒定了YL-1基因的功能，因而本發(fā)明能調(diào)節(jié)水稻葉綠素的合成，進(jìn)而獲得苗期黃化表型，為該基因的進(jìn)一步利用打下基礎(chǔ)。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1野生型YK17和突變體yl-1幼苗期葉片和抽穗期劍葉，稻穗葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a/b對比分析；

圖2苗期和抽穗期yl-1突變體和野生型中嘉早17葉片透射電鏡葉綠體亞顯微結(jié)構(gòu)觀察，A、B、C苗期野生型中嘉早17葉片葉綠體亞顯微結(jié)構(gòu)，D、E、F、抽穗期野生型中嘉早17葉片葉綠體亞顯微結(jié)構(gòu)，G、H、I苗期yl-1葉片葉綠體亞顯微結(jié)構(gòu)，J、K、L抽穗期yl-1葉片葉綠體亞顯微結(jié)構(gòu)；

圖3 YL-1在水稻第1染色體上的精細(xì)定位；

圖4野生型YK17(左)，突變體yl-1(中)，T₀轉(zhuǎn)基因過表達(dá)植株(右)整體植株，劍葉，稻穗表型；

圖5野生型YK17，突變體yl-1，轉(zhuǎn)基因過表達(dá)植株YL-1基因(LOC_OS01g17170)相對表達(dá)量分析。YK17，野生型中嘉早17；yl-1，突變體；YL-1E,轉(zhuǎn)基因過表達(dá)植株。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

一、水稻黃葉突變體yl-1的分離和遺傳分析

本研究突變體yl-1來源于超級早稻品種中嘉早17(YK17)的EMS誘變突變體庫，田間表型觀察發(fā)現(xiàn)該突變體的主要特征是：該突變體從苗期至成熟期葉片、莖稈、稻穗均表現(xiàn)為黃色；其它農(nóng)藝性狀方面：株高，yl-1(72.88cm)略矮于YK17(84.80cm)；分蘗數(shù)，yl-1(12.5)遠(yuǎn)高于YK17(7.00)；每穗粒數(shù)，yl-1(118.50)低于YK17(209.20)；結(jié)實(shí)率，yl-1(85％)高于YK17(75％)；凈光合速率，yl-1(25.31)低于YK17(32.96)。葉綠素測定結(jié)果表明yl-1主要表現(xiàn)為葉綠素b較野生型嚴(yán)重缺乏(圖1)。利用透射電鏡(TEM)觀察幼苗期和抽穗期野生型YK17和yl-1的葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在幼苗期和抽穗期野生型的葉肉細(xì)胞含有較多的葉綠體，且葉綠體含有正常的片層結(jié)構(gòu)；而yl-1含有較少的葉綠體，且葉綠體片層堆積較少，模糊，含有較多的嗜鋨小體(圖2)。用突變體分別與水稻品種D50，Dular和02428進(jìn)行正反交，得到的F₁后代均表現(xiàn)為正常綠化，在其自交F₂群體中正常植株與突變植株分離比接近3:1(表2)，表明此性狀由一對隱性核基因控制。

表1.突變體yl-1與野生型中嘉早17(YK17)農(nóng)藝性狀比較

表2.突變植株與正常植株在不同F(xiàn)₂群體中的分離

二、圖位克隆YL-1基因

1.YL-1基因的分子定位：

為了分離YL-1基因，本發(fā)明首先建立了一個大的多態(tài)性高的F₂定位群體，由熱帶粳稻品種D50為父本，突變體yl-1為母本，掛牌收獲F₂單株鑒定后代基因型，對獲得的F₂群體中有表型分離的群體選取其中的隱性黃葉極端個體進(jìn)行基因定位，利用SSR分子標(biāo)記對YL-1位點(diǎn)進(jìn)行初步定位，將其初步定位在第1染色體的短臂上，并介于RM10551和RM10748兩SSR標(biāo)記之間。然后通過對RM10622和RM10644兩標(biāo)記之間的BAC序列進(jìn)行分析，發(fā)展了新的Indel標(biāo)記，將YL-1精細(xì)定位于PAC克隆P0025D05的RM10622和Indel8之間44.8kb的范圍之內(nèi)(圖3)，通過分析此區(qū)段開放閱讀框(ORF)推測候選基因并基因測序分析，尋找突變位點(diǎn)。

2.YL-1基因的鑒定和功能分析

根據(jù)精細(xì)定位的結(jié)果，在44.8kb范圍內(nèi)根據(jù)RiceGAAS(Rice Automat ed Systrm,http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)和TIGR(http://rice.plantbiology.msu.edu/)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在此區(qū)間內(nèi)共有4個候選基因，我們設(shè)計了各基因的測序引物，采用PCR的方法分別從yl-1突變體和野生型YK17基因組中擴(kuò)增出所有候選基因進(jìn)行測序分析。發(fā)現(xiàn)其中1個基因的DNA片段中，突變體擴(kuò)增的產(chǎn)物與野生型品種比較發(fā)生了單堿基突變，造成氨基酸的突變。野生型品種YK17擴(kuò)增的基因序列為SEQ ID NO.1，命名為YL-1基因。為了確證突變體表型是由YL-1基因突變引起的，我們對突變體進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因恢復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因恢復(fù)驗(yàn)證主要是將野生型YL-1基因全長基因組序列克隆并構(gòu)建到雙元植物轉(zhuǎn)基因載體pUbi-1390的多克隆位點(diǎn)KpnI/BamHI處，得到過量表達(dá)載體。將構(gòu)建好的過量表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化突變體愈傷，經(jīng)過抗性愈傷誘導(dǎo)進(jìn)而分化成轉(zhuǎn)基因苗。轉(zhuǎn)化了外源YL-1基因的突變體(即轉(zhuǎn)基因陽性株系)幼苗顏色復(fù)綠，YL-1表達(dá)量明顯增高，圖4為野生型、突變體以及T₀轉(zhuǎn)基因過表達(dá)植株的表型。圖5為野生型、突變體、轉(zhuǎn)基因過表達(dá)植株的YL-1表達(dá)量分析。轉(zhuǎn)基因過表達(dá)恢復(fù)試驗(yàn)確證了突變體表型是由YL-1基因突變引起的，表明本發(fā)明獲得了使突變體恢復(fù)正常功能的轉(zhuǎn)基因水稻。

實(shí)施例2YL-1基因的克隆

a)水稻材料

水稻(Oryza sativa L)突變體yl-1(yellow leaves 1)，原始野生型材料為超級早稻品種中嘉早17(YK17).

b)電鏡觀察

利用透射電鏡(TEM)觀察苗期和抽穗期野生型和yl-1葉片的葉綠體超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)野生型的葉綠體含有正常的片層結(jié)構(gòu)和淀粉粒，而yl-1的葉肉細(xì)胞含有較少的葉綠體，且葉綠體片層堆積疏松較模糊，嗜鋨小體較多(圖3)。

c)遺傳分析和定位群體

利用正反雜交確定yl-1為隱性突變體，選取突變體和D50進(jìn)行雜交，F(xiàn)₁代自交，單株收種種植F₂群體，從有分離的群體中選出1500個隱性個體(幼苗黃色)作為定位群體。在四葉期每株取1克左右的嫩葉，用來提取總DNA進(jìn)行基因定位。

d)YL-1基因的初步定位和精細(xì)定位

采用水稻微量DNA的快速提取方法從水稻葉片中提取用于基因定位的基

組DNA，該DNA抽提的方法為SDS法(Dellaporta SL,Wood J,Hicks JB(1983)A plant DNA minipreparation:version II.Plant Mol Biol Rep 1:19-21)。取大約100mg水稻葉片剪碎后放入2ml離心管，加入鋼珠經(jīng)液氮冷凍后，在磨樣機(jī)上粉碎，然后提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于400μL超純水中，每一個PCR反應(yīng)用1μLDNA樣品。在YL-1基因的初步定位中，采用由30個具有突變表型的F₂極端個體進(jìn)行SSR分析。首先根據(jù)公布的粳稻和秈稻創(chuàng)建的分子遺傳圖譜，選取近似均勻分布于各染色體上的SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系如下)。通過8％的聚丙烯酰胺凝膠(凝膠配置方法如下)電泳分離，通過檢測條帶的多態(tài)性，將基因初步定位到第1染色體的短臂上，并介于RM10551和RM10748兩SSR標(biāo)記之間。

PCR反應(yīng)體系：

8％聚丙烯酰胺凝膠配方:

聚丙烯酰胺凝膠顯色液配方：

注：甲醛是臨用前現(xiàn)加，其他三個按相應(yīng)量提前配好。

然后通過對RM10622和RM10644兩標(biāo)記之間的BAC序列進(jìn)行分析，發(fā)展了新的Indel標(biāo)記，最后將F2定位群體擴(kuò)大到1500個進(jìn)行精細(xì)定位，將YL-1精確定位于BAC克隆P0481E12的RM10622和Indel8之間44.8kb的范圍之內(nèi)，(圖3)，通過分析此區(qū)段開放閱讀框(ORF)推測候選基因并基因測序分析，尋找突變位點(diǎn)。

Indel標(biāo)記引物序列：

Indel4-F ACAATCAACTCTAAATGGATAACTAC(SEQ ID NO.6)

Indel4-R GCCTATGCTTTGCTACGGA(SEQ ID NO.7)

Indel8-F CCATTAGGTCTTTCTTGTGCC(SEQ ID NO.8)

Indel8-R GTCCGTAGGTGGTGTTGG(SEQ ID NO.9)

e)基因預(yù)測和比較分析

根據(jù)精細(xì)定位的結(jié)果，在44.8kb范圍內(nèi)根據(jù)RiceGAAS(Rice Automat ed Systrm,http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)和TIGR(http://rice.plantbiology.msu.edu/)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在此區(qū)間內(nèi)共有4個候選基因，我們設(shè)計了各基因的測序引物，采用PCR的方法分別從yl-1突變體和野生型品種基因組中擴(kuò)增出所有候選基因進(jìn)行測序分析。發(fā)現(xiàn)其中1個基因(LOC-Os01g17170)的DNA片段中，突變體擴(kuò)增的產(chǎn)物與野生型品種比較發(fā)生了單堿基突變(CDS 515位堿基C突變成T)，造成氨基酸的突變(絲氨酸Ser突變成苯丙氨酸Phe)。野生型品種擴(kuò)增的基因序列為SEQ ID NO.1,命名為YL-1基因，其編碼的蛋白質(zhì)測序得到的核苷酸序列為SEQ ID NO.2.

實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)

1、載體構(gòu)建

設(shè)計一對完全覆蓋整個YL-1基因ORF的引物，并在引物上分別設(shè)計酶切位點(diǎn)KpnI和BamHI位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增野生型基因組DNA,電泳檢測切膠回收，回收產(chǎn)物用KpnI和BamHI酶切，連接至同樣酶切的pUbi-1390載體上，測序確認(rèn)沒有發(fā)生堿基突變，構(gòu)建后的載體結(jié)構(gòu)圖為pUbi1390-YL-1，把構(gòu)建好的載體通過電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(A grobacterium tumefaciens)菌株中。

擴(kuò)增ORF序列的引物序列為：

OG2-KpnI：5’-TTACTTCTGCACTAGGTACCTCTCGCCACCTTATCTCATC-3’(SEQ ID NO.4)

OG2-BamHI：5’-GAATTCCCGGGGATCCTAACCACCCATCATCTCACC-3’(SEQ ID NO.5)

2、遺傳轉(zhuǎn)化：

(1)轉(zhuǎn)化受體的選擇

將yl-1種子成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織，經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)2周后將胚芽剪下，繼續(xù)培養(yǎng)1周，挑選生長旺盛的愈傷用作轉(zhuǎn)化的受體。

(2)遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T‐DNA.The Plant Journal 6:271-282)，將pUbi-1390空載體和pUbi1390-YL-1載體的EHA105菌株侵染水稻愈傷，在黑暗、25℃條件下共培養(yǎng)3天后，在含有120mg/L G418的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)。篩選抗性愈傷在含有120mg/L預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10-13天。將預(yù)分化的愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上在光照條件下培養(yǎng)。一個月左右得到抗性轉(zhuǎn)基因植株。對植株進(jìn)行鑒定和連續(xù)的觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)空載體的轉(zhuǎn)基因植株表型與yl-1相比不發(fā)生變化，即苗期黃化，而pUbi1390-YL-1載體的陽性轉(zhuǎn)基因植株與野生型表現(xiàn)一致，表現(xiàn)為綠色，即恢復(fù)了yl-1的突變表型，見圖4。

本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。

最后所應(yīng)說明的是：以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。