本發(fā)明屬于土壤西瓜枯萎病菌的檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)土壤西瓜枯萎病菌的方法及引物。
背景技術(shù)：
：西瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌西瓜?；?Fusariumoxysporumf.sp.niveum)引起的一種土傳維管束病害。在世界各西瓜產(chǎn)區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，且在西瓜生長(zhǎng)各個(gè)時(shí)期均可發(fā)生，對(duì)西瓜產(chǎn)業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。西瓜枯萎病常用的防治方法有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治、生物防治、抗病品種的利用及一些其它的防治措施。目前采用種植抗病品種和嫁接換根可最大限度預(yù)防西瓜枯萎病的發(fā)生，但大多數(shù)抗性品種西瓜口感不如感病品種，而嫁接的成本高且在一定程度上會(huì)影響西瓜的口感。又由于西瓜枯萎病具有傳播途徑多樣，快速爆發(fā)、迅速蔓延和應(yīng)急防治難的特點(diǎn)，一旦暴發(fā)成災(zāi)危害損失大，給西瓜生產(chǎn)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。因而及時(shí)、快速診斷病害，掌握病原菌在土壤中的蔓延速度，是有效防治該病的關(guān)鍵。對(duì)于枯萎病的檢測(cè)，傳統(tǒng)的方法是根據(jù)田間發(fā)病病癥、病狀的分析，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室組織病原菌的分離、群落形態(tài)鑒定和顯微鏡觀察結(jié)果等進(jìn)行檢測(cè)。該方法具有操作繁瑣，鑒定周期長(zhǎng)，準(zhǔn)確性不高，且無(wú)法定量的缺點(diǎn)，不能滿足生產(chǎn)的要求。近年來(lái)，隨著PCR技術(shù)的發(fā)展與成熟，包括AFLP、RFLP、RAPD及SCAR在內(nèi)的分子檢測(cè)技術(shù)在病原菌鑒定、分類和群體遺傳多樣性分析方面得到廣泛應(yīng)用。2005年，Zhang等依據(jù)鐮刀菌屬的ITS序列，設(shè)計(jì)了西瓜枯萎枯萎病菌鑒別引物Fn-1/Fn-2，并建立PCR體系，可從發(fā)病組織中鑒別出西瓜枯萎病菌。2010年，Lin等依據(jù)OP-M12隨機(jī)引物擴(kuò)增片段，設(shè)計(jì)出西瓜枯萎病鑒別引物Fon-1/Fon-2，并應(yīng)用此引物從枯萎病發(fā)病早期的西瓜病株中檢測(cè)出西瓜枯萎病菌。到2013年，Peng等也從隨機(jī)擴(kuò)增片段中得到特異性檢測(cè)西瓜枯萎病菌的引物，并應(yīng)用此引物建立了實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)體系。隨著尖孢鐮刀菌基因組測(cè)序的完成，通過(guò)比較基因組學(xué)獲得特異性的鑒別引物成為一種更高效和更可靠的手段?；诨蚪M特異序列設(shè)計(jì)的特異性檢測(cè)引物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原菌的分子檢測(cè)中。2013年，馮雯杰等通過(guò)生物信息學(xué)分析3株水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)和兩株細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)的基因組信息，獲得了能區(qū)分該兩種病原菌的特異性引物，建立了快速、穩(wěn)定的PCR鑒定體系。張吉祥等通過(guò)比較基因組的方法獲得了鑒定甘藍(lán)枯萎病菌的特異性引物Focs-1/Focs-2，建立了檢測(cè)甘藍(lán)枯萎病菌的PCR檢測(cè)體系。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(QuantitativeReal-timePCR)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該方法不僅進(jìn)行定量檢測(cè)，且較普通PCR技術(shù)具有更高的靈敏性，可滿足病原菌快速定性定量檢測(cè)的需求。目前此技術(shù)已應(yīng)用于多種植物病原菌檢測(cè)體系中，但在西瓜病原菌的檢測(cè)中目前報(bào)道較少。由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)引物的要求相對(duì)較高，且要求產(chǎn)物單一，不適用于多重PCR。以往土壤病原菌數(shù)量檢測(cè)體系的建立，采用的多是無(wú)其他背景菌落的基質(zhì)來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，而生產(chǎn)中土壤中的微生物卻具有多樣性，因此已建好的檢測(cè)體系難以應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。又由于對(duì)土壤DNA進(jìn)行熒光定量PCR時(shí)，對(duì)DNA的要求較高，在DNA提取過(guò)程中需要多個(gè)試劑進(jìn)行抽提，以去除干擾擴(kuò)增反應(yīng)的腐殖質(zhì)，因此的總DNA損耗較大，從而也降低了中目標(biāo)病原菌DNA的含量，使得熒光定量PCR的檢測(cè)靈敏度降低。本發(fā)明通過(guò)分析西瓜枯萎病菌的基因組信息設(shè)計(jì)出單條檢測(cè)西瓜枯萎病菌的特異引物，建立SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)西瓜枯萎病菌體系和土壤西瓜枯萎病菌檢測(cè)體系，通過(guò)普通預(yù)PCR的方法對(duì)檢測(cè)體系進(jìn)行優(yōu)化，提高檢測(cè)靈敏度，并將該體系應(yīng)用于土壤中西瓜枯萎病菌的定量檢測(cè)，對(duì)防治枯萎病菌的藥劑效果進(jìn)行評(píng)測(cè)。通過(guò)以上研究，以期為西瓜枯萎病的早期預(yù)防提供有效的技術(shù)支持，為西瓜枯萎病防治藥效的評(píng)估，提供技術(shù)參考。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對(duì)傳統(tǒng)的病害診斷和流行趨勢(shì)研究主要依靠病原菌的分離培養(yǎng)，不僅耗時(shí)長(zhǎng)且難以準(zhǔn)確定量，不能給病害防治提供有效防治時(shí)期，以及現(xiàn)有的PCR技術(shù)靈敏度不高，引物特異性不夠，容易受到土壤背景中其他菌落或者物質(zhì)干擾的缺陷，提供一種快速、準(zhǔn)確、定量的土壤西瓜枯萎病菌檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于該病的早期診斷、病情預(yù)報(bào)及綜合防治具有重要意義。一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)土壤西瓜枯萎病菌的方法，該方法是利用如下序列的引物進(jìn)行的：Fonq-2F：GTTGCTTACGGTTCTAACTGTGCFonq-2R：GGTACTTGGAAGGAATTGTGGG。所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)土壤西瓜枯萎病菌的方法，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR之前進(jìn)行普通PCR預(yù)擴(kuò)增，然后以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)土壤西瓜枯萎病菌的方法，普通PCR預(yù)擴(kuò)增的引物序列：Fonq-2F：GTTGCTTACGGTTCTAACTGTGC，F(xiàn)onp-R：5’–CTGGTACGGAATGGCCGATCAG-3’。所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)土壤西瓜枯萎病菌的方法，待檢測(cè)樣品為種植西瓜的土壤。所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)土壤西瓜枯萎病菌的方法，待檢測(cè)樣品為與水稻輪作的種植西瓜的土壤。所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)土壤西瓜枯萎病菌的方法，普通PCR預(yù)擴(kuò)增的過(guò)程：以土壤DNA為模板，利用引物對(duì)進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃40s；58℃40s；72℃90s；18個(gè)循環(huán)；72℃10min。所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)土壤西瓜枯萎病菌的方法，普通PCR預(yù)擴(kuò)增體系包括：10×EasyDNAPolymerasebuffer2.0μl；活性酶濃度為5U/ml的EasyDNAPolymerase0.4μl；濃度為10pmol/μl的引物各0.8μl；DNA模板1μl；加ddH2O補(bǔ)足至20μl。所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)土壤西瓜枯萎病菌的方法，包括以下步驟：取普通預(yù)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物1ul為模板，利用引物對(duì)Fonq-2F/Fonq-2R進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性30s；94℃5s；60℃30s；45個(gè)循環(huán)。所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)土壤西瓜枯萎病菌的方法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系包括：TipgreenqPCRSuperMix10μl；引物各0.5μl；模板1μl；ddH2O8.5μl。本發(fā)明方法的優(yōu)勢(shì)：1、能夠快速、準(zhǔn)確、定量的實(shí)現(xiàn)土壤西瓜枯萎病菌檢測(cè)；2、在實(shí)時(shí)熒光定量PCR之前進(jìn)行普通PCR預(yù)擴(kuò)增，較直接進(jìn)行qPCR檢測(cè)靈敏度提高了100倍；3、能夠克服現(xiàn)有PCR技術(shù)靈敏度不高，引物特異性不夠，容易受到土壤背景中其他菌落或者物質(zhì)干擾的缺陷。附圖說(shuō)明圖1為引物特異性檢測(cè)；Fon-4代表引物對(duì)Fon-4F/Fon-4R、Fonq-2代表引物對(duì)Fonq-2F/Fonq-2R；M：marker；0：尖孢鐮刀菌西瓜?；?號(hào)生理小種；1：尖孢鐮刀菌西瓜專化型1號(hào)生理小種；2：尖孢鐮刀菌西瓜?；?號(hào)生理小種；3：水稻土壤總DNA；4：串珠鐮刀菌；5:尖孢鐮刀菌甜瓜專化型；6尖孢鐮刀菌番茄專化型。7:陰性對(duì)照。圖2為用質(zhì)粒建立的實(shí)時(shí)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為重組質(zhì)粒DNA為模板的溶解曲線；圖4為以土壤DNA為模板直接進(jìn)行熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線；檢測(cè)下限為104個(gè)/g；A:利用104-107個(gè)/g的檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，具有較好的回歸性；B：加入103個(gè)/g的檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸線顯著下降。圖5為土壤病原菌數(shù)量的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施方式旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例一：菌株：尖孢鐮刀菌西瓜專化型0、1、2號(hào)生理小種，串珠鐮刀菌，尖孢鐮刀菌番茄?；汀８惺軕B(tài)大腸桿菌Trans5α購(gòu)于全式金公司。載體：載體質(zhì)粒pKN。1.1主要試劑EasypurePCR純化試劑盒、Easypure快速凝膠回收試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)Trans5α、限制性內(nèi)切酶、各分子標(biāo)量的DNAMarker，Easypure質(zhì)粒小提試劑盒，TipgreenqPCRSuperMix、MOBIOPowersoil@DNAIsolationKit試劑盒均購(gòu)自全式金生物技術(shù)公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1DNA的提取各菌株的基因組DNA采用CTAB法提取；土壤總DNA采用經(jīng)改良的MOBIOPowersoil@DNAIsolationKit試劑盒提取。1.2.2引物引物設(shè)計(jì)：通過(guò)比對(duì)西瓜枯萎病菌基因組與其近緣病菌基因組，找到特異性片段，并將該特異片段在NCBI的基因組庫(kù)中進(jìn)行Blastn比對(duì)，選定沒(méi)有比對(duì)結(jié)果的特異片段設(shè)計(jì)引物，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物大小為244bp的引物對(duì)Fonq-2F/Fonq-2R，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物特異性檢測(cè)：以尖孢鐮刀菌西瓜?；?、1、2號(hào)生理小種，串珠鐮刀菌，尖孢鐮刀菌番茄?；偷幕蚪MDNA和連作水稻土壤的總DNA為模板，利用引物對(duì)Fonq-2F/Fonq-2R進(jìn)行PCR，以曹月霞等發(fā)表的引物對(duì)Fon-4F/Fon-4R為對(duì)照，檢測(cè)引物的特異性。PCR反應(yīng)體系為：10×buffer2μl；EasyDNAPolymerase0.4μl；引物各0.8μl；DNA模板1μl；加ddH2O補(bǔ)足至20μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃40s；58℃40s；72℃90s；30個(gè)循環(huán)；72℃10min。表1本實(shí)驗(yàn)所用引物引物名稱引物序列(5'-3')Fonq-2FGTTGCTTACGGTTCTAACTGTGCFonq-2RGGTACTTGGAAGGAATTGTGGGFon-4FCCCGCTGGCTACTAATCTTTGAFon-4RATGTAGTGGCGATACTTCCTTGFonp-RCTGGTACGGAATGGCCGATCAGFonqM-2FGACTAGTCGTTGCTTACGGTTCTAACTGTGCFonqM-2RAAGGGCCCTTGGTACTTGGAAGGAATTGTGGG注:劃線部分為添加的酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基區(qū)域。1.2.3熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及引物靈敏度檢測(cè)利用引物對(duì)FonqM-2F/FonqM-2R從尖孢鐮刀菌西瓜?；突蚪M中擴(kuò)增出具有SpeI和ApaI酶切位點(diǎn)的西瓜枯萎病菌特異性片段。通過(guò)核酸限制性內(nèi)切酶酶切連接的方法，將該片段連接到質(zhì)粒pKn上。提取重組質(zhì)粒，經(jīng)引物對(duì)Fonq-2F/Fonq-2RPCR檢測(cè)后，將陽(yáng)性質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)序列無(wú)誤后，使用紫外分光光度儀測(cè)定重組質(zhì)粒的濃度，按照下列公式計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)。質(zhì)?？截悢?shù)＝質(zhì)粒濃度×6.023×023/MW，MW＝(克隆載體長(zhǎng)度+目的片段長(zhǎng)度)×324×2。其中質(zhì)粒濃度單位為g/μl，MW單位為g/mol，克隆載體長(zhǎng)度和目的片段長(zhǎng)度單位為bp。將已知濃度的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。以各梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品為模板，用引物Fonq-2F/Fonq-2R進(jìn)行普通PCR和熒光定量PCR，檢測(cè)引物靈敏度，并以拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)軸，以Ct值為軸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光定量PCR反應(yīng)體系為：TipgreenqPCRSuperMix10μl；引物各0.5μl；模板1μl。1.2.4土壤中熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立由于我國(guó)南方大多采用水稻和西瓜輪作的方式種植西瓜，因此本發(fā)明采用水稻田作為西瓜枯萎病的背景土壤。從連作5年以上的水稻田中采取土壤，烘干至重量無(wú)變化后，用研缽將土壤磨碎備用。利用PDA液體培養(yǎng)基對(duì)尖孢鐮刀菌1號(hào)生理小種進(jìn)行液體搖培，5天后用4層紗布過(guò)濾去除菌絲，得到孢子懸浮液。利用離心機(jī)對(duì)孢子懸浮液進(jìn)行離心，進(jìn)一步提高孢子液的濃度。充分混勻后，利用顯微鏡和血球計(jì)數(shù)板確定孢子懸浮液的濃度，并對(duì)孢子液進(jìn)行10倍梯度的稀釋。用2ml離心管稱取2g備好的水稻土7份，分別加入100μl各濃度孢子液和100μl的ddH2O，配制成含水量約為33％的標(biāo)準(zhǔn)帶菌土，標(biāo)準(zhǔn)帶菌土的含菌量分別為1.5個(gè)/g，1.5×10個(gè)/g，1.5×102個(gè)/g，1.5×103個(gè)/g，1.5×104個(gè)/g，1.5×105個(gè)/g，1.5×106個(gè)/g利用改良的MOBIOPowersoil@DNAIsolationKit試劑盒提取標(biāo)準(zhǔn)含菌土的總DNA。普通PCR預(yù)擴(kuò)增：以土壤DNA為模板，利用引物對(duì)Fonq-2F/Fonp-R進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃40s；58℃40s；72℃90s；18個(gè)循環(huán)；72℃10min。普通PCR預(yù)擴(kuò)增體系包括：10×EasyDNAPolymerasebuffer2.0μl；活性酶濃度為5U/ml的EasyDNAPolymerase0.4μl；濃度為10pmol/μl的引物各0.8μl；DNA模板1μl；加ddH2O補(bǔ)足至20μl。取預(yù)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物1ul為模板，利用引物對(duì)Fonq‐2F/Fonq‐2R進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性30s；94℃5s；60℃30s；45個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系包括：2×TipgreenqPCRSuperMix10μl；引物各0.5μl；模板1μl；ddH2O8.5μl。每個(gè)樣設(shè)置3個(gè)重復(fù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.結(jié)果：2.1.1引物特異性檢測(cè)結(jié)果以引物對(duì)Fon-4F/Fon-4R為對(duì)照，檢測(cè)引物對(duì)Fonq-2F/Fonq-2R特異性的結(jié)果表明：引物對(duì)Fon-4F/Fon-4R和Fonq-2F/Fonq-2R均能將西瓜枯萎病菌的三個(gè)生理小種和尖孢鐮刀菌甜瓜?；停怄哏牭毒褜；蛥^(qū)分開來(lái)，但是Fon-4F/Fon-4R未能將水稻惡苗病的病原菌串珠鐮刀菌和西瓜枯萎病菌分開，而引物對(duì)Fonq-2F/Fonq-2R能很好的將其區(qū)分，且以水稻土壤總DNA為模板，無(wú)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果說(shuō)明引物對(duì)Fonq-2F/Fonq-2R的特異性高，可用于土壤西瓜枯萎病菌的PCR檢測(cè)。2.1.2引物靈敏度檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立利用熒光定量PCR對(duì)拷貝數(shù)為4.4×102到4.4×108的10倍稀釋的的重組質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝﹣3.293x+39.206，回歸系數(shù)的質(zhì)粒DNA濃度的對(duì)數(shù)(x)與對(duì)應(yīng)的Ct值(y)之間具有良好的線性關(guān)系(R2＝0.993)，引物擴(kuò)增效率E為101.2％，說(shuō)明引物的擴(kuò)增性好(圖2)。熒光定量PCR擴(kuò)增溶解曲線僅出現(xiàn)一個(gè)特異性單峰(圖3)，說(shuō)明該引物特異性良好,可以保證SYBRGreenⅠ染料定量PCR檢測(cè)的特異性。2.2土壤病原菌數(shù)量的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以土壤DNA直接進(jìn)行熒光定量PCR構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量檢測(cè)下限為104個(gè)孢子每克土，見(jiàn)圖4，圖中A：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作只計(jì)算104-107個(gè)孢子每克土的檢測(cè)數(shù)據(jù)時(shí)，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.963；圖中B：當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作引入103個(gè)孢子每克土的檢測(cè)數(shù)據(jù)時(shí)，相關(guān)性顯著下降，且數(shù)據(jù)未能落在曲線上，因此以土壤DNA直接進(jìn)行熒光定量PCR定量檢測(cè)下限為104個(gè)孢子每克土。為了提高qPCR的檢測(cè)靈敏度，降低qCPR檢測(cè)下限，本實(shí)驗(yàn)采用MOBIOPowersoil@DNAIsolationKit試劑盒進(jìn)行各濃度梯度土壤樣品總DNA的提取，先進(jìn)行一次常規(guī)PCR預(yù)擴(kuò)增，然后以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板DNA進(jìn)行qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建(圖5)。檢測(cè)結(jié)果表明，土壤含菌為1.5×102個(gè)/g，1.5×103個(gè)/g，1.5×104個(gè)/g，1.5×105個(gè)/g，1.5×106個(gè)/g樣品的孢子量對(duì)數(shù)值與擴(kuò)增Ct值具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝-2.685+31.033，回歸系數(shù)R2＝0.940；有效檢測(cè)下限為1×102個(gè)/g，較未引入常規(guī)PCR方法前的qPCR檢測(cè)靈敏度提高了100倍。實(shí)施例二：利用實(shí)施例一的方法檢測(cè)土壤樣品中西瓜枯萎病菌的數(shù)量1、樣品采集：土壤樣品采自湖南省農(nóng)科院高橋基地的不同西瓜土壤。2、DNA提取及檢測(cè)方法與實(shí)施例一相同。3、檢測(cè)結(jié)果：表2各土壤中西瓜枯萎病菌的檢測(cè)數(shù)量利用構(gòu)建好的體系對(duì)南省農(nóng)科院高橋基地的不同作物土壤中西瓜枯萎病病原菌數(shù)量的檢測(cè)結(jié)果為：樣品一：0.6×103個(gè)/g，樣品二：3.4×103個(gè)/g，樣品三：7.6×103個(gè)/g，樣品四：10.6×103個(gè)/g；這說(shuō)明不同西瓜土壤中，西瓜枯萎病菌的含量是不一樣的，可能與西瓜地的種植品種、藥劑處理等因素相關(guān)。西瓜枯萎病是目前西瓜生產(chǎn)上最常見(jiàn)的土傳真菌病害，在西瓜種植區(qū)普遍發(fā)生。而且經(jīng)常與蔓枯病、根腐病等土傳病害混合發(fā)生，早期均可引起根部或莖基部變褐，癥狀相似，通過(guò)直接的癥狀判斷很難直接區(qū)分，更無(wú)法準(zhǔn)確定量。因此需要建立快速，準(zhǔn)確定量檢測(cè)技術(shù)，監(jiān)測(cè)田間病害的發(fā)生發(fā)展動(dòng)態(tài)，指導(dǎo)西瓜枯萎病科學(xué)合理防控。利用分子生物學(xué)技術(shù)，特別是PCR和real-timePCR技術(shù)進(jìn)行農(nóng)作物病害病原菌檢測(cè)、病害預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，指導(dǎo)防治已經(jīng)越來(lái)越受到關(guān)注。其中real-timePCR不僅能進(jìn)行定量檢測(cè)，且較普通PCR技術(shù)具有更高的靈敏性，可滿足病原菌快速定性定量檢測(cè)的需求。而特異性引物是制約該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于病害檢測(cè)的關(guān)鍵，本發(fā)明根據(jù)西瓜枯萎病菌的特異性序列片段設(shè)計(jì)的特異引物Fonq-2F/Fonq-2R，表現(xiàn)出對(duì)西瓜枯萎病菌的高度特異擴(kuò)增，不僅能鑒定區(qū)分蔓枯病、根腐病等常見(jiàn)土傳病害，以及尖孢鐮刀菌的其他?；停欢以谝跃哂袕?fù)雜背景的自然農(nóng)作物土壤為模板進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)仍能進(jìn)行特異擴(kuò)增。利用該引物建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系，對(duì)質(zhì)粒的定量檢測(cè)靈敏度為4.4×102copies/μL，同時(shí)用該引物構(gòu)建了反映土壤含菌濃度與擴(kuò)增循環(huán)閾值間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)土壤西瓜枯萎病菌數(shù)量體系，通過(guò)預(yù)PCR優(yōu)化后的定量檢測(cè)下限為100個(gè)孢子每克土壤，并將該體系應(yīng)用于評(píng)估枯萎病藥劑的防治效果。結(jié)論本發(fā)明建立的基于real-timePCR技術(shù)的土壤西瓜枯病菌快速檢測(cè)方法，具有操作步驟簡(jiǎn)單、靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定可靠的特點(diǎn)。在定量檢測(cè)土壤西瓜枯萎病菌數(shù)量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化后，不僅可為西瓜枯病菌的研究提供簡(jiǎn)便快速的方法，還可以用于分析土壤中病原的含量，結(jié)合環(huán)境條件，西瓜植株抗、感病程度等條件，預(yù)測(cè)未來(lái)的發(fā)病情況，對(duì)枯萎病菌藥劑藥效的評(píng)估、指導(dǎo)西瓜枯萎病的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和制定綜合防治措施具有重要的理論指導(dǎo)和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3