本發(fā)明屬于神經(jīng)科學領域。具體地，本發(fā)明涉及一種阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的診斷和治療靶點，以及相應的診斷、治療方法和相關試劑盒。

背景技術(shù)：

AD是臨床上最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其以進行性進展的記憶、視空間及執(zhí)行功能障礙為典型臨床表現(xiàn)^[1]。近年來，隨著老齡化程度的加快，我國AD患者數(shù)量大幅增加，由此給患者、家庭及社會帶來了十分沉重的負擔^[2]。截至目前為止，該病病因尚不明確，且無有效的治療手段。

根據(jù)已有研究，AD的主要病理特征之一是腦內(nèi)累積大量β淀粉樣蛋白(Amyloid-β，Aβ)，進而誘發(fā)一系列神經(jīng)毒性反應，最終導致認知功能障礙^[3]。因此，Aβ是現(xiàn)階段相當一部分AD治療的主要研究靶點。大量證據(jù)表明，腦組織對Aβ的清除能力下降，是導致病程早期Aβ累積的主要原因^[4]。新進證據(jù)提示，在起病早期清除AD模型小鼠腦內(nèi)的Aβ后，小鼠的認知功能有所恢復，提示針對Aβ療法的早期應用可延緩AD病程的進展^[5]。

然而，AD早期診斷手段的缺乏是應用此類療法的最大阻礙。目前，在AD患者中開展腦組織活檢較為困難，而通過病史及量表評估法診斷AD，其敏感性及特異性又十分有限。因此，探明一種較易操作的，特異性及敏感性較高的AD診斷方法亦成為當務之急。

發(fā)明概述

本發(fā)明的目的在于提供一種早期診斷及治療AD的方法。

具體地，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)TREM1蛋白是AD發(fā)病機制中重要一環(huán)，其在單核-巨噬細胞系統(tǒng)中的表達水平下調(diào)直接影響該系統(tǒng)對Aβ的清除能力，從而導致Aβ在腦內(nèi)累積。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種早期診斷AD的方法，其關鍵點為檢測TREM1在外周單核中的表達水平。在一個具體的實施方案中，通過qRT-PCR檢測TREM1基因轉(zhuǎn)錄水平以評估TREM1表達水平。在另一個具體的實施方案中，通過ELISA、免疫印跡或免疫組化方法直接檢測TREM1蛋白表達水平。

此外，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療AD的方法，其關鍵點為上調(diào)TREM1水平或激活TREM1通路以恢復腦內(nèi)單核-巨噬細胞系統(tǒng)(即小膠質(zhì)細胞)對Aβ的吞噬能力。在一個具體的實施方案中，通過向腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)入外源性TREM1基因以提高其表達水平。其載體可以是質(zhì)粒、慢病毒或其他可行的核酸形式。在另一個具體的實施方案中，向機體內(nèi)引入能夠提高TREM1基因表達水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)控物質(zhì)。在另一個具體的實施方案中，向腦內(nèi)引入特定物質(zhì)以靶向激活TREM1通路，所述特定物質(zhì)可以 是激動性抗體及其活性片段、激動性配體或通路下游分子的激動劑。

附圖說明

圖1.Trem1可以促進WT幼鼠的小膠質(zhì)細胞對Aβ的吞噬作用。為弄清生理條件下TREM1在小膠質(zhì)細胞吞噬Aβ中的作用，我們利用慢病毒機制操縱從WT幼鼠中分離出的原代小膠質(zhì)細胞中Trem1的表達。在轉(zhuǎn)導72h后，分別利用qRT-PCR和ELISA技術(shù)證實了Trem1 mRNA的表達水平(a)和Trem1蛋白水平(b)的改變。之后，應用Griciuc等人提供的離體試驗方法檢測小膠質(zhì)細胞對Aβ_1-42的吞噬和降解作用。(c)將小鼠原代小膠質(zhì)細胞置于5μM Aβ_1-42培育6h。利用ELISA技術(shù)對內(nèi)化的Aβ_1-42數(shù)量進行檢測(t＝0h)。(d)繼而，將培養(yǎng)基中剩余的Aβ_1-42清洗出去，將原代小膠質(zhì)細胞進一步培養(yǎng)6h以使得Aβ_1-42充分降解。利用ELISA技術(shù)對細胞內(nèi)Aβ_1-42水平進行測定(t＝6h)。(e)將Aβ_1-42剩余量(t＝6h)與總的Aβ_1-42內(nèi)化量(t＝0h)的比值視為Aβ_1-42降解指數(shù)。降解指數(shù)越高，代表降解Aβ_1-42的能力越低。利用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗對數(shù)據(jù)進行分析。柱狀圖代表平均數(shù)±標準差(n＝4，一式三份)，*P＜0.05。

圖2.Trem1可以促進成年APP/PSEN1小鼠的小膠質(zhì)細胞對Aβ的吞噬作用。為了進一步在AD相關的背景下證實TREM1對Aβ吞噬作用的調(diào)節(jié)作用，我們通過慢病毒機制操縱7月齡APP/PSEN1小鼠小膠質(zhì)細胞中Trem1的表達。在轉(zhuǎn)導72h后，分別利用qRT-PCR和ELISA技術(shù)證實了Trem1 mRNA的表達水平(a)和Trem1蛋白水平(b)的改變。之后，應用Griciuc等人提供的離體試驗方法檢測小膠質(zhì)細胞對Aβ_1-42的吞噬和降解作用。(c)將小鼠原代小膠質(zhì)細胞置于5μMAβ_1-42培育6h。利用ELISA技術(shù)對內(nèi)化的Aβ_1-42數(shù)量進行檢測(t＝0h)。(d)繼而，將培養(yǎng)基中剩余的Aβ_1-42清洗出去，將原代小膠質(zhì)細胞進一步培養(yǎng)6h以使得Aβ_1-42充分降解。利用ELISA技術(shù)對細胞內(nèi)Aβ_1-42水平進行測定(t＝6h)。(e)將Aβ_1-42剩余量(t＝6h)與總的Aβ_1-42內(nèi)化量(t＝0h)的比值視為Aβ_1-42降解指數(shù)。降解指數(shù)越高，代表降解Aβ_1-42的能力越低。利用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗對數(shù)據(jù)進行分析。柱狀圖代表平均數(shù)±標準差(n＝4，一式三份)，*P＜0.05。

圖3.敲除Trem1可促進APP/PSEN1小鼠中Aβ神經(jīng)病理發(fā)生。將含有Trem1shRNA的慢病毒或其對照組慢病毒注入7月齡APP/PSEN1小鼠及與其年齡相匹配的WT小鼠的雙側(cè)大腦皮層和海馬中。(a)注射2個月后，通過qRT-PCR證實了APP/PSEN1小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞中Trem1mRNA的表達發(fā)生的改變。(b)注射2個月后，通過ELISA證實了APP/PSEN1小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞中Trem1蛋白的表達發(fā)生的改變。(c)代表接受載體，對照組病毒或含有Trem1shRNA的慢病毒注射的APP/PSEN1小鼠大腦皮層的淀粉樣斑塊照片。根據(jù)免疫化學法，使用抗Aβ抗體檢測淀粉樣斑塊。在×200顯微鏡下觀察這些斑塊。比例尺＝200μm。(d)在注射2個月之后，利用ELISA法檢測APP/PSEN1小鼠大腦皮層中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。(e)在注射2個月之后，利用ELISA法檢測APP/PSEN1小鼠海馬組織中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。通過單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗對數(shù)據(jù)進行分析。柱狀圖代表平均數(shù)±標準差。每組n＝12，*P＜0.05。

圖4.過表達Trem1可以減弱APP/PSEN1小鼠中Aβ病理水平。將含有Trem1 cDNA的慢病毒或其對照組 慢病毒注入7月齡APP/PSEN1小鼠及與其年齡相匹配的WT小鼠的雙側(cè)大腦皮層和海馬中。(a)注射2個月后，通過qRT-PCR證實了APP/PSEN1小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞中Trem1mRNA的表達發(fā)生的改變。(b)注射2個月后，通過ELISA證實了APP/PSEN1小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞中Trem1蛋白的表達發(fā)生的改變。(c)代表接受載體，對照組病毒或含有Trem1 shRNA的慢病毒注射的APP/PSEN1小鼠大腦皮層的淀粉樣斑塊照片。根據(jù)免疫化學法，使用抗Aβ抗體檢測淀粉樣斑塊。在×200顯微鏡下觀察這些斑塊。比例尺＝200μm。(d)在注射2個月之后，利用ELISA法檢測APP/PSEN1小鼠大腦皮層中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。(e)在注射2個月之后，利用ELISA法檢測APP/PSEN1小鼠海馬組織中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。采用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗對數(shù)據(jù)進行分析。柱狀圖代表平均數(shù)±標準差。每組n＝12，*P＜0.05。

圖5.表達Trem1可以挽救APP/PSEN1小鼠的AD相關的空間認知損害。將含有Trem1 cDNA的慢病毒或其對照組慢病毒注入7月齡APP/PSEN1小鼠及與其年齡相匹配的WT小鼠的雙側(cè)大腦皮層和海馬中。慢病毒注射2個月后，利用Y-迷宮試驗檢測Trem1過表達對小鼠短期空間記憶的影響。在暴露期，將小鼠放置在“起始”臂末端，并允許其在5分鐘內(nèi)自由探索Y-迷宮的第一臂部分(定義為“起始”臂)和第二臂部分(定義為“其它”臂)。該階段，我們將通往迷宮第三臂部分(定義為“新”臂)的入口臨時阻斷。我們計算了相對于“起始”臂，小鼠在“其它”臂區(qū)域內(nèi)所花費的時間(a)。采用單樣本t檢驗(與50％機會相比，用紅色虛線表示)或單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗(組間差異)對數(shù)據(jù)進行分析。之后，小鼠被從迷宮中轉(zhuǎn)移到其居住的籠子里待上2min。在試驗階段，將小鼠再次放入迷宮的“起始”臂內(nèi)。同時，“新”臂入口被打開，并允許小鼠在迷宮中自由探索1min。(b)對于試驗期，我們計算了一個鑒別指數(shù)＝[新臂時間/(新臂時間+其它臂時間)]×100。采用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗對數(shù)據(jù)進行分析。柱狀圖代表平均數(shù)±標準差，*P＜0.05。在處死小鼠前的最后5天，通過Morris水迷宮試驗對小鼠的空間認知功能進行測定。(c)代表5天測試中各組的游泳速度。采用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗對數(shù)據(jù)進行分析。(d)代表各組在水迷宮試驗中的路徑長度。采用二因素重復測量方差分析及Bonferroni多重比較檢驗對路徑長度數(shù)據(jù)進行分析。#相對于對照組WT小鼠，P＜0.05；*相對于接受對照組病毒注射的APP/PSEN1小鼠，P＜0.05。(e)探索試驗所得數(shù)據(jù)的呈現(xiàn)形式為：相對于在其它三個象限(A.O.)內(nèi)花費的時間，小鼠在在靶象限(Q1)內(nèi)所花費的時間比例。采用獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)進行分析。*相對于在其它三個象限(A.O.)內(nèi)花費的時間，P＜0.05。柱形圖代表平均數(shù)±標準差。每組n＝24。

圖6.激動性Trem1抗體激活Trem1信號途徑可以減弱APP/PSEN1小鼠腦內(nèi)Aβ病理及挽救其空間認知損害。為了進一步證實TREM1在AD進展期的保護性作用，我們使用微型滲透泵持續(xù)6周向7月齡APP/PSEN1小鼠大腦第三腦室背側(cè)灌入一種激動性Trem1抗體以激活Trem1信號途徑。之后，我們測定了Trem1信號途徑的激活對Aβ病理的影響。(a)利用ELISA法檢測APP/PSEN1小鼠大腦皮層中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。采用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗對數(shù)據(jù)進行分析，P＜0.05.每組n＝12。(b)利用ELISA法檢測APP/PSEN1小鼠海馬組織中可溶性及不可溶形式的Aβ_1-42。采用單因素方差分析及Tukey′s post hoc 檢驗對數(shù)據(jù)進行分析，P＜0.05.每組n＝12。繼而，利用Y-迷宮試驗評估小鼠的短期空間記憶功能。(c)對于試驗期，我們計算了一個鑒別指數(shù)＝[新臂時間/(新臂時間+其它臂時間)]×100。采用單樣本t檢驗(與50％機會相比，用紅色虛線表示)或單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗(組間差異)對數(shù)據(jù)進行分析，每組n＝24。(d)對于試驗期，我們計算了一個鑒別指數(shù)＝[新臂時間/(新臂時間+其它臂時間)]×100。采用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗對數(shù)據(jù)進行分析。柱狀圖代表平均數(shù)±標準差，*P＜0.05，每組n＝24。才處死小鼠前的最后5天，通過Morris水迷宮試驗對小鼠的空間認知功能進行測定。(e)代表5天測試中各組的游泳速度。采用單因素方差分析及Tukey′s post hoc檢驗對數(shù)據(jù)進行分析，每組n＝24。(f)代表各組在水迷宮試驗中的路徑長度。采用二因素重復測量方差分析及Bonferroni多重比較檢驗對路徑長度數(shù)據(jù)進行分析。#相對于對照組WT小鼠，P＜0.05；*相對于接受對照組病毒注射的APP/PSEN1小鼠，P＜0.05，每組n＝24。(g)探索試驗所得數(shù)據(jù)的呈現(xiàn)形式為：相對于在其它三個象限(A.O.)內(nèi)花費的時間，小鼠在在靶象限(Q1)內(nèi)所花費的時間比例。采用獨立樣本t檢驗對數(shù)據(jù)進行分析。*相對于在其它三個象限(A.O.)內(nèi)花費的時間，P＜0.05。柱形圖代表平均數(shù)±標準差。每組n＝24。

具體實施方式

本發(fā)明中所指的TREM1，英文全稱為triggering receptor expressed on myeloid cells-1，即1型髓樣細胞觸發(fā)受體，是表達于單核巨噬細胞表面的一種受體，其與受體酪氨酸蛋白激酶偶聯(lián)，進而調(diào)控免疫反應。

本發(fā)明首先發(fā)現(xiàn)了小膠質(zhì)細胞膜表面的TREM1對于小膠質(zhì)細胞吞噬Aβ的關鍵性促進作用。下調(diào)的TREM1表達直接導致小膠質(zhì)細胞吞噬能力下降，即使在某些Aβ的生成速度并未加快的生理情形下，仍然不能清除Aβ使得后者在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量累積，進而產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，進展到一定程度即發(fā)生阿爾茨海默病(AD)。雖然阿爾茨海默病的病因非常復雜，難以用單一原因或誘因概而論之，但是如果檢出單核細胞中TREM1表達量顯著下調(diào)，這一情形可能與阿爾茨海默病有很強的關聯(lián)。

同時，本發(fā)明也發(fā)現(xiàn)，對于Aβ累積的情形，上調(diào)TREM1的表達量或者激活其通路，能夠顯著增強小膠質(zhì)細胞吞噬Aβ的能力，加快清除累積的Aβ，消除其對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用，并且可能改善已經(jīng)出現(xiàn)的癥狀。因此，本發(fā)明新發(fā)現(xiàn)了TREM1是一個阿爾茨海默病的診斷和治療的靶點。

本發(fā)明所指的檢測TREM1的表達量，指的是根據(jù)本領域常用的檢測技術(shù)，包括但不限于qRT-PCR，ELISA，免疫印跡，免疫組織化學等等方法，檢測TREM1的mRNA和/或蛋白的表達水平，其特異性的引物/探針/抗體/結(jié)合物等可以是自行設計的，也可以是商品化的。

本發(fā)明所指的上調(diào)TREM1的表達量，指的是通過向單核巨噬細胞轉(zhuǎn)入TREM1基因本身，或轉(zhuǎn)入其上游強啟動子，或相應的轉(zhuǎn)錄因子，或消除抑制其表達的因素，或其他能夠達到類似效果的、已知的其他手段或方案，實際達到TREM1分子表達數(shù)量增加的效果。在一個具體的實施例中，通過向活體腦內(nèi)注射TREM1-載體顆粒實現(xiàn)，所述的載體優(yōu)選地是病毒載體，更優(yōu)選地是慢病毒載體。

本發(fā)明所指的活化TREM1通路，指的是通過激動性配體、激動性抗體或模擬分子活化TREM1，并進而激活下游信號轉(zhuǎn)導。本發(fā)明所指的活化TREM1通路，也包括本領域所公知的，直接活化TREM1的下游分子，例如DAP12等。

實施例1 本發(fā)明所采用的實驗材料與方法

人類研究對象

本研究遵循赫爾辛基宣言并經(jīng)南京醫(yī)科大學倫理委員會審批通過。研究對象來源于南京市第一醫(yī)院在職及退休員工中的健康青年人和老年人，所有參與對象均為漢族中國人，且彼此無任何血緣關系。每一名參與者均簽署了書面同意書。

人體循環(huán)血中單核細胞的純化和培養(yǎng)

依據(jù)Zondler及其同事所描述的方法^[6]，從人體靜脈全血中分離得到單核細胞。大體過程為：使用 (Sigma-Aldrich公司)儀器，采用密度梯度離心及CD-14陽性磁珠分離技術(shù)(Miltenyi Biotec公司)實現(xiàn)細胞分離。在添加10％胎牛血清(FBS)和1％盤尼西林/鏈霉素(P/S)的RPMI 1640培養(yǎng)基中進行細胞的再懸浮。通過免疫細胞化學方法控制分離得到單核細胞的純度。繼而，將單核細胞以1×10⁶細胞/mL的密度轉(zhuǎn)移至裸96孔板中，放置24小時以備功能分析。

動物

申請人從南京醫(yī)科大學實驗動物中心獲取了雄性APP/PSEN1轉(zhuǎn)基因小鼠及與其年齡相匹配的野生型(WT)小鼠。整個研究方案經(jīng)南京醫(yī)科大學動物關懷和管理委員會批準。本研究所進行的所有實驗均遵守美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物關懷和使用指導意見。

小鼠小膠質(zhì)細胞的分離

依據(jù)申請人以前描述的方法^[7]，從產(chǎn)后1天的野生型幼鼠腦組織中分離出小膠質(zhì)細胞。利用細胞免疫化學法對小膠質(zhì)細胞的純度進行確認。

申請人對Bliederhaeuser及其同事描述的方法^[8]進行了微調(diào)后，利用其從APP/PSEN1成年小鼠和野生型小鼠腦組織中分離出小膠質(zhì)細胞。大體過程為：小鼠被深度麻醉后，經(jīng)賁門灌入冰的Ringer溶液。用解剖刀將小鼠大腦切碎，在37℃溫度和5％CO₂濃度的條件下，將腦組織置于含有木瓜蛋白酶的酶溶液中孵育60min。隨后添加含20％FBS的Hanks平衡鹽溶液(HBSS)對酶溶液進行酸堿中和，并在200g(轉(zhuǎn)速)下離心4min。往離心出的顆粒狀物中再次加入2ml含0.5mg/mlDNA酶的HBSS溶液實現(xiàn)再懸浮，并在室溫下繼續(xù)孵育5min。利用經(jīng)火打磨過的巴氏吸管對腦組織進行輕度破壞，然后經(jīng)70μm細胞篩過濾(Thermo Fisher Scientific公司)，并在200g(轉(zhuǎn)速)下離心4min。然后將所得到的顆粒狀物在20ml含20％(Sigma-Aldrich公司)的HBBS等滲溶液中實現(xiàn)再懸浮。小心地將純的HBSS(20ml)置于percoll層的上方， 然后在200g(轉(zhuǎn)速)下離心20min。丟棄含有髓磷脂和細胞碎片的交界層，將含有混合膠質(zhì)細胞群的顆粒樣物質(zhì)用HBSS洗脫下來，并在含有10％FBS，1％P/S，1×丙酮酸鹽，1×GlutaMAXTM(Thermo Fisher Scientific公司)以及5ng/mL不含載體的小鼠重組粒細胞和巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF，R&D systems公司)的杜氏改良培養(yǎng)基中再懸浮。在37℃溫度，5％CO₂濃度條件下，將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移至15cm²的多聚-1-賴氨酸涂層板上培養(yǎng)。每隔3天更換一次基質(zhì)直至整個底面被一層細胞覆蓋。在膠質(zhì)細胞層形成后，小膠質(zhì)細胞會形成一層(與底部)不粘連的懸浮細胞層。申請人可以較容易地對這些細胞進行收集、轉(zhuǎn)移和進一步培養(yǎng)。收集完懸浮細胞層后，將小膠質(zhì)細胞置于無GM-CSF的條件下孵育3天，然后進行轉(zhuǎn)導操作或功能分析。采用免疫細胞化學方法對所收集小膠質(zhì)細胞的純度進行確認。

Aβ_1-42吞噬和降解試驗

采用Griciuc等人提供的離體試驗方法對單核細胞或小膠質(zhì)細胞對Aβ_1-42的吞噬和降解能力進行測定^[9]。將人單核細胞或小鼠小膠質(zhì)細胞與5μM的Aβ_1-42共同孵育6h，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定內(nèi)化Aβ_1-42的數(shù)量，以評估細胞對Aβ_1-42的吞噬作用。先將人單核細胞或小鼠的小膠質(zhì)細胞與5μM的Aβ_1-42共同孵育6h，繼而用新鮮培養(yǎng)液將細胞洗脫下來并置于無Aβ_1-42的血清中繼續(xù)培養(yǎng)6h，以測定細胞對Aβ_1-42的降解能力。之后，利用ELISA法測定細胞內(nèi)Aβ_1-42的剩余水平。用Aβ_1-42的剩余量與內(nèi)化總量的比值表示細胞對Aβ_1-42的降解能力。比值越高意味著細胞對Aβ_1-42的降解能力越低。

慢病毒顆粒的準備

為了使小膠質(zhì)細胞選擇性地過表達Trem1蛋白，申請人利用現(xiàn)有方法^[10]，構(gòu)建出在髓系分化CD11b啟動子調(diào)控下可以編碼小鼠WT Trem1 cDNA(NM_021406.5)的慢病毒載體及對照組病毒。為了敲除Trem1，申請人利用現(xiàn)有方法^[11]，在慢病毒載體中合成并利用U6啟動子克隆了以下短發(fā)夾序列(Trem1：5’-AATTCAAAAAAGACCAAGGGTTCT-3’和對照序列：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)。將純化后的慢病毒載體與套裝載體共轉(zhuǎn)染至293FT細胞內(nèi)。48小時后收集上清液，然后利用超速離心法將上清液中慢病毒顆粒濃度濃縮至1∶100，用磷酸鹽緩沖鹽水進行懸浮回收。利用商業(yè)滴定ELISA試劑盒(Takara Bio公司)對病毒滴度進行測定，未發(fā)現(xiàn)含有Trem1 cDNA或Trem1 shRNA的慢病毒顆粒及其對照組之間在滴度上存在顯著差異。

小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)導

關于小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)導過程，將純化后的小膠質(zhì)細胞以4×10⁵細胞/mL密度種植于24孔板上。向培養(yǎng)基中添加慢病毒顆粒和8μg/mL聚凝胺，并離心90min。轉(zhuǎn)染后立即除去上清液并替換成含10％FBS及50％膠質(zhì)培養(yǎng)上清液(轉(zhuǎn)染前從培養(yǎng)基中獲得)的基礎培養(yǎng)基。72h后，利用時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)和ELISA法對轉(zhuǎn)染效率進行測定。

慢病毒顆粒腦內(nèi)注射

注射過程遵循“盲法”，即負責立體定向顱內(nèi)注射慢病毒顆粒的技術(shù)人員對實驗組情況不知情。大體過 程為：將七月齡APP/PSEN1及與其年齡相匹配的WT小鼠麻醉后固定于立體定向操作架上(David Kopf Instruments公司)。使用與漢密爾頓注射器相連接的30-gauge微量移液管(Sigma-Aldrich公司)將慢病毒制劑(2μl)注入小鼠每側(cè)大腦半球的大腦皮層(兩處注射點)和海馬(一處注射點)。注射位置的立體定向坐標從前囟開始依次為：(1)大腦皮層：前后：-0.3，中間外側(cè)：2，背腹側(cè)：-1.5mm和前后：-2，中間外側(cè)：1.2，背腹側(cè)：-1.2mm；及(2)海馬：前后：-2；中間外側(cè)：1.2；背腹側(cè)：-2mm。完成注射2個月后對敲除效率和Trem1過表達情況進行驗證。

腦室內(nèi)抗體輸送

依據(jù)已有方法完成向腦室內(nèi)輸送抗體的操作^[12]。將激動性Trem1抗體(100μg，catalog#：MAB1187-100，R&D Systems公司)或者其IgG_2A同型對照抗體(100μg，catalog#：MAB006，R&D Systems公司)加入到200μL人造腦脊液中再懸浮，并注入微型滲透泵(model 2006，ALZET公司)中。關于泵移植的操作：將七月齡APP/PSEN1小鼠及與其年齡相匹配的WT小鼠麻醉后固定于立體定位操作架上(David Kopf Instruments公司)。將借乙烯塑料管與滲透泵相連的腦灌注套管(ALZET公司)移植進第三腦室背側(cè)(前囟后方0.5mm，顱骨表面下方3mm)。同時將滲透泵置于小鼠兩側(cè)肩胛骨間的皮下位置。在以后6周時間內(nèi)，以0.15μL/h的泵度，持續(xù)將抗體泵入腦內(nèi)。術(shù)后，將手術(shù)切口仔細縫合關閉。在整個手術(shù)過程中，未觀察到小鼠出現(xiàn)任何神經(jīng)毒性表現(xiàn)。

Y-迷宮測試

在動物被處死前的最后一天，按照之前描述的方法^[10]，采用“盲法”進行了Y-迷宮試驗以評估動物的短期空間記憶功能。在暴露期，將小鼠放置在“起始”臂末端，并允許其在5分鐘內(nèi)自由探索Y-迷宮的第一臂部分(定義為“起始”臂)和第二臂部分(定義為“其它”臂)。該階段，將通往迷宮第三臂部分(定義為“新”臂)的入口臨時阻斷。之后，小鼠被從迷宮中轉(zhuǎn)移到其居住的籠子里待上2min。在試驗階段，將小鼠再次放入迷宮的“起始”臂內(nèi)。同時，“新”臂入口被打開，并允許小鼠在迷宮中自由探索1rnin。利用追蹤系統(tǒng)(Noldus Information Technology公司)記錄下每一只小鼠于兩個階段內(nèi)在迷宮每一臂區(qū)內(nèi)花費的時間。對于暴露期，我們計算了小鼠待在“其它”臂的總時間與待在“起始”臂的總時間的比值。對于試驗期，我們計算了一個鑒別指數(shù)＝[新臂時間/(新臂時間+其它臂時間)]×100。

Morris水迷宮測試

在處死實驗動物前的最后6天內(nèi)，依據(jù)前述方法^[7]，采用“盲法”進行了水迷宮試驗。在連續(xù)5天內(nèi)給予小鼠4次/天的試驗訓練。并記錄下小鼠從起始處至找到水下隱藏平臺之間路線的總長度，同時計算出四次試驗所用時間的平均值。在最后一天，對小鼠進行一個移除平臺后的探索試驗，并利用追蹤系統(tǒng)(Noldus Information Technology公司)記錄下其游泳路徑。

qRT-PCR(實時定量-聚合酶鏈反應)

利用Trizol試劑從人單核細胞或小鼠小膠質(zhì)細胞中提取得到總RNA。利用PrimeScript^TM RT Master Mix (Takara Bio公司)在標準條件下使等量的總RNA發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄反應。接著根據(jù)廠商說明書，利用SYBR Green Premix Ex Taq(Takara Bio公司)和特定小鼠引物(GAPDH正向鏈：GGTGGTCTCCTCTGACTTCA，GAPDH反向鏈：TCCTTGGAGGCCATGTGGGC；Gapdh正向鏈：CAACAGCAACTCCCACTCTTC，Gapdh反向鏈：GGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT；TREM1正向鏈：AGTGGGGAGGATCATACTAGAAGAC，TREM1反向鏈：AGGCTGGTAGATCACACACTGATAC；Trem1正向鏈：TGCTGTGCGTGTTCTTTGTCT，Trem1反向鏈：CTTCTGGCTGTTGGCATACTT；TREM2正向鏈：CTATGACTCCATGAAGCA，TREM2反向鏈：GATTCCGCAGCGTAATGG；Trem2正向鏈：GACCTCTCCACCAGTTTCTCC，Trem2反向鏈：TACATGACACCCTCAAGGACTG；TYROBP正向鏈：AGCGATTGCAGTTGCTC，TYROBP反向鏈：GTGATACGCTGTTTCCGGGT；Tyrobp正向鏈：CGTACAGGCCCAGAGTGAC，Tyrobp反向鏈：CACCAAGTCACCCAGAACAA)進行了實時定量-聚合酶鏈反應。

ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)

為測定全長TREM家族蛋白在細胞膜上的水平，收集人類單核細胞和小鼠小膠質(zhì)細胞，并依照Geumann及其同事所描述的辦法^[13]提取了細胞膜蛋白。依據(jù)廠商提供的手冊，我們利用特殊的ELISA試劑盒(對于人類TREM1：catalog#：EHTREM1，Thermo Fisher Scientific公司；對于小鼠Trem1：catalog#：EMTREM1，Thermo Fisher Scientific公司；對于人類TREM2：catalog#：MBS2022102，MyBioSource，Inc.；對于小鼠Trem2：catalog#：MBS2023874，MyBioSource，Inc.)對全長TREMs蛋白進行檢測。

為了評估細胞內(nèi)Aβ_1-42的水平，我們參照之前方法^[7]收集并裂解了人類單核細胞和小鼠小膠質(zhì)細胞。為檢測腦內(nèi)可溶性和不可溶性Aβ_1-42水平，我們在4℃條件下，利用10個體積的含5mM乙二胺四乙酸(EDTA)的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水(TBS)，磷酸酶抑制劑，不含EDTA的蛋白酶抑制劑混合物及2mM 1，10-鄰二氮雜菲對大腦皮層和海馬組織獨立地進行了均質(zhì)化處理。得到的勻漿在4℃，100,000g(轉(zhuǎn)速)條件下離心1h。我們對上清液進行了收集以測定可溶性Aβ_1-42的含量。得到的顆粒狀物質(zhì)加入70％甲酸(FA，所用甲酸的體積等于用來離心的TBS勻漿的體積)作均質(zhì)化處理。樣本在4℃，100,000g(轉(zhuǎn)速)條件下離心1h并收集上清液。用1Mtris堿中和含有FA的上清液，所得樣本用來測定不可溶性Aβ1-42的含量。根據(jù)廠商提供手冊，利用Aβ1-42 ELISA試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)測定Aβ1-42的水平。

免疫組化分析

我們依據(jù)之前方法準備了腦組織切片以供免疫組化分析使用^[7]。將腦組織與小鼠抗Aβ的單克隆抗體(Covance公司)一起孵育，然后加入生物素化的羊抗小鼠IgG抗體(Zhongshan Golden Bridge公司)。利用二氨基聯(lián)苯胺對免疫反應進行檢測。之后，將組織脫水、制片并置于光學顯微鏡下觀察。依據(jù)我們之前描述的方法^[7]，采用“盲法”對總的淀粉樣蛋白水平進行測定。

統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software公司)進行數(shù)據(jù)分析。使用單樣本t檢驗，獨立樣本t檢驗或 單因素方差分析(ANOVA)以及Tukey′s post hoc檢驗對平均數(shù)之間差異進行比較。對于Morris水迷宮這一隱藏平臺試驗，用二因素重復測量方差分析及Bonferroni多重比較檢驗對路徑長度數(shù)據(jù)進行分析。本研究中，數(shù)據(jù)表達形式為：平均數(shù)±標準差。將P＜0.05視為具有統(tǒng)計學意義。

實施例2 Trem1可以調(diào)節(jié)小鼠小膠質(zhì)細胞對Aβ的吞噬作用

作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)唯一的單核吞噬細胞，小膠質(zhì)細胞通過吞噬活動參與Aβ的清除。為弄清TREM1在小膠質(zhì)細胞吞噬Aβ中的作用，我們利用慢病毒機制操縱從WT幼鼠中分離出的小膠質(zhì)細胞中Trem1的表達。在轉(zhuǎn)導72h后，分別利用qRT-PCR和ELISA技術(shù)對Trem1 mRNA的表達水平和Trem1蛋白水平的改變進行測定。之后，應用Griciuc等人提供的離體試驗方法檢測小膠質(zhì)細胞對Aβ_1-42的吞噬和降解作用。敲除Trem1導致WT幼鼠小膠質(zhì)細胞內(nèi)化Aβ_1-42水平下降52％(P＜0.05)，而Trem1過表達導致小膠質(zhì)細胞內(nèi)化Aβ_1-42水平增加將近1.7倍(P＜0.05)。值得注意的是：操縱Trem1表達水平并未顯著影響WT幼鼠源性小膠質(zhì)細胞對Aβ_1-42的降解指數(shù)。

據(jù)以往的研究發(fā)現(xiàn)：APP/PSEN1小鼠7月齡時會出現(xiàn)顯著的AD相關表型^[7]。因此，為了進一步在AD相關的背景下證實以上發(fā)現(xiàn)，我們通過慢病毒機制操縱7月齡APP/PSEN1小鼠小膠質(zhì)細胞中Trem1的表達。在完成轉(zhuǎn)導72h后，分別應用qRT-PCR和ELISA法對Trem1mRNA表達和Trem1蛋白水平改變進行測定。敲除Trem1使7月齡APP/PSEN1小鼠小膠質(zhì)細胞內(nèi)化Aβ_1-42的水平顯著下降46％(P＜0.05)。相反，Trem1過表達導致小膠質(zhì)細胞內(nèi)化Aβ_1-42水平增加將近1.5倍(P＜0.05)。然而，操縱Trem1表達水平的改變并未對7月齡APP/PSEN1小鼠小膠質(zhì)細胞對Aβ_1-42的降解速率造成顯著影響。

實施例3 在APP/PSEN1小鼠的疾病進展期，Trem1在小膠質(zhì)細胞上的表達水平相對穩(wěn)定。

由于TREM1在AD條件下可以促進小膠質(zhì)細胞介導的Aβ吞噬作用，我們合理地作出如下假設：TREM1可能在AD進展中起關鍵作用。為了驗證這一假設，我們首先探索了APP/PSEN1小鼠在1，4，7和10月齡時，小膠質(zhì)細胞Trem1及其適配器蛋白Tyrobp水平的動態(tài)改變。在APP/PSEN1小鼠疾病進展期間，Trem1或Tyrobp的表達水平未發(fā)生顯著變化(Trem1 mRNA水平：P＝0.31；Trem1蛋白水平：P＝0.4；Tyrobp mRNA水平：P＝0.77)。同時，我們也未發(fā)現(xiàn)APP/PSEN1小鼠及與其年齡相匹配的WT小鼠在小膠質(zhì)細胞Trem1或Tyrobp表達水平上存在任何顯著差異。

實施例4 敲除Trem1可促進Aβ神經(jīng)病理發(fā)生

為進一步探索TREM1蛋白在AD進展中的作用，我們利用慢病毒機制敲除了7月齡APP/PSEN1小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞中Trem1的表達，并觀察其對Aβ病理的影響。慢病毒注射2個月后，我們通過RT-PCR和ELISA法證實了APP/PSEN1小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞中Trem1的表達發(fā)生了下調(diào)改變。APP/PSEN1小鼠大腦中總的 淀粉樣蛋白水平在敲除Trem1后上升了1.66倍。此外，敲除Trem1使APP/PSEN1小鼠大腦皮層中不可溶性和可溶性Aβ_1-42的水平分別顯著增加2.48倍(n＝12，P＜0.05)和1.57倍(n＝12，P＜0.05)。而且，敲除Trem1使APP/PSEN1小鼠大腦海馬中不可溶性和可溶性Aβ_1-42的水平分別顯著增加1.89倍(n＝12，P＜0.05)和1.58倍(n＝12，P＜0.05)。以上結(jié)果表明：敲除Trem1可以加重APP/PSEN1小鼠大腦的Aβ病理水平，這意味著TREM1可作為保護因子抑制AD的進展。

實施例5 過表達Trem1可以減弱Aβ病理及挽救AD相關的空間認知損害

為驗證TREM1在AD進展中的保護作用，我們對7月齡APP/PSEN1小鼠大腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞的Trem1進行了選擇性過表達。慢病毒注射2個月后，我們通過RT-PCR和ELISA法證實了APP/PSEN1小鼠大腦小膠質(zhì)細胞中Trem1的表達發(fā)生了上調(diào)改變。

首先，我們觀察了Trem1過表達對大腦Aβ病理水平的影響。Trem1過表達使大腦內(nèi)總淀粉樣蛋白水平下降了65.4％。同時，Trem1過表達分別使APP/PSEN1小鼠大腦皮層中不可溶性和可溶性Aβ_1-42水平下降了61.7％(n＝12，P＜0.05)和32.5％(n＝12，P＜0.05)。此外，Trem1過表達分別使APP/PSEN1小鼠海馬中不可溶性和可溶性Aβ_1-42水平下降了58％(n＝12，P＜0.05)和35.9％(n＝12，P＜0.05)。

下一步，我們利用Y-迷宮試驗檢測了Trem1過表達對短期空間記憶的影響。在暴露期，各組小鼠在兩臂區(qū)域花費的時間差不多，可認為各組小鼠對迷宮的探索程度相同。在試驗期，我們發(fā)現(xiàn)WT小鼠的“鑒別指數(shù)”(反映相對“其它臂區(qū)域”，動物探索“新臂區(qū)域”的偏好傾向)大于50％(n＝24，P＜0.05)。當與WT小鼠相比較，APP/PSEN1小鼠對“新臂區(qū)域”的探索傾向出現(xiàn)受損(n＝24；與50％比較：P＜0.05；與WT小鼠比較：P＜0.05)。而過表達Trem1可以完全逆轉(zhuǎn)這一損害(n＝24；與50％機率比較：P＜0.05；與接受對照組慢病毒注射的APP/PSEN1小鼠比較：P＜0.05)。值得注意的是，注射慢病毒操作并未影響兩種小鼠在試驗期的表現(xiàn)。同時，WT小鼠中Trem1的過表達對試驗表現(xiàn)沒有影響。

之后，在處死動物前的最后5天里，我們利用水迷宮試驗對動物進行了測試。首先，我們比較了兩種小鼠的游泳速度，未觀察到顯著差異。慢病毒注射或Trem1過表達操作并未對兩種小鼠(WT和APP/PSEN1小鼠)的游泳速度產(chǎn)生明顯影響。這些結(jié)果確保我們排除動機和感覺運動因素對試驗表現(xiàn)的干擾。接下來我們利用一個隱藏平臺試驗來測試動物的空間學習功能。如圖5d所示：從第2至第5天時間里，WT小鼠找到平臺位置所游過的距離均要比APP/PSEN1小鼠短(第2天：8.45±1.03vs.9.14±1.04m；第3天：7.52±0.98vs.8.96±0.84m；第4天：6.05±0.42vs.8.11±0.57m；第5天：5.38±0.79vs.7.56±0.72m；n＝24/每組，P＜0.05)。二因素重復測量方差分析表明：在整個任務期間，WT小鼠的表現(xiàn)較好(F_genotype(1，230)＝148.8，P＜0.05；F_days(4，230)＝173.9，P＜0.05；F_{genotype×days}(4，230)＝15.59，P＜0.05)，該結(jié)果證實了9月齡APP/PSEN1小鼠確實表現(xiàn)出空間記憶學習功能的損害。重要的是，Trem1過表達可以挽救APP/PSEN1小鼠的這一功能損害(F_treatment(1，230)＝59.72，P＜0.05；F_days(4，230)＝85.07，P＜0.05；F_{treatment×days}(4，230)＝7.49，P＜0.05)。值得注意的是：慢病 毒注射操作并未影響兩種小鼠在水迷宮試驗中的表現(xiàn)。同時，Trem1過表達也未對WT小鼠的測試表現(xiàn)產(chǎn)生影響(F_treatment(1，230)＝2.27，n.s.；F_days(4，230)＝168.4，P＜0.05；F_{treatment×days}(4，230)＝0.95，n.s.)。為了檢測Trem1過表達對空間記憶的影響，我們將平臺從水下移除，并在上一次訓練試驗結(jié)束24h后再次讓小鼠進行空間探索試驗。與WT小鼠表現(xiàn)相反，APP/PSEN1小鼠在目標象限和其它任何象限花費的探索時間幾乎完全相同，意味著動物出現(xiàn)了明顯空間記憶損害。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)接受Trem1慢病毒注射的APP/PSEN1小鼠在目標象限花費的時間要比其它任何象限都要長，差異具有統(tǒng)計學意義(n＝24；37.57±1.38％vs.20.81±0.46％；P＜0.05)，這表明動物的空間記憶功能得到恢復。值得注意的是，慢病毒注射操作并未影響兩種小鼠在探索試驗中的表現(xiàn)。同時Trem1過表達也未影響WT小鼠在試驗中的表現(xiàn)。

實施例6 通過激動性抗體激活Trem1信號通路可以緩和Aβ病理及AD相關空間認知損害

為了將以上發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化到臨床相關背景，我們使用微型滲透泵持續(xù)6周向7月齡APP/PSEN1小鼠大腦第三腦室背側(cè)灌入一種激動性Trem1抗體以激活Trem1信號途徑。

首先，我們測定了Trem1信號途徑的激活對Aβ病理的影響。激動性Trem1抗體的注入使APP/PSEN1小鼠大腦皮層中非可溶性和可溶性Aβ_1-42的水平分別顯著降低了31.4％(n＝12，P＜0.05)和24.6％(n＝12，P＜0.05)。同時，激動性Trem1抗體的注入使APP/PSEN1小鼠海馬中非可溶性和可溶性Aβ_1-42的水平分別顯著降低了6.1％和22.6％(n＝12，P＜0.05)。

下一步，我們利用Y-迷宮試驗評估了Trem1信號途徑的激活對短期空間記憶的影響。在暴露期，各組小鼠探索兩臂區(qū)域花費的時間差不多。在試驗期，APP/PSEN1小鼠呈現(xiàn)出來的“新臂”探索傾向受損(n＝24；與50％機率相比：n.s.；與WT小鼠相比：P＜0.05)可被激動性Trem1抗體所挽救(n＝24；與50％機率相比：P＜0.05；與接受對照組抗體注射的APP/PSEN1小鼠相比：P＜0.05)。需要指出的是，微型滲透泵的移植并未對兩種小鼠在試驗期的表現(xiàn)產(chǎn)生影響。同時，WT小鼠在試驗期的表現(xiàn)也未受激動性Trem1抗體的影響。

此后在動物處死前的最后5天，我們應用Morris水迷宮試驗對動物進行了測試。WT和APP/PSEN1小鼠的游泳速度均未受到微型滲透泵移植操作或激動性Trem1抗體注入操作的明顯影響。我們接著利用隱藏平臺試驗測定了動物的空間學習功能。激動性Trem1抗體的注入成功挽救了APP/PSEN1小鼠受損的空間學習能力(F_treatment(1，230)＝62.79，P＜0.05；F_days(4，230)＝103.4，P＜0.05；F_{treatment×days}(4，230)＝4.02，P＜0.05)。值得注意的是，微型滲透泵的植入操作并未影響兩種小鼠在隱藏平臺試驗中的表現(xiàn)。同時，激動性Trem1抗體的注入并未對WT小鼠試驗期的表現(xiàn)產(chǎn)生任何影響(F_treatment(1，230)＝0.18，n.s.；F_days(4，230)＝203，P＜0.05；F_{treatment×days}(4，230)＝2.31，n.s.)。為了檢測Trem1信號通路的激活對空間記憶的影響，我們將平臺移除并在上個訓練試驗結(jié)束后24h再次讓小鼠進行空間探索試驗。接受激動性Trem1抗體的注入的APP/PSEN1小鼠在目標象限花費的時間要比其它任何象限長，差異具有統(tǒng)計學意義(F_treatment(1，230)＝0.18，n.s.；F_days(4，230)＝203，P＜0.05；F_{treatment×days}(4，230)＝2.31，n.s.)，表明小鼠空間記憶功能得到改善。值得注意的是，微 型滲透泵的植入并未影響兩種小鼠在探索試驗中的表現(xiàn)。同時，激動性Trem1抗體的注入對WT小鼠試驗期的表現(xiàn)沒有影響。

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