本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種雞腸炎沙門(mén)氏菌感染抗性分子標(biāo)記--相關(guān)基因LRP5的檢測(cè)方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸炎沙門(mén)氏菌屬于革蘭氏陰性桿菌，超過(guò)2500多種血清型，不僅能引起畜禽發(fā)病，造成養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，而且也是食源性疾病的主要病原菌之一，能通過(guò)家禽副產(chǎn)品給人類(lèi)的健康帶來(lái)較大威脅，是報(bào)道最頻繁的致病微生物之一。有關(guān)報(bào)道指出，2004年期間，在美國(guó)每1百萬(wàn)人中有19000人因感染沙門(mén)氏菌而住院，多達(dá)300人因沙門(mén)氏菌感染出現(xiàn)死亡；在歐盟，2010年間約有99020起因沙門(mén)氏菌感染引起的食源性疾病暴發(fā)。
家禽及其相關(guān)加工產(chǎn)品是腸炎沙門(mén)氏菌的主要傳染源，腸炎沙門(mén)氏菌能夠透過(guò)蛋殼進(jìn)入雞蛋產(chǎn)品中，且能在生殖道中寄存繁殖。目前控制沙門(mén)氏菌感染的方法主要是使用疫苗和抗生素，但這不能從根本上解決問(wèn)題，而且抗生素的大量使用會(huì)引起食品安全問(wèn)題及細(xì)菌的耐藥性，且造成菌株耐藥性增強(qiáng)。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，提高畜禽對(duì)疾病和病原的遺傳抗性，為控制沙門(mén)氏菌感染提供可能性，但是現(xiàn)有技術(shù)中缺乏相應(yīng)的技術(shù)啟示存在。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一種雞腸炎沙門(mén)氏菌感染抗性分子標(biāo)記--相關(guān)基因LRP5的檢測(cè)方法及其應(yīng)用，該方法提供了以雞LRP5基因rs80757564位點(diǎn)作為分子標(biāo)記，對(duì)應(yīng)提供了分型引物和對(duì)應(yīng)PCR條件，利用上述引物和方法，可以準(zhǔn)確檢測(cè)雞感染腸炎沙門(mén)氏菌后LRP5基因的基因型，為雞抗腸炎沙門(mén)氏菌感染的育種提供理論依據(jù)。
發(fā)明人提供的具體技術(shù)方案如下：
本發(fā)明所述的雞腸炎沙門(mén)氏菌感染抗性分子標(biāo)記為相關(guān)基因LRP5基因rs80757564位點(diǎn)；
發(fā)明人首先根據(jù)雞LRP5基因rs80757564位點(diǎn)兩側(cè)序列，設(shè)計(jì)提供了用于基因分型的引物如下表所示；
在上述引物的基礎(chǔ)上，發(fā)明人利用上述基因分型引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，其PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下表：
基因分型PCR體系(20uL)
PCR反應(yīng)程序：95℃2min，40個(gè)循環(huán)(94℃30s，56℃90s，65℃30s)，65℃10min。
根據(jù)上述方法擴(kuò)增后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得每個(gè)個(gè)體的基因型，之后利用SAS方差分析和平板計(jì)數(shù)法，獲得雞盲腸內(nèi)容物含菌量與SNP基因型相關(guān)性結(jié)果，見(jiàn)下表：
SNP位點(diǎn)基因型和盲腸內(nèi)容物腸炎沙門(mén)氏菌含菌量相關(guān)性分析
可見(jiàn)不同基因型個(gè)體的盲腸含菌量存在明顯差異，TT型個(gè)體盲腸含菌量顯著高于GG型個(gè)體(P<0.01)，GG基因型個(gè)體對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌感染抗性高于TT基因型。該位點(diǎn)可以作為雞腸炎沙門(mén)氏菌抗性育種的分子標(biāo)記，在實(shí)際育種過(guò)程中，可以選擇GG基因型個(gè)體，以提高雞群對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌感染的抗性。從而實(shí)現(xiàn)雞腸炎沙門(mén)氏菌感染抗性分子標(biāo)記在雞抗腸炎沙門(mén)氏菌感染的育種中的應(yīng)用。
上述過(guò)程中的待測(cè)雞只為人工接種雞只，方法如下：
利用平板計(jì)數(shù)法，對(duì)剛孵化的濟(jì)寧百日雞進(jìn)行腸炎沙門(mén)氏菌陰性檢測(cè)，選擇190只腸炎沙門(mén)氏菌陰性個(gè)體進(jìn)行接種試驗(yàn)。
利用口服法，對(duì)每只雞接種109cfu(菌落形成單位)腸炎沙門(mén)氏菌，接種后第7天，進(jìn)行屠宰，收集盲腸內(nèi)容物，利用平板計(jì)數(shù)法，測(cè)定每只雞盲腸內(nèi)容物含菌量。
綜上所述，本發(fā)明提供了一種雞腸炎沙門(mén)氏菌感染抗性分子標(biāo)記--相關(guān)基因LRP5的檢測(cè)方法及其應(yīng)用，該方法提供了以雞LRP5基因rs80757564位點(diǎn)作為分子標(biāo)記，對(duì)應(yīng)提供了分型引物和對(duì)應(yīng)PCR條件，利用上述引物和方法，可以準(zhǔn)確檢測(cè)雞感染腸炎沙門(mén)氏菌后LRP5基因的基因型，為雞抗腸炎沙門(mén)氏菌感染的育種提供理論依據(jù)。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中除特殊說(shuō)明之外，所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；
實(shí)施例1
待測(cè)雞的獲得
待測(cè)雞為人工接種雞只，方法如下：
利用平板計(jì)數(shù)法，對(duì)剛孵化的濟(jì)寧百日雞進(jìn)行腸炎沙門(mén)氏菌陰性檢測(cè)，選擇190只腸炎沙門(mén)氏菌陰性個(gè)體進(jìn)行接種試驗(yàn)。
利用口服法，對(duì)每只雞接種109cfu(菌落形成單位)腸炎沙門(mén)氏菌，接種后第7天，進(jìn)行屠宰，收集盲腸內(nèi)容物，利用平板計(jì)數(shù)法，測(cè)定每只雞盲腸內(nèi)容物腸炎沙門(mén)氏菌含量。
基因分型及與盲腸內(nèi)容物含菌量相關(guān)性分析
引物序列：
利用上述基因分型引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，其PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下表：
基因分型PCR體系(20uL)
PCR反應(yīng)程序：95℃2min，40個(gè)循環(huán)(94℃30s，56℃90s，65℃30s)，65℃10min。
根據(jù)上述方法擴(kuò)增后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得每個(gè)個(gè)體的基因型，之后利用SAS方差分析，獲得雞盲腸內(nèi)容物含菌量與SNP基因型相關(guān)性結(jié)果，見(jiàn)下表：
SNP位點(diǎn)基因型和盲腸內(nèi)容物腸炎沙門(mén)氏菌含菌量相關(guān)性分析
可見(jiàn)不同基因型個(gè)體的盲腸含菌量存在明顯差異，TT型個(gè)體盲腸含菌量顯著高于GG型個(gè)體(P<0.01)。
綜上所述，LRP5基因rs80757564位點(diǎn)與雞腸炎沙門(mén)氏菌感染抗性相關(guān)，GG基因型個(gè)體對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌感染抗性高于TT基因型。該位點(diǎn)可以作為雞腸炎沙門(mén)氏菌抗性育種的分子標(biāo)記，在實(shí)際育種過(guò)程中，可以選擇GG基因型個(gè)體，以提高雞群對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌感染的抗性。