本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種雞腸炎沙門氏菌感染抗性分子標(biāo)記Wnt7b的檢測方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸炎沙門氏菌屬于革蘭氏陰性桿菌，超過2500多種血清型，不僅能引起畜禽發(fā)病，造成養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，而且也是食源性疾病的主要病原菌之一，能通過家禽副產(chǎn)品給人類的健康帶來較大威脅，是報道最頻繁的致病微生物之一。有關(guān)報道指出，2004年期間，在美國每1百萬人中有19000人因感染沙門氏菌而住院，多達(dá)300人因沙門氏菌感染出現(xiàn)死亡；在歐盟，2010年間約有99020起因沙門氏菌感染引起的食源性疾病暴發(fā)。
家禽及其相關(guān)加工產(chǎn)品是腸炎沙門氏菌的主要傳染源，腸炎沙門氏菌能夠透過蛋殼進(jìn)入雞蛋產(chǎn)品中，且能在生殖道中寄存繁殖。目前控制沙門氏菌感染的方法主要是使用疫苗和抗生素，但這不能從根本上解決問題，而且抗生素的大量使用會引起食品安全問題及細(xì)菌的耐藥性，且造成菌株耐藥性增強(qiáng)。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，提高畜禽對疾病和病原的遺傳抗性，為控制沙門氏菌感染提供可能性，但是現(xiàn)有技術(shù)中缺乏相應(yīng)的技術(shù)啟示存在。
基因Wnt7b屬于Wnt信號分子蛋白家族一類分泌性型蛋白，人們所熟悉的Wnt/Wingless/Notch和Hippo等通路及調(diào)控他們關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，最初都是在果蠅中發(fā)現(xiàn)，之后被深入研究(Dierick et al.,1987；Ingham et al.,1991；Kidd et al.,1983；Wu et al.,2003)Wnt信號通路由細(xì)胞外的配體蛋白、細(xì)胞膜受體及細(xì)胞漿內(nèi)的信號轉(zhuǎn)到部分和轉(zhuǎn)錄調(diào)控部分組成。Wnt信號通路分為兩大類：一類是Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b和Wnt8經(jīng)典途徑和Wnt4、Wnt5a和Wnt11非經(jīng)典途徑(Rajagopal et al.,2008)。rs313644723位點(diǎn)位于Wnt7b基因的上游區(qū)域，但還沒有關(guān)于該位點(diǎn)的基因型分型及其與腸炎沙門氏菌感染抗性相關(guān)性的研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一種雞腸炎沙門氏菌感染抗性分子標(biāo)記Wnt7b的檢測方法及其應(yīng)用，該方法提供了雞Wnt7b基因rs313644723位點(diǎn)分型的特異性引物及配合該引物使用的基因分型PCR條件，利用上述引物和方法，可以準(zhǔn)確檢測腸炎沙門氏菌感染抗性相關(guān)位點(diǎn)基因型，為雞抗腸炎沙門氏菌感染抗性個體的篩選和抗病育種提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
發(fā)明人提供的具體技術(shù)方案如下：
本發(fā)明所述的雞腸炎沙門氏菌感染抗性分子標(biāo)記為Wnt7b基因rs313644723位點(diǎn)；
發(fā)明人首先根據(jù)雞Wnt7b(NM_001037274)基因rs313644723位點(diǎn)兩側(cè)序列，設(shè)計提供了用于基因分型的引物如下表所示；
在上述引物的基礎(chǔ)上，發(fā)明人利用上述特異性分型引物進(jìn)行分型PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下表。
基因分型PCR體系(20uL)
PCR反應(yīng)程序：95℃2min，40個循環(huán)(94℃30s，56℃90s，65℃30s)，65℃10min。
根據(jù)上述方法擴(kuò)增后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得每個個體的基因型，之后利用SAS方差分析和平板計數(shù)法，獲得雞盲腸內(nèi)容物含菌量與SNP基因型相關(guān)性結(jié)果，見下表：
SNP位點(diǎn)基因型和盲腸內(nèi)容物腸炎沙門氏菌含菌量相關(guān)性分析
由上表可以看出，不同基因型個體的盲腸含菌量存在明顯差異，TT基因型個體盲腸含菌量顯著高于CC型個體(P<0.05)，可見Wnt7b基因rs313644723位點(diǎn)與雞腸炎沙門氏菌抗性相關(guān)，CC基因型個體對腸炎沙門氏菌感染抗性高于TT基因型。該位點(diǎn)可以作為雞腸炎沙門氏菌抗性育種的分子標(biāo)記，在實(shí)際育種過程中，可以選擇CC基因型個體，以提高雞群對腸炎沙門氏菌感染的抗性，從而實(shí)現(xiàn)雞腸炎沙門氏菌感染抗性分子標(biāo)記Wnt7b在雞抗腸炎沙門氏菌感染的育種中的應(yīng)用。
上述過程中的待測雞只為人工接種雞只，方法如下：
利用平板計數(shù)法，對剛孵化的濟(jì)寧百日雞進(jìn)行腸炎沙門氏菌陰性檢測，選擇190只腸炎沙門氏菌陰性個體進(jìn)行接種試驗。
利用口服法，對每只雞接種109cfu(菌落形成單位)腸炎沙門氏菌，接種后第7天，進(jìn)行屠宰，收集盲腸內(nèi)容物，利用平板計數(shù)法，測定每只雞盲腸內(nèi)容物含菌量。
綜上所述，本發(fā)明提供了一種雞腸炎沙門氏菌感染抗性分子標(biāo)記Wnt7b的檢測方法及其應(yīng)用，該方法提供了雞基因rs313644723位點(diǎn)分型的特異性引物及配合該引物使用的基因分型PCR條件，利用上述引物和方法，可以準(zhǔn)確檢測腸炎沙門氏菌感染抗性相關(guān)位點(diǎn)基因型，為雞抗腸炎沙門氏菌感染個體的篩選和抗病育種提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中除特殊說明之外，所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；
實(shí)施例1
待測雞的獲得
待測雞為人工接種雞只，方法如下：
利用平板計數(shù)法，對剛孵化的濟(jì)寧百日雞進(jìn)行腸炎沙門氏菌陰性檢測，選擇190只腸炎沙門氏菌陰性個體進(jìn)行接種試驗。
利用口服法，對每只雞接種109cfu(菌落形成單位)腸炎沙門氏菌，接種后第7天，進(jìn)行屠宰，收集盲腸內(nèi)容物，利用平板計數(shù)法，測定每只雞盲腸內(nèi)容物腸炎沙門氏菌含量。
基因分型及與盲腸內(nèi)容物含菌量相關(guān)性分析
引物序列：
發(fā)明人利用上述特異性分型引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下表。
基因分型PCR體系(20uL)
PCR反應(yīng)程序：95℃2min，40個循環(huán)(94℃30s，56℃90s，65℃30s)，65℃10min。
根據(jù)上述方法擴(kuò)增后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得每個個體的基因型，之后利用SAS方差分析，獲得雞盲腸內(nèi)容物含菌量與SNP基因型相關(guān)性結(jié)果，見下表：
SNP位點(diǎn)基因型和盲腸內(nèi)容物腸炎沙門氏菌含菌量相關(guān)性分析
由上表可以看出，不同基因型個體的盲腸含菌量存在明顯差異，TT基因型個體盲腸含菌量顯著高于CC型個體(P<0.05)，可見Wnt7b基因rs313644723位點(diǎn)與雞腸炎沙門氏菌感染抗性相關(guān)，CC基因型個體對腸炎沙門氏菌感染的抗性高于TT基因型。該位點(diǎn)可以作為雞腸炎沙門氏菌抗性育種的分子標(biāo)記，在實(shí)際育種過程中，可以選擇CC基因型個體，以提高雞群對腸炎沙門氏菌感染的抗性，從而實(shí)現(xiàn)雞腸炎沙門氏菌感染抗性分子標(biāo)記Wnt7b在雞抗腸炎沙門氏菌感染的育種中的應(yīng)用。