本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種基于II型限制性核酸內(nèi)切酶消除PCR反應(yīng)試劑自帶的內(nèi)源核酸污染的方法。技術(shù)背景聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerasechainreaction,PCR)，是現(xiàn)階段體外酶促合成特異DNA片段的一種常用且高靈敏度的方法。然而，過高的靈敏度使得PCR反應(yīng)會因為核酸污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果，這是PCR方法面臨的最大問題。雖然最常見的PCR污染是產(chǎn)物污染，但是在配置PCR反應(yīng)體系的各種原材料中也存在著能夠引起假陽性實驗結(jié)果的污染源。在PCR反應(yīng)試劑中，DNA聚合酶主要來源于大腸桿菌工程菌株，目前市面上銷售的DNA聚合酶都不能保證其中沒有細(xì)菌DNA，只是DNA的拷貝數(shù)多與少的問題。同時，市面上銷售的dNTP也主要消化自細(xì)菌基因組DNA，因此也不能保證其中沒有基因組DNA的存在。因此，在進(jìn)行實時熒光定量PCR時，在沒有產(chǎn)物污染的情況下，也存在由于設(shè)計的引物與內(nèi)源核酸匹配而引起假陽性結(jié)果的可能。目前，常用的和主流的防污染方法主要針對PCR產(chǎn)物，對于反應(yīng)原材料中攜帶性核酸污染的去除研究較少，主要是通過過濾的方式盡可能的去除內(nèi)源污染。但是使用過濾法不能完全去除內(nèi)源性核酸，同時還會產(chǎn)生大量的浪費。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種消除聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系原材料中自帶的內(nèi)源污染，排除由于內(nèi)源核酸而產(chǎn)生的PCR假陽性實驗結(jié)果。而本發(fā)明采取的利用II型限制性核酸內(nèi)切酶建立的防止內(nèi)源性污染方法既能夠去除內(nèi)源核酸又不會產(chǎn)生不必要的浪費。本發(fā)明包括的實驗步驟：(1)、依據(jù)供貨商提供的資料確定DNA聚合酶和dNTP的來源菌株，利用NCBI數(shù)據(jù)庫，以來源菌株的種類為首選，對設(shè)計的引物進(jìn)行序列比對，找尋潛在的結(jié)合位點，確認(rèn)可能存在的污染片段。(2)、對污染片段進(jìn)行酶切位點分析，找出序列中存在的限制性核酸內(nèi)切酶，選取適宜的II型限制性核酸內(nèi)切酶。(3)、將PCR反應(yīng)體系在適宜的酶切溫度下孵育一段時間，從而使得所述的限制性核酸內(nèi)切酶完全消化反應(yīng)體系中存在的內(nèi)源核酸污染。(4)、滅活PCR反應(yīng)體系中的所述IIS型限制性內(nèi)切酶，從而獲得II型限制性內(nèi)切酶被滅活的PCR反應(yīng)體系。(5)、對步驟(4)中獲得的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行分裝機(jī)模板的添加，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，當(dāng)內(nèi)源核酸污染被除去后，NTC空白對照將因為沒有模板而無法獲得PCR產(chǎn)物，顯示為陰性狀態(tài)。在優(yōu)選例中，所述的污染是步驟(3)之前的，能夠干擾步驟(5)的實驗結(jié)果，源于反應(yīng)原材料自有的內(nèi)源核酸DNA。在優(yōu)選例中，在步驟(3)中，在適宜的酶切溫度下的孵育時間為5-50分鐘，最佳地孵育時間為10-15分鐘。在優(yōu)選例中，在步驟(4)中，最適的II限制性核酸內(nèi)切酶的滅活溫度下的孵育時間為5-15分鐘，最佳地孵育時間為10分鐘。在優(yōu)選例中，所述的II型限制性核酸內(nèi)切酶選自下組：BamHI、DpnI、EcoRI、EcoRV、HindIII、KpnI、PstI、SacI、SalI、XbaI；本發(fā)明的有益效果：(1)、本發(fā)明方法可以消除PCR反應(yīng)原材料中的內(nèi)源核酸DNA，不影響正常擴(kuò)增和特異性，不存在試劑的浪費；(2)、本發(fā)明方法可以單獨的對各反應(yīng)原材料進(jìn)行處理，也可以對配置好的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行處理；(3)、本發(fā)明方法的反應(yīng)體系仍然是PCR標(biāo)準(zhǔn)體系，若是對配置好的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行處理，只需向原有的PCR體系中加入適宜的II型限制性核酸內(nèi)切酶，不改變PCR反應(yīng)程序即可消除內(nèi)源性核酸污染。附圖說明圖1：實施例酶切消化特異性試驗結(jié)果，其中A為處理的PCR反應(yīng)液加細(xì)菌DNA的實驗結(jié)果；B為處理的PCR反應(yīng)液加無核酸無核酸酶水的實驗結(jié)果；C為未處理的PCR反應(yīng)液加無核酸無核酸酶水的實驗結(jié)果。具體實施方法下面以具體實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各式改動，但這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。下列實施例未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如：分子克隆操作手冊，或按照制造廠商所建議的條件。II型限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI為ThermoFisherScientific公司產(chǎn)品。實施例為了考察本方法對反應(yīng)原材料攜帶的內(nèi)源核酸DNA的去除效果，以處理的PCR反應(yīng)液加大腸埃希菌DNA為陽性對照1，以未處理的PCR反應(yīng)液加無核酸無核酸酶水為陽性對照2，以處理的PCR反應(yīng)液加無核酸無核酸酶水為陰性對照進(jìn)行PCR程序運(yùn)行。1、引物設(shè)計依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的大腸埃希菌的基因序列為模板設(shè)計引物，如下：上游引物：TCCTACGGGAGGCAGCAGT下游引物：GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT2、PCR體系PCR體系(20ul)處理的PCR反應(yīng)液(ul)未處理的PCR反應(yīng)液(ul)10XTaqBuffer22dNTP(25mM)0.240.24正向引物(10uM)0.40.4反向引物(10uM)0.40.4模板22TaqDNA聚合酶(5U/ul)0.20.2SYBRGreen染料(10X)0.80.8EcoRI(1U/ul)0.025--水11.85511.96注：反應(yīng)液分裝入反應(yīng)管后再加入模板。3、反應(yīng)參數(shù)(1)、反應(yīng)液消化處理過程37℃10分鐘EcoRI消化配置的反應(yīng)液中的內(nèi)源核酸DNA80℃10分鐘滅活EcoRI(2)、分裝反應(yīng)液，并分別向其中加入細(xì)菌DNA和無核酸無核酸酶的水。(3)、PCR運(yùn)行程序Step195℃,10分鐘Step2(40循環(huán))95℃，5秒；60℃，45秒Step3熔解曲線生成4、實驗結(jié)果為了評價本發(fā)明是否能消除反應(yīng)原材料中的內(nèi)源核酸污染，我們在上述條件下，將反應(yīng)液分成3組用實時熒光定量PCR進(jìn)行驗證，熔解曲線的實驗結(jié)果如圖1所示。其中A為處理的PCR反應(yīng)液加細(xì)菌DNA的實驗結(jié)果；B為處理的PCR反應(yīng)液加無核酸無核酸酶水的實驗結(jié)果；C為未處理的PCR反應(yīng)液加無核酸無核酸酶水的實驗結(jié)果。由圖1可見，未經(jīng)II型限制性核酸內(nèi)切酶消化的PCR反應(yīng)液能夠以原材料中自帶的內(nèi)源核酸DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(C)，使得實驗結(jié)果呈現(xiàn)假陽性。而經(jīng)II型限制性核酸內(nèi)切酶消化的PCR反應(yīng)液因為沒有適合的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(B)，使得結(jié)果表現(xiàn)正常為陰性。同時，經(jīng)II型限制性核酸內(nèi)切酶消化的PCR反應(yīng)液以細(xì)菌DNA為模板能夠進(jìn)行正常的PCR擴(kuò)增，表明PCR反應(yīng)體系是可用的。當(dāng)前第1頁1 2 3