本發(fā)明屬于細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種自體軟骨細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

關(guān)節(jié)軟骨是一種負(fù)重結(jié)締組織，是關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)過程中不可或缺的一部分，雖然僅幾毫米厚，卻具有非常高的抗壓硬度和彈性，并且能在關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)過程中分散壓力。關(guān)節(jié)軟骨沒有神經(jīng)支配，也沒有血管，其營養(yǎng)成分必須從關(guān)節(jié)液中取得。由于缺乏血液供應(yīng)，細(xì)胞代謝緩慢，關(guān)節(jié)軟骨一旦損傷后便難以自行修復(fù)，因而在臨床上由于外傷或者疾病造成的關(guān)節(jié)軟骨缺損或變性壞死很常見。

近幾年來，組織工程和分子生物學(xué)的發(fā)展開辟了修復(fù)軟骨關(guān)節(jié)的新途徑，臨床上關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的方式有軟骨或軟骨細(xì)胞移植、骨膜移植、自體軟骨細(xì)胞移植等。自體軟骨細(xì)胞移植(ACI)是當(dāng)前反映較好的一種方式，將自體軟骨細(xì)胞在三維支架環(huán)境中培養(yǎng)，等到形成新的軟骨組織后再移植到缺損處修復(fù)軟骨。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord Mesnchymal Stem Cells，UC-MSCs)是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，它能分化成許多種組織細(xì)胞，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。目前有文獻(xiàn)報(bào)道，可將UC-MSCs移植到關(guān)節(jié)軟骨缺損處，治療關(guān)節(jié)軟骨損傷。

然而，不管是軟骨細(xì)胞移植還是間充質(zhì)干細(xì)胞移植，為獲得大量的細(xì)胞來源，需要在三維支架上分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，而三維支架均采用各種來源的水凝膠作為支架材料，其價(jià)格昂貴，且支架本身對(duì)自體軟骨細(xì)胞的增殖無明顯作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了一種自體軟骨細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法，以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，具體技術(shù)方案如下：

一種自體軟骨細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法，取自體軟骨細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞混合，接種到無菌三維膠原支架上進(jìn)行培養(yǎng)。

優(yōu)選的，所述自體軟骨細(xì)胞和所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞個(gè)數(shù)比為4:1。

優(yōu)選的，所述自體軟骨細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法中所述自體軟骨細(xì)胞接種數(shù)為2×10⁷個(gè)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種數(shù)為0.5×10⁷個(gè)。

優(yōu)選的，所述自體軟骨細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法中所述培養(yǎng)的時(shí)間為30-40天。

本發(fā)明所述自體軟骨細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法中所述自體軟骨細(xì)胞優(yōu)選為原代自體軟骨細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，所述原代自體軟骨細(xì)胞的制備方法具體包括以下步驟：1)取約3～4cm³的軟骨組織置于無菌木板上，用無菌手術(shù)刀將其切碎至1mm³大?。?/p>

2)將上述軟骨組織碎片轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，用含10％胎牛血清的無Ca²⁺、Mg²⁺磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液)洗滌兩遍；

3)加入軟骨組織碎片2～5倍體積的Ⅱ型膠原酶溶液，在37℃搖床上消化4～5小時(shí)，轉(zhuǎn)速為100～150rpm；

4)加入含10％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化；

5)采用200目篩網(wǎng)進(jìn)行過濾；

6)濾液離心，離心后試管底部的沉淀即為軟骨細(xì)胞；

7)將軟骨細(xì)胞用含10％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，按照1×10⁵～2×10⁵/mL的密度接種在T25培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h。

優(yōu)選的，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為第三代至第五代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。如第三代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，所述第三代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法具體包括以下步驟：1)取出保存的第二代hUC-MSC，去掉舊的培養(yǎng)基，加入PBS溶液進(jìn)行洗滌；

2)加入0.25％的胰蛋白酶消化1～2min；

3)加入10％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化；

4)離心后得到第二代hUC-MSCs沉淀；

5)用含10％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，按照1×10⁵～2×10⁵/mL的密度接種在T25培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h。

進(jìn)一步的，本發(fā)明所述自體軟骨細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法中所述無菌三維膠原支架優(yōu)選平鋪于培養(yǎng)容器的底部。

其中，所述培養(yǎng)容器優(yōu)選為培養(yǎng)皿，更優(yōu)選為35mm培養(yǎng)皿。

本發(fā)明所述無菌三維膠原支架的形態(tài)可以為球形、圓柱型、長方塊和正方塊。

優(yōu)選的，所述無菌三維膠原支架的形態(tài)為正方塊。

更優(yōu)選的，所述正方塊大小為1mm³。

優(yōu)選的，所述無菌三維膠原支架的數(shù)量為3塊。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)采用膠原支架代替水凝膠或瓊脂糖支架，成本低廉且具有生物修復(fù)作用，促進(jìn)自體軟骨細(xì)胞增殖；

(2)采用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSC)與軟骨干細(xì)胞按一定比例進(jìn)行共培養(yǎng)，hUC-MSC能分泌一些生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、表皮生長因子(EGF)等，這些生長因子可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖；

(3)自體軟骨細(xì)胞可分泌細(xì)胞外基質(zhì)，這些基質(zhì)可促進(jìn)hUC-MSC向軟骨細(xì)胞分化。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。

圖1為光學(xué)顯微鏡(50×)下的原代自體軟骨細(xì)胞的形態(tài)圖；

圖2為光學(xué)顯微鏡(50×)下的第三代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。如無特殊說明，本發(fā)明所涉及的實(shí)驗(yàn)材料及試劑均可以通過商業(yè)渠道購買獲得。如ELISA試劑盒購自上海雙贏生物科技有限公司。35mm的培養(yǎng)皿(購自康寧公司。

實(shí)施例1

1、原代自體軟骨細(xì)胞的制備

1)在超凈臺(tái)內(nèi)，取約3～4cm³的軟骨組織(來源于華僑醫(yī)院骨科)置于無菌木板上，用無菌手術(shù)刀將其切碎至1mm³大?。?/p>

2)將上述軟骨組織碎片轉(zhuǎn)移到50mL離心管(CORNING公司)中，用含10％胎牛血清的無Ca²⁺、Mg²⁺磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液)洗滌兩遍；

3)加入軟骨組織碎片2～5倍體積的Ⅱ型膠原酶溶液，在37℃搖床上消化4～5小時(shí)，轉(zhuǎn)速為100～150rpm；

4)加入含10％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化；

5)采用200目篩網(wǎng)進(jìn)行過濾；

6)濾液離心，離心后試管底部的沉淀即為軟骨細(xì)胞；

7)將軟骨細(xì)胞用含10％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，按照1×10⁵～2×10⁵/mL的密度接種在T25培養(yǎng)瓶(CORNING公司)中，在37℃、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)36h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察原代自體軟骨細(xì)胞。結(jié)果如圖1。

圖1顯示在光學(xué)顯微鏡(50×)下的原代自體軟骨細(xì)胞的形態(tài)呈鋪路石狀。

2、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSC)的制備

1)取出保存的第二代hUC-MSC，去掉舊的培養(yǎng)基，加入PBS溶液進(jìn)行洗滌；

2)加入0.25％的胰蛋白酶消化1～2min；

3)加入10％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化；

4)離心后得到第二代hUC-MSCs沉淀；

5)用含10％的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，按照1×10⁵～2×10⁵/mL的密度接種在T25培養(yǎng)瓶(CORNING公司)中，在37℃、5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)36h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果如圖2所示。

圖2結(jié)果顯示在光學(xué)顯微鏡(50×)下的第三代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)呈旋渦狀。

3、無菌膠原支架材料的制備

在無菌條件下，將約10cm×10cm×3cm(長×寬×高)的無菌膠原材料(購自華南理工大學(xué))用無菌手術(shù)剪剪至1cm×1cm×0.2cm(長×寬×高)的大小。

4、三維共培養(yǎng)體系的建立

1)取三塊上述制備的無菌膠原支架材料平鋪在35mm的培養(yǎng)皿的底部；

2)將上述制備的原代自體軟骨細(xì)胞和hUC-MSC按4：1的細(xì)胞個(gè)數(shù)比混合，接種到膠原支架上進(jìn)行培養(yǎng)，其中自體軟骨細(xì)胞接種數(shù)為2×10⁷個(gè)，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種數(shù)為0.5×10⁷個(gè)。

對(duì)比例1自體軟骨細(xì)胞在三維水凝膠支架上進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)的方法

1、原代自體軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)

同實(shí)施例1中原代自體軟骨細(xì)胞的制備。

2、海藻酸鈉水凝膠支架的三維培養(yǎng)

1)購買海藻酸鈉水凝膠支架；

2)將1×10⁷～3×10⁷個(gè)原代自體軟骨細(xì)胞放到海藻酸鈉水凝膠上培養(yǎng)30～50天。

實(shí)施例2檢測(cè)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的Ⅱ型膠原的含量

1、分別收集實(shí)施例1和對(duì)比例1中在三維支架上培養(yǎng)30天后細(xì)胞培養(yǎng)液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中軟骨細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原的含量，具體檢測(cè)步驟按照Ⅱ型膠原含量檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行：

1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原；

2)加稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃條件下反應(yīng)30min，細(xì)胞培養(yǎng)液中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗-體復(fù)合物；

3)加酶標(biāo)抗抗體；

4)加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測(cè)抗體的量成正比，30min后，在562nm波長處用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。

2、記錄并分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

Ⅱ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與吸光度值成線性關(guān)系，其線性曲線為：Y＝0.132X+1.8。實(shí)施例1中細(xì)胞培養(yǎng)液所測(cè)Ⅱ型膠原的OD₄₅₀值為2.56，對(duì)比例1中細(xì)胞培養(yǎng)液所測(cè)Ⅱ型膠原的OD₄₅₀值為1.98。根據(jù)線性曲線計(jì)算得到，實(shí)施例1中細(xì)胞培養(yǎng)液的Ⅱ型膠原的含量為5.76μg/mL，對(duì)比例1中細(xì)胞培養(yǎng)液的Ⅱ型膠原的含量為1.36μg/mL。表明實(shí)施例1中建立的三維共培養(yǎng)方法能夠促進(jìn)Ⅱ型膠原的產(chǎn)生，說明本發(fā)明建立的三維共培養(yǎng)方法能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。

實(shí)施例3檢測(cè)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的糖胺聚糖的含量

步驟一、分別收集實(shí)施例1和對(duì)比例1中在三維支架上培養(yǎng)30天后細(xì)胞培養(yǎng)液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中軟骨細(xì)胞外基質(zhì)糖胺聚糖的含量，具體檢測(cè)步驟按照糖胺聚糖含量檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行：

1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原；

2)加稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃條件下反應(yīng)30min，條件培養(yǎng)基中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗-體復(fù)合物；

3)加酶標(biāo)抗抗體；

4)加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測(cè)抗體的量成正比，30min后，在562nm波長處用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。

步驟二、記錄并分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

糖胺聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的濃度與吸光度值成線性關(guān)系，其線性曲線為：Y＝0.21X+0.8。實(shí)施例1中細(xì)胞培養(yǎng)液所測(cè)糖胺聚糖的OD₄₅₀值為1.64，對(duì)比例1中細(xì)胞培養(yǎng)液所測(cè)糖胺聚糖的OD₄₅₀值為1.32。根據(jù)線性曲線計(jì)算得到，實(shí)施例1中細(xì)胞培養(yǎng)液的糖胺聚糖的含量為4μg/mL，對(duì)比例1中細(xì)胞培養(yǎng)液的糖胺聚糖的含量為2.48μg/mL。表明實(shí)施例1中建立的三維共培養(yǎng)方法能夠促進(jìn)糖胺聚糖的產(chǎn)生，說明本發(fā)明建立的三維共培養(yǎng)方法能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)同等條件下，在膠原支架上進(jìn)行共培養(yǎng)后的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅱ型膠原和糖胺聚糖的含量均比對(duì)比例1中采用水凝膠支架單獨(dú)培養(yǎng)后的高，說明采用三維膠原支架代替三維水凝膠支架，并結(jié)合軟骨細(xì)胞和hUC-MSC進(jìn)行共培養(yǎng)，能夠有效的促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。