本發(fā)明涉及免疫細胞技術領域，主要涉及制備HIV抗原特異性CTL的試劑盒與方法。

背景技術：

艾滋病是一種嚴重危害人類健康的致死性傳染病，我國自1985年發(fā)現(xiàn)第1例艾滋病病毒(HIV)感染者以來，新感染人數(shù)每年快速增長，并以驚人的速度從高危人群向一般人群擴散。HIV(Human immunodeficiency virus)感染最主要的特征是其能夠直接感染和破壞人體免疫系統(tǒng)，導致CD4+T細胞數(shù)量不斷減少，最終導致感染者免疫系統(tǒng)崩潰而死亡。

細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)，是效應T細胞，可特異性識別MHC分子提呈的抗原，進而特異性地殺傷腫瘤細胞及受微生物感染的細胞等。CTL可高效且特異地殺傷靶細胞，而不損害正常組織。CTL殺傷腫瘤細胞的機制包括：1)釋放顆粒酶和穿孔素直接誘導腫瘤細胞死亡；2)通過Fas/FasL途徑誘導腫瘤細胞凋亡；3)分泌IFN-γ和TNF-α等細胞因子殺傷腫瘤細胞或抑制腫瘤細胞生長。

細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)對HIV病毒具有殺傷功能。通過進一步對患者疾病進展不同階段抗原特異性CTL細胞數(shù)量、頻率的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)其數(shù)量和頻率的變化與病毒清除的效率密切相關。因此建立高效的CTL細胞的擴增方法，對于研究HIV清除的免疫機制、有效評判臨床預后具有重要意義。

為了解決CTL細胞擴增效率低下的問題，本發(fā)明提供了一種剔除調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(T regulatory cells,Tregs)進行CTL細胞體外擴增的方法。發(fā)明通過將艾滋病患者的外周血中Tregs去除，并聯(lián)合細胞因子IL-2添加的方式有效擴增CTL細胞。此方法能有效提高CTL細胞擴增的效率，對于研究HIV清除的免疫機制具有更為重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種HIV抗原特異性CTL的擴增方法。本發(fā)明通過將艾滋病患者的外周血中Tregs去除，并聯(lián)合細胞因子IL-2添加的方式有效擴增HIV抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞。大大增強HIV抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的殺傷功能。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了如下技術方案：

本發(fā)明提供了一種擴增HIV抗原特異性CTL的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)分離并體外培養(yǎng)艾滋病患者外周血單個核細胞；

(2)去除單個核細胞內(nèi)的Tregs細胞；

(3)使用促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑刺激培養(yǎng)經(jīng)過步驟(2)處理的細胞。

進一步，本發(fā)明選擇的艾滋病患者其HIV血清學標志物為HIV Ab⁺，白細胞抗原標志物為HLA-A2⁺。其中上角標的正(+)負(-)分別表示陽性和陰性。

通常采用PBMC作為CTL的起始細胞的來源，PBMC中含有CD4陽性T淋巴細胞(CD4⁺T)、CD8陽性T淋巴細胞(CD8⁺T)、B淋巴細胞、單核細胞(Mo)、自然殺傷細胞(NK)等多種細胞成份。

采用單采法一次性可采集大量外周PBMC，獲得大量起始細胞，多余PBMC可輻照或凍存，用于多次細胞毒性T淋巴細胞制備和應用，且方法操作簡便。

進一步，外周血單個核細胞的分離方法包括但不限于，葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法(ficoll-hypaque density gradient centrifugation)，用此方法分離PBMC純度可達95％，淋巴細胞約占90％，其中T淋巴細胞占80％，B淋巴細胞占4～10％。

進一步，葡聚糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)混合溶液，又稱淋巴細胞分層液，在分離人PBMC時，要求其比重為1.077±0.01。

作為可替代的實施方案，葡聚糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)混合溶液可被percoll細胞分離液代替。

進一步，步驟(2)中剔除的步驟(1)獲取的單個核細胞內(nèi)的Tregs細胞是細胞表面標記為CD4⁺CD25⁺CD127^-的調(diào)節(jié)性T細胞。

進一步，步驟(2)中剔除步驟(1)獲取的單個核細胞內(nèi)的Tregs細胞可采用免疫磁珠陰性分選法。免疫磁珠分離法是基于細胞表面抗原能與連接在磁珠上的特異性單克隆抗體相結(jié)合，在外磁場作用下，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面標記抗原的細胞由于不能與磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，因此不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。免疫磁珠分離法有陽性分選法和陰性分選法，陽性分選法的磁珠所結(jié)合的細胞是需要分離獲得的細胞，而陰性分離法的磁珠所結(jié)合的細胞為不需要細胞。本發(fā)明利用免疫磁珠陰性分選法將PBMC中的Treg細胞去除，將PBMC向Treg轉(zhuǎn)化降至最低，PBMC中剩下的細胞則進行后續(xù)的HIV抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞誘導擴增培養(yǎng)。

進一步，步驟(3)中添加的促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑包括但不限于IFN-γ、IL-1α、PHA、IL-2、IL-7中的一種或者幾種。優(yōu)選地，本發(fā)明采用的促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑為IL-2。

本發(fā)明還提供了一種制備HIV抗原特異性CTL的試劑盒，所述試劑盒包括：

分離外周血單個核細胞的試劑；

淋巴細胞分離液；

促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑。

進一步，所述淋巴細胞分離液包括葡聚糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque)混合溶液，或percoll細胞分離液。

進一步，所述促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑包括但不限于IFN-γ、IL-1α、PHA、IL-2、IL-7中的一種或者幾種。優(yōu)選地，本發(fā)明采用的促進HIV抗原特異性CTL擴增和激活的試劑為IL-2。

本發(fā)明的試劑盒還可以包括：

PBS緩沖液；

10％胎牛血清培養(yǎng)基。

本發(fā)明還提供了一種HIV抗原特異性CTL的檢測方法，所述檢測方法包括通過流式細胞儀檢測HIV抗原特異性CTL的頻率。

抗原特異性CTL流式檢測所用的免疫球蛋白五聚體(Pentamer)識別的HIV抗原表位是p17gag蛋白上的SL9(SL9,SLYNTVAL)表位。Pentamer由北京四正柏生物科技有限公司提供。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

(1)本發(fā)明選用剔除Tregs細胞，聯(lián)合細胞因子IL-2的方式刺激HIV抗原特異性CTL，有效地提高了HIV抗原特異性CTL的擴增效率。

(2)本發(fā)明選用MHC肽五聚體染色的技術檢測HIV抗原特異性CTL，通過Pentamer染色可以有效區(qū)分HIV抗原特異性CTL的擴增效率。

附圖說明

圖1顯示利用流式細胞儀檢測HIV抗原特異性CTL的擴增效率；A：陰性對照，B：PBMC+IL-2；C：PBMC-Tregs+IL-2。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。本領域的普通技術人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權利要求及其等同物限定。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件實施檢測。

實施例1外周血單個核細胞分離

1、材料收集：收集解放軍第302醫(yī)院艾滋病患者的血液1份，其血清學標志物為HIV Ab⁺，白細胞抗原標志物為HLA-A2+，符合上述檢測標準的樣本進行后續(xù)實驗。

2、外周血單個核細胞分離

(1)靜脈取血20ml，加入含肝素溶液(10～50U/m1血樣本)的試管中，混勻，使血液抗凝。用pH7.2的Hanks液將抗凝血稀釋1倍。

(2)吸取10ml淋巴細胞分層液置于刻度離心管中，然后將離心管傾斜45度角，用毛細滴管將稀釋的全血沿管壁緩慢加至分離液上面，應注意保持兩者界面清晰。

(3)在18℃～20℃下，用水平離心機以2000r/min離心20min。

(4)用毛細吸管輕輕插到混濁帶，沿管壁輕輕吸出此層細胞，移入另一支離心管中。即要吸取所有單個核細胞，又要避免吸取過多的分層液或血漿，以免混入其他細胞成分。

(5)用PBS洗滌細胞2次，一次2000r/min，10min；第2次1500r/min，10min，可去掉大部分混雜的血小板。

(6)將沉淀細胞懸于培養(yǎng)基中備用。

實施例2調(diào)節(jié)性T細胞去除

一、溶液配制

PBS：用分析純試劑，Millipore級別的純水配制，高壓滅菌。

分離緩沖液：PBS中加入終濃度為0.5％的BSA和2mM EDTA，注意無菌操作，液體儲存于2-8℃。

二、磁珠分選標準操作程序

1、分選細胞染色處理流程

(1)將分離的外周血單個核細胞懸液離心，1500r/min，10min。

(2)調(diào)整細胞濃度，每1*10⁷細胞用40μl分離緩沖液重懸。

(3)每1*10⁷細胞加入10μl生物素標記的抗體混合物(Anti-CD4-FITC、Anti-CD25-APC、Anti-CD127-PE)于4℃孵育10分鐘。

(4)每1*10⁷細胞補加30ul緩沖液和20μl抗生物素抗體20ul。

(5)充分混合后于4℃孵育15分鐘。

(6)每1*10⁷細胞加入1-2ml緩沖液洗滌后離心，1500r/min，10min。

(7)每1*10⁸細胞加入500μl緩沖液重懸備用。

2、磁珠分選刪除CD4^-CD127⁺細胞流程

(1)用2ml緩沖液沖洗備選好的磁珠分選LD柱。

(2)將抗體標記好的單細胞懸液緩慢滴加到LD柱中。

(3)收集細胞流出液，用2ml緩沖液繼續(xù)沖洗LD柱。

(4)收集細胞流出液備用。

(5)加壓LD柱柄使陰選細胞和緩沖液一同流出。

(6)收集LD柱內(nèi)細胞流出液備用。

3、磁珠標記CD4⁺CD25⁺CD127^-調(diào)節(jié)性T細胞

(1)將陰選收集好的細胞流出液離心1500r/min，10min，棄掉上清。

(2)每1*10⁷細胞用90μl緩沖液充分混懸。

(3)每1*10⁷細胞加入10μl CD25分子標記的磁珠。

(4)充分混懸后于4℃孵育15分鐘。

(5)另行加入混合抗體10μl Anti-CD25-APC,10μl Anti-CD4-FITC,10μl Anti-CD127-PE抗體，避光4℃孵育5分鐘。

(6)孵育完成后加入1-2ml緩沖液離心，1500r/min，10min，棄掉上清。

(7)按照每1*10⁸細胞加入500μl緩沖液的標準重懸細胞備用。

4、磁珠陽性分選CD4⁺CD25⁺CD127^-調(diào)節(jié)性T細胞。

(1)將分選所用的MS柱放入體積適合的磁珠分選架內(nèi)。

(2)用500μl緩沖液預沖MS柱。

(3)將步驟3標記好磁珠的細胞懸液緩慢滴加入柱體內(nèi)，收集流出液。

(4)收集MS柱內(nèi)細胞流出液離心后棄上清，用培養(yǎng)基(10％胎牛血清的RPMI 1640)重懸。

實施例3 HIV抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的體外擴增

設立單純PBMC刺激組和剔除Tregs細胞的PBMC刺激組。

1、收集實施例2中獲取的LD柱內(nèi)細胞流出液MS柱內(nèi)細胞流出液，離心1500r/min，10min，棄掉上清。

2、用培養(yǎng)基(10％胎牛血清的RPMI 1640)重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至1*10⁷/ml。

3、使用96孔板按照1*10⁶/100μl/孔的細胞濃度種板。

4、每孔補加IL-2，終濃度為10ng/ml。

5、細胞在37℃，5％CO₂孵箱中培養(yǎng)72小時。

6、收集細胞進行流式細胞染色。

實施例4抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的流式檢測

步驟如下：

1、收集擴增好的淋巴細胞，離心，1500r/min，10min，棄掉上清。

2、PBC重懸細胞后分別加入染色抗體(HIV抗原特異性Pentamer,Anti-CD3-FITC,Anti-CD8-APC)，室溫，避光30分鐘。其中Pentamer識別的HIV抗原表位是p17gag蛋白上的HLA-A0201(SL9,SLYNTVAL)表位。

3、加入2ml的PBS洗液充分洗滌，離心，1500r/min，10min，棄掉上清。

4、細胞充分震蕩后加入250μl流式細胞固定液固定細胞。

5、流式細胞儀檢測抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的頻率。

實驗結(jié)果：

結(jié)果如圖1所示，剔除Tregs細胞聯(lián)合IL-2刺激組(PBMC-Tregs+IL-2)HIV抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的比例較單純PBMC聯(lián)合IL-2刺激組(PBMC+IL-2)明顯增加，實驗重復三次，統(tǒng)計平均值：剔除Tregs細胞聯(lián)合IL-2刺激組(PBMC-Tregs+IL-2)HIV抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的比例平均為4.09％，單純PBMC聯(lián)合IL-2刺激組(PBMC+IL-2)HIV抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞的比例平均為1.845％，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內(nèi)。