本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及一種用于檢測甘油三酯的試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
甘油三酯(Triglyceride，TG)是長鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，是人體內(nèi)含量最多的脂類，大部分組織均可以利用TG分解產(chǎn)物供給能量，同時(shí)肝臟、脂肪等組織還可以進(jìn)行TG的合成，在脂肪組織中貯存。
甘油三酯也是血脂的主要組成部分，是機(jī)體重要的供能物質(zhì)。食物中的甘油三酯在腸道經(jīng)胰脂酶消化分解，吸收后重新酯化為甘油三酯，經(jīng)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液。在病理?xiàng)l件下，各種組織細(xì)胞合成和貯存的甘油三酯顯著增加。定量檢測血液和組織細(xì)胞中甘油三酯含量，是臨床、臨床基礎(chǔ)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究常用的生化指標(biāo)。
甘油三酯的升高可見于家族性高甘油三酯血病、糖尿病、糖原累積癥、甲狀腺功能不足、腎病綜合征、高血壓、腦血管病、冠心病、肥胖等。甘油三酯減低可見于甲狀腺功能亢進(jìn)，腎上腺皮質(zhì)機(jī)能減退，肝功能嚴(yán)重低下，癌癥晚期等。
甘油三酯的升高可見于家族性高甘油三酯血病、糖尿病、糖原累積癥、甲狀腺功能不足、腎病綜合征、高血壓、腦血管病、冠心病、肥胖等。甘油三酯減低可見于甲狀腺功能亢進(jìn)，腎上腺皮質(zhì)機(jī)能減退，肝功能嚴(yán)重低下，癌癥晚期等。
甘油三酯測定的決定性方法為放射性核素稀釋-質(zhì)譜法；參考方法為二氯甲烷抽提，變色酸顯色法；常規(guī)方法為酶法(GPO-PAP法)。酶法測定特異性強(qiáng)，測定準(zhǔn)確度及靈敏度較高，操作簡便，試劑無腐蝕性，可全自動(dòng)操作，性價(jià)比高，是目前國內(nèi)外推薦使用的臨床常規(guī)的測定方法。目前市售的試劑盒絕大多數(shù)采用此法。
該法主要原理：脂蛋白脂肪酶(LPL)水解TG生成甘油和脂肪酸；水解后的甘油與三磷酸腺苷(ATP)在甘油激酶(GK)和磷酸甘油氧化酶(GPO)的催化下生成H2O2，H2O2偶聯(lián)Trinder反應(yīng)呈色，即H2O2與4-氨基安替比林(4-AAP)和色原在過氧化物酶(POD)的作用下生成醌亞胺，其生成量與樣本中的TG含量成正比。
已有文獻(xiàn)報(bào)道某些藥物(例如羥苯磺酸鈣和酚磺乙胺)會對基于Trinder反應(yīng)的試劑產(chǎn)生負(fù)干擾，從而得到不正確的結(jié)果，影響臨床醫(yī)生做出判斷，最終延誤患者治療，或采用不合理治療措施導(dǎo)致患者傷亡。例如，參見程涌江等，“酚磺乙胺對部分生化檢驗(yàn)項(xiàng)目干擾的相關(guān)研究，《國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》，2011年第11期。
羥苯磺酸鈣(calcium dobesilate)(又稱多貝斯(doxium))是毛細(xì)血管保護(hù)劑，主要用于治療微血管病、靜脈曲張綜合癥以及與微循環(huán)障礙伴發(fā)額靜脈功能不全，還用于靜脈剝離和靜脈硬化法的輔助治療，用于預(yù)防術(shù)后綜合癥，水腫及組織浸潤。
酚磺乙胺(又名止血敏)的化學(xué)名稱為2,5-二羥基苯磺酸二乙胺鹽。其能使血小板數(shù)量增加，并增強(qiáng)血小板的凝集和黏附力，促進(jìn)凝血活性物質(zhì)的釋放，從而產(chǎn)生止血作用。酚磺乙胺在臨床上主要用于預(yù)防和治療外科手術(shù)出血過多，血小板減少性紫癜或過敏性紫癜以及其他原因引起的出血。
羥苯磺酸鈣和酚磺乙胺對酶法檢測甘油三酯的干擾對被施用這兩種藥物的患者造成很大的不便。例如，對于糖尿病患者而言，常伴冠心病、血管動(dòng)脈硬化等，而所施用的羥苯磺酸鈣對酶法檢測甘油三酯的干擾可能造成糖尿病患者的甘油三酯水平無法得到正確評估，掩蓋并延誤病情。而對于手術(shù)患者，所施用的酚磺乙胺對酶法檢測甘油三酯的干擾可能使得不能正確評估其甘油三酯水平，造成術(shù)后并發(fā)癥，影響患者的預(yù)后。
目前，市場上出售的酶法檢測試劑盒普遍存在無法有效抵抗羥苯磺酸鈣和酚磺乙胺干擾的缺陷。
本領(lǐng)域中需要滿足以下一種或多種特性的甘油三酯測定試劑盒：能夠抵抗羥苯磺酸鈣和/或酚磺乙胺對酶法檢測甘油三酯的干擾；具有良好的重復(fù)性以及寬的線性范圍。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
一方面，本發(fā)明提供了一種甘油三酯測定試劑盒，其利用酶法檢測甘油三酯。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供甘油三酯測定試劑盒，其包含試劑組1(R1)和試劑組2(R2)，所述試劑組1包含鎂鹽、三磷酸腺苷、甘油激酶、甘油磷酸氧化酶、過氧化物酶和色原，所述試劑組2包含脂蛋白脂肪酶和4-氨基安替比林，其中，所述色原是N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)或者包含DAOS。
本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，在利用酶法檢測甘油三酯時(shí)，使用特定用量的DAOS或包含DAOS的色原能夠降低樣品中存在的羥苯磺酸鈣和/或酚磺乙胺對甘油三酯檢測所造成的干擾。尤其是根據(jù)本發(fā)明的組合物能夠降低樣品中存在的100mg/L及以下的羥苯磺酸鈣和/或250mg/L及以下的酚磺乙胺對甘油三酯檢測所造成的干擾。
在一些實(shí)施方式中，本文中所描述的試劑盒或試劑組1還可以包含抗壞血酸氧化酶。在一些實(shí)施方式中，抗壞血酸氧化酶的量在0.5-8KU/L，優(yōu)選1-5KU/L的范圍內(nèi)?？箟难嵫趸傅牧吭谏鲜龇秶鷥?nèi)時(shí)可以有效地降低羥苯磺酸鈣和/或酚磺乙胺對甘油三酯測定所造成的干擾。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒中抗壞血酸氧化酶的量可以為0.5KU/L、0.6KU/L、0.7KU/L、0.8KU/L、0.9KU/L、1KU/L、1.2KU/L、1.4KU/L、1.5KU/L、2KU/L、2.5KU/L、3KU/L、3.5KU/L、4KU/L、4.5KU/L、5KU/L、6KU/L、7KU/L或8KU/L。
在一些實(shí)施方式中，DAOS或色原的量可以在0.2-40mmol/L，優(yōu)選0.3-20mmol/L的范圍內(nèi)，例如，DAOS或色原的量可以為0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、12mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、35mmol/L、40mmol/L或45mmol/L。色原的量在上述范圍內(nèi)時(shí)可以有效地降低羥苯磺酸鈣和/或酚磺乙胺對甘油三酯測定所造成的干擾。
在一些實(shí)施方式中，所述4-氨基安替比林的量在0.1-20g/L、優(yōu)選0.2-10g/L的范圍內(nèi)。4-AAP的量在上述范圍內(nèi)時(shí)可以有效地降低羥苯磺酸鈣和/或酚磺乙胺對甘油三酯測定所造成的干擾。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒中4-AAP的量可以為0.15g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.5g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、15g/L或20g/L。在一些實(shí)施方式中，所述4-氨基安替比林的量也可以在1-50g/L，例如可以是1g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L或50g/L。
在一些實(shí)施方式中，所述鎂鹽的量為0.5-40mmol/L，優(yōu)選1-30mmol/L。在一些實(shí)施方式中，鎂鹽的量可以為0.5mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、12mmol/L、15mmol/L、18mmol/L、20mmol/L、22mmol/L、25mmol/L、28mmol/L、30mmol/L、35mmol/L或40mmol/L。
在一些實(shí)施方式中，鎂鹽可以是水溶性鎂鹽，例如氯化鎂、硫酸鎂。
在一些實(shí)施方式中，三磷酸腺苷的量為0.3-8.0mmol/L，優(yōu)選0.5-5.0mmol/L。在一些實(shí)施方式中，三磷酸腺苷的量可以為0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.7mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L、1.5mmol/L、1.8mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L、3mmol/L、3.5mmol/L、4mmol/L、4.5mmol/L、5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L或8mmol/L。
在一些實(shí)施方式中，所述甘油激酶的量為0.1-12KU/L、優(yōu)選0.3-10KU/L。在一些實(shí)施方式中，甘油激酶的量可以為0.1KU/L、0.2KU/L、0.3KU/L、0.4KU/L、0.5KU/L、0.6KU/L、0.8KU/L、1KU/L、1.2KU/L、1.4KU/L、1.5KU/L、2KU/L、3KU/L、4KU/L、5KU/L、6KU/L、7KU/L、8KU/L、9KU/L、10KU/L、11KU/L、12KU/L、13KU/L、14KU/L、15KU/L、16KU/L、18KU/L或20KU/L。
在一些實(shí)施方式中，甘油磷酸氧化酶的量為0.5-30KU/L，優(yōu)選1-20KU/L。在一些實(shí)施方式中，甘油磷酸氧化酶的量可以為0.5KU/L、0.8KU/L、1KU/L、2KU/L、5KU/L、8KU/L、10KU/L、12KU/L、15KU/L、18KU/L、20KU/L、25KU/L或30KU/L。
在一些實(shí)施方式中，過氧化物酶的量為0.5-30KU/L，優(yōu)選1-20KU/L。在一些實(shí)施方式中，過氧化物酶的量可以為0.5KU/L、0.8KU/L、1KU/L、2KU/L、5KU/L、8KU/L、10KU/L、12KU/L、15KU/L、18KU/L、20KU/L、25KU/L或30KU/L。
在一些實(shí)施方式中，脂蛋白脂肪酶的量為0.5-25KU/L，優(yōu)選1-20KU/L。在一些實(shí)施方式中，脂蛋白脂肪酶的量可以為0.5KU/L、0.8KU/L、1KU/L、2KU/L、5KU/L、8KU/L、10KU/L、12KU/L、15KU/L、18KU/L、20KU/L或25KU/L。
在一些實(shí)施方式中，使用根據(jù)本發(fā)明的試劑盒、方法或用途測得的樣品中的甘油三酯值與對對照樣品測得的甘油三酯值相比偏差小于10％，優(yōu)選小于8％，更優(yōu)選小于5.5％，最優(yōu)選小于4％，其中所述對照樣品為除不含羥苯磺酸鈣和酚磺乙胺之外，其他均與所述樣品相同的樣品。
在閱讀了本申請的內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠合理地確定各組分的用量比例。例如，在一些實(shí)施方式中，所述色原與所述4-氨基安替比林的摩爾比為0.2:1-50:1，優(yōu)選0.5:1-20:1，更優(yōu)選1:1-15:1，最優(yōu)選1.2:1-11:1。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒中色原與4-氨基安替比林的摩爾比可以為0.2:1、0.5:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1.0:1、1.1:1、1.2:1、1.5:1、2.0:1、2.6:1、3.0:1、3.2:1、3.5:1、3.8:1、4.0:1、4.2:1、4.5:1、4.8:1、5.0:1、5.5:1、6.0:1、6.5:1、7.0:1、7.5:1、8.0:1、8.5:1、9.0:1、9.5:1、10.0:1、10.5:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、20:1、30:1、40:1或者50:1。
在一些實(shí)施方式中，試劑組1與試劑組2的體積比在6:1-2:1，優(yōu)選5:1-3:1范圍內(nèi)，最優(yōu)選地為4:1。在一些實(shí)施方式中，所述試劑盒中試劑組1與試劑組2的體積比可以為6:1、5:1、4:1、3:1、2:1。
為了進(jìn)一步提高試劑盒的抗干擾性，可以組合使用上述各組分的優(yōu)選方式。組合的方式可以是任何合適的方式，例如將各組分分成兩組用于雙試劑型試劑盒中。
在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述試劑盒包含0.3-20mmol/L的DAOS或包含DAOS的色原；0.2-10g/L的4-氨基安替比林。優(yōu)選地，試劑盒還包含如下的一種或多種：1-5KU/L的抗壞血酸氧化酶、1-30mmol/L的鎂鹽、0.5-5.0mmol/L的三磷酸腺苷、0.3-10KU/L的甘油激酶、0.5-20KU/L的甘油磷酸氧化酶、1-20KU/L的過氧化物酶、1-20KU/L的脂蛋白脂肪酶、0.2-10g/L的4-氨基安替比林。在這些實(shí)施方式中，測得的樣品中的甘油三酯值與對對照樣品測得的甘油三酯酯值相比，偏差小于10％，優(yōu)選小于8％，更優(yōu)選小于6％，甚至更優(yōu)選小于4％，其中所述對照樣品為除不含羥苯磺酸鈣和酚磺乙胺之外，其他均與所述樣品相同的樣品。
所述試劑組1和/或試劑組2還可以包含以下試劑中的一種或更多種：緩沖溶液、穩(wěn)定劑、防腐劑和表面活性劑。
緩沖溶液可以為本領(lǐng)域中常規(guī)使用的緩沖溶液。在一些實(shí)施方式中，所述緩沖溶液可以各自獨(dú)立地為MOPS、good's緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、磷酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液以及其任意組合。在一些實(shí)施方式中，所述緩沖液的量在10-800mmol/L、優(yōu)選30-500mmol/L、更優(yōu)選地50-200mmol/L的范圍內(nèi)，例如80mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、180mmol/L。所述緩沖液的pH可以在6.0-8.5、優(yōu)選6.5-8.0、更優(yōu)選地7.0-8.0的范圍內(nèi)，例如7.4和7.8。
穩(wěn)定劑可以為蔗糖、BSA、木糖醇、山梨醇等或其任意組合，其量可以為0.2-100g/L，優(yōu)選0.5-50g/L。例如，穩(wěn)定劑的量可以為0.2g/L、0.3g/L、0.5g/L、0.7g/L、1g/L、2g/L、5g/L、8g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、70g/L、80g/L或100g/L。
防腐劑可以為二氯乙酰胺、咪唑烷基脲、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、亞硝酸鈉、尼泊金酯、PC系列、NaN3等或其任意組合，其量可以為0.05-12g/L、優(yōu)選0.1-10g/L。例如，防腐劑的量可以為0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.5g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L或12g/L。
表面活性劑可以為TWEEN、SPAN、TRITON、EMULGEN系列表面活性劑、膽酸鈉、聚氧乙烯衍生物、月桂醇聚氧乙烯醚、十二烷基磺酸鈉等，其量可以為0.05-30g/L、優(yōu)選0.1-20.0g/L。例如，表面活性劑的量可以為0.05g/L、0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.5g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L、1.5g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、12g/L、15g/L、18g/L、20g/L、25g/L或30g/L。
本發(fā)明試劑盒中的各試劑可以各自獨(dú)立地為液體形式或凍干粉形式。同一試劑組中的試劑可以放置在同一容器中或單獨(dú)放置。
本發(fā)明的試劑盒可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法配制。例如，可以通過將同一試劑組中的試劑混合均勻來配制本發(fā)明試劑盒。
本發(fā)明的試劑盒特別適合用于檢測正在接受或已經(jīng)接受羥苯磺酸鈣和/或酚磺乙胺治療的患者的樣品中的甘油三酯，所述患者例如正在接受或已經(jīng)接受羥苯磺酸鈣和/或酚磺乙胺治療的微血管病、靜脈曲張綜合癥以及與微循環(huán)障礙伴發(fā)額靜脈功能不全、外科手術(shù)出血過多，血小板減少性紫癜或過敏性紫癜以及其他原因引起的出血的患者，所述樣品可以例如是血液。
另一方面，本發(fā)明提供了一種使用上文所述試劑盒檢測樣品中的甘油三酯含量的方法，所述方法包括以下步驟：
(a)將樣品和校準(zhǔn)品分別與所述試劑組1混合并孵育所得的混合物，測定所得混合物的吸光度A1，
(b)將所述試劑組2與經(jīng)孵育的步驟(a)的混合物混合并孵育，測定所得混合物的吸光度A2，
(c)根據(jù)下式計(jì)算甘油三酯濃度，
樣品中甘油三酯濃度＝(A2U-A1U)/(A2C-A1C)*CC
上式中，A2U和A1U分別表示樣品的吸光度A2和A1；A2C和A1C分別表示校準(zhǔn)品的吸光度A2和A1；CC表示校準(zhǔn)品的濃度。
所述“校準(zhǔn)品”指的是已知濃度的甘油三酯的溶液，已知濃度的甘油三酯可以商購獲得，可以將其配置為合適的濃度，例如3-10mmol/L。
在上述方法中，步驟(a)和步驟(b)中的孵育時(shí)間可由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)地確定。例如，孵育時(shí)間可以為2-30分鐘，例如5分鐘、10分鐘或20分鐘。
在一些實(shí)施方式中，所述方法中所檢測的樣品來自正在接受或已經(jīng)接受羥苯磺酸鈣和/或酚磺乙胺治療的患者。
在一些實(shí)施方式中，所述方法中使用的樣品與試劑組1、試劑組2的量的比例為樣品：試劑組1：試劑組2＝1:80:20。例如，樣品、試劑組1和試劑組2的用量可以分別為2μl、160μl和40μl，或者3μl、240μl和60μl。
在另一方面，本發(fā)明提供了DAOS或者包含DAOS的組合物或試劑盒用于降低在利用酶法進(jìn)行的甘油三酯檢測中由樣品中存在的羥苯磺酸鈣和/或酚磺乙胺所造成的干擾的用途。
在另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供了DAOS或包含DAOS的組合物用于制備抗羥苯磺酸鈣和/或酚磺乙胺干擾的甘油三酯測定試劑盒的用途。優(yōu)選地，所述甘油三酯測定試劑盒是根據(jù)本發(fā)明所述的甘油三酯測定試劑盒。
在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的組合物或試劑盒還可以包含抗壞血酸氧化酶。在一些實(shí)施方式中，抗壞血酸氧化酶的量在0.5-8KU/L，優(yōu)選1-5KU/L的范圍內(nèi)?？箟难嵫趸傅牧吭谏鲜龇秶鷥?nèi)時(shí)可以有效地降低羥苯磺酸鈣和/或酚磺乙胺對甘油三酯測定所造成的干擾。在一些實(shí)施方式中，色原的量在0.1-40mmol/L，優(yōu)選0.3-20mmol/L的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，4-氨基安替比林的量在0.1-20g/L，優(yōu)選0.2-10g/L的范圍內(nèi)。當(dāng)采用具有上述優(yōu)選范圍內(nèi)的各組分時(shí)，可以更有效地降低羥苯磺酸鈣和/或酚磺乙胺對甘油三酯測定所造成的干擾。
在一些實(shí)施方式中，在根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中，使用本文中所述的試劑盒。
發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，與使用其他色原的現(xiàn)有技術(shù)相比，當(dāng)使用DAOS或含DAOS的色原來檢測甘油三酯時(shí)，能夠降低羥苯磺酸鈣和酚磺乙胺對甘油三酯檢測的干擾。尤其是當(dāng)DAOS量可以在0.3-20mmol/L的范圍內(nèi)時(shí)，羥苯磺酸鈣和酚磺乙胺的干擾得到明顯降低。
本發(fā)明包括但不限于如下的實(shí)施方式：
實(shí)施方式1.一種甘油三酯測定試劑盒，其包含試劑組1和試劑組2，所述試劑組1包含鎂鹽、三磷酸腺苷、甘油激酶、甘油磷酸氧化酶、過氧化物酶和色原，所述試劑組2包含脂蛋白脂肪酶和4-氨基安替比林，其中，所述色原是或者包含N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺，其中所述色原的量為0.2-40mmol/L，優(yōu)選0.3-20mmol/L。
實(shí)施方式2.根據(jù)實(shí)施方式1所述的甘油三酯測定試劑盒，其中所述4-氨基安替比林的量為0.1-20g/L，優(yōu)選0.2-10g/L。
實(shí)施方式3.根據(jù)實(shí)施方式1或2所述的甘油三酯測定試劑盒，其中所述試劑組1還包含抗壞血酸氧化酶，并且抗壞血酸氧化酶的量在0.5-8KU/L，優(yōu)選1-5KU/L的范圍內(nèi)。
實(shí)施方式4.根據(jù)前述實(shí)施方式中任一項(xiàng)所述的甘油三酯測定試劑盒，其中所述甘油激酶的量為0.1-12KU/L，優(yōu)選0.3-10KU/L。
實(shí)施方式5.根據(jù)前述實(shí)施方式中任一項(xiàng)所述的甘油三酯測定試劑盒，其中所述鎂鹽的量為0.5-40mmol/L，優(yōu)選1-30mmol/L。
實(shí)施方式6.一種使用前述實(shí)施方式中任一項(xiàng)所述的試劑盒檢測樣品中的甘油三酯的方法，所述方法包括以下步驟：
(a)將樣品和校準(zhǔn)品分別與所述試劑組1混合并孵育所得的混合物，測定所得混合物的吸光度A1，
(b)將所述試劑組2與經(jīng)孵育的步驟(a)的混合物混合并孵育，測定所得混合物的吸光度A2，
(c)根據(jù)下式計(jì)算甘油三酯濃度，
樣品中甘油三酯濃度＝(A2U-A1U)/(A2C-A1C)*CC
式中，A2U和A1U分別表示樣品的吸光度A2和A1；A2C和A1C分別表示校準(zhǔn)品的吸光度A2和A1；CC表示校準(zhǔn)品的濃度。
實(shí)施方式7.N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺用于降低在利用酶法進(jìn)行的甘油三酯檢測中由樣品中存在的羥苯磺酸鈣和/或酚磺乙胺所造成的干擾的用途，其中所述色原的量為0.2-40mmol/L，優(yōu)選0.3-20mmol/L。
實(shí)施方式8.N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺用于制備抗羥苯磺酸鈣和/或酚磺乙胺干擾的甘油三酯測定試劑盒的用途，其中所述色原的量為0.2-40mmol/L，優(yōu)選0.3-20mmol/L。
實(shí)施方式9.根據(jù)實(shí)施方式7或8所述的用途，其中使用根據(jù)實(shí)施方式1-5中任意一項(xiàng)所述的甘油三酯測定試劑盒來檢測甘油三酯。
實(shí)施方式10.根據(jù)實(shí)施方式7-9中任一項(xiàng)所述的用途，其中使用N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺測得的樣品中的甘油三酯值與對對照樣品測得的甘油三酯值相比偏差小于10％，優(yōu)選小于8％，更優(yōu)選小于5.5％，最優(yōu)選小于4％，其中所述對照樣品為除不含羥苯磺酸鈣和酚磺乙胺之外，其他均與所述樣品相同的樣品。
在本發(fā)明中，對于一個(gè)方面所描述的特征、實(shí)施方案、優(yōu)選實(shí)施方案同樣適用于本發(fā)明的其他方面。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，組合物、試劑組、試劑盒以及方法用“包含”或“包括”描述。但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所述組合物、試劑組、試劑盒以及方法也可以由基本上由相應(yīng)化合物、試劑或步驟組成或由相應(yīng)化合物、試劑或步驟組成。
除了與本發(fā)明的目的明顯不相容的情況外，本發(fā)明的描述應(yīng)理解為包括本發(fā)明的各種實(shí)施方式或要素的組合，以及它們的替代方式的組合。
具體實(shí)施方式
現(xiàn)將描述實(shí)施本發(fā)明的一些方面的一些說明性且非限制性的實(shí)施例以及對比例。
實(shí)驗(yàn)材料
使用下表1中所示的材料來制備試劑組1和2。
表1：
對比例1：甘油三酯測定試劑盒試劑配制
根據(jù)下表2和下表3中所示的組分和濃度，將各組分混合以分別制備試劑組1和2。
表2：R1配制
表3：R2配制
對比例2：甘油三酯測定試劑盒試劑配制
根據(jù)下表4和下表5中所示的組分和濃度，將各組分混合以分別制備試劑組1和2。
表4：R1配制
表5：R2配制
實(shí)施例1：甘油三酯測定試劑盒試劑配制
根據(jù)下表6和下表7中所示的組分和濃度，將各組分混合以分別制備試劑組1和2。
表6：R1配制
表7：R2配制
實(shí)施例2：甘油三酯測定試劑盒試劑配制
根據(jù)下表8和下表9中所示的組分和濃度，將各組分混合以分別制備試劑組1和2。
表8：R1配制
表9：R2配制
實(shí)施例3：甘油三酯測定試劑盒試劑配制
根據(jù)下表10和下表11中所示的組分和濃度，將各組分混合以分別制備試劑組1和2。
表10：R1配制
表11：R2配制
實(shí)施例4：甘油三酯測定試劑盒檢測方法
1.儀器
具有波長為600nm的全自動(dòng)生化分析儀或半自動(dòng)生化分析儀。
2.參數(shù)設(shè)置及操作
方法：終點(diǎn)法 樣本/試劑：1/100 主波長：600nm
反應(yīng)溫度：37℃ 反應(yīng)時(shí)間：10min 副波長：700nm
樣本測定具體操作方法如表12所示。
表12
單位：微升(μL)
3.計(jì)算公式
ΔA＝A2-A1
式中：
ΔAU――測定樣本吸光度變化值；
ΔAC――校準(zhǔn)品吸光度變化值；
CC――校準(zhǔn)品濃度。
實(shí)施例5：甘油三酯測定試劑盒抗藥物干擾實(shí)驗(yàn)
1.基礎(chǔ)血清準(zhǔn)備：收集健康體檢人員無溶血、無脂濁、無黃疸的新鮮混合血清。
2.干擾樣本配制：
1)將羥苯磺酸鈣水溶液與基礎(chǔ)血清按1：9比例配制成藥物濃度為100mg/L的干擾樣本；對照樣本為生理鹽水與基礎(chǔ)血清按1：9比例配制；不同藥物濃度干擾樣本由100mg/L羥苯磺酸鈣藥物干擾樣本與對照樣本不同比例配制而得；
2)將酚磺乙胺水溶液與基礎(chǔ)血清按1：9比例配制成藥物濃度為250mg/L的干擾樣本；對照樣本為生理鹽水與基礎(chǔ)血清按1：9比例配制；不同藥物濃度干擾樣本由250mg/L酚磺乙胺藥物干擾樣本與對照樣本不同比例配制而得。
3.甘油三酯測定試劑盒經(jīng)校準(zhǔn)后測定干擾樣本，以對照樣本±10％偏差為干擾判斷標(biāo)準(zhǔn)，考察試劑盒抗藥物干擾能力。
結(jié)果如下表13和14所示。
表13：不同的羥苯磺酸鈣濃度對各對比例和實(shí)施例的效果的影響
表14：不同的酚磺乙胺濃度對各對比例和實(shí)施例的效果的影響
從以上結(jié)果可以看出，羥苯磺酸鈣100mg/L、酚磺乙胺250mg/L對本發(fā)明甘油三酯測定試劑盒測定結(jié)果的干擾明顯較低。
實(shí)施例6：實(shí)施例1-3甘油三酯測定試劑盒其他性能評價(jià)
1.準(zhǔn)確度驗(yàn)證：
測定朗道質(zhì)控品(HN1530，批號:918UN；HE1532，批號:764UE)，重復(fù)測定3次，計(jì)算測定值與靶值偏差，并看結(jié)果是否在質(zhì)控范圍內(nèi)。
表15：朗道質(zhì)控品(HN1530)
表16：朗道質(zhì)控品(HN1532)
從以上結(jié)果可以看出，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒得到的測定結(jié)果的平均值位于質(zhì)控范圍內(nèi)，與靶值偏差＜5％，說明本發(fā)明試劑盒準(zhǔn)確性好。
2.重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：
以常規(guī)臨床樣本作為待測樣品，用本發(fā)明實(shí)施例1-3試劑盒重復(fù)測定10次，計(jì)算變異系數(shù)CV％，結(jié)果如下表17所示。
表17：變異系數(shù)測試
由以上結(jié)果可見，本發(fā)明試劑盒變異系數(shù)CV為0.94％、1.00％、0.97％，均明顯＜4％，符合《甘油三酯測定試劑盒(酶法法)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》標(biāo)準(zhǔn)要求。以上結(jié)果說明：根據(jù)本發(fā)明的試劑盒具有非常好的重復(fù)性。
3.線性范圍檢測：
取甘油三酯濃度10.0mmol/L左右的線性樣本，稀釋成5個(gè)不同的濃度(xi)，用本發(fā)明試劑按照檢測方法每個(gè)濃度測定3次，計(jì)算平均值(yi)。以xi為自變量，以yi為因變量求出線性回歸方程，計(jì)算線性回歸相關(guān)系數(shù)r；將xi代入線性回歸方程，計(jì)算yi的估算值及yi與估算值的偏差。
表18：實(shí)施例1-3的線性范圍檢測
從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的試劑盒具有非常優(yōu)異的線性，實(shí)施例1-3分別獲得了0.9998、0.9998和0.9999的線性相關(guān)系數(shù)r。中國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《甘油三酯測定試劑盒(酶法)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》中要求線性相關(guān)系數(shù)r不小于0.9900。以上結(jié)果說明：根據(jù)本發(fā)明的試劑盒的線性區(qū)間完全滿足臨床需求。
實(shí)施例7：與市售試劑盒的對比
在市售試劑盒中，其中試劑1包含100mmol/L的磷酸緩沖液(pH 7.5)、30KU/L的GK、30KU/L的GPO、20mmol/L的ATP、20mmol/L的MgSO4、10KU/L的抗壞血酸氧化酶、2KU/L的過氧化氫酶、30mmol/L的N-(2-羥基-3-磺丙基)-3 5-二甲氧基苯胺鈉鹽、5g/L的Triton X-100、8mmol/L的山梨醇、0.1ml/L的苯甲酸鈉；試劑2包含100mmol/L的磷酸緩沖液(pH 6.5)、50KU/L的LPL、5mmol/L的4-氨基安替比林、10KU/L的過氧化物酶、50mmol/L的氟化鈉、15mmol/L的丙二醇、0.1mL/L的苯甲酸鈉。
按照前文所述方法測試羥苯磺酸鈣和酚磺乙胺對該市售試劑盒效果的影響，結(jié)果如下表19-20所示：
表19：不同的羥苯磺酸鈣濃度對試劑盒效果的影響
表20：不同的酚磺乙胺濃度對試劑盒效果的影響
上述結(jié)果表明，市售試劑盒無法抵抗羥苯磺酸鈣和酚磺乙胺對甘油三酯檢測的干擾。與本發(fā)明獲得的結(jié)果比較，可以看出，本發(fā)明的試劑盒獲得了非常好的抗干擾效果，本發(fā)明的這種抗干擾效果是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所預(yù)料不到的。