本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一株脫氯艾德昂菌及其應(yīng)用，該脫氯艾德昂菌(Ideonella dechloratans)FZJG233能將空氣中游離的氮轉(zhuǎn)為氨對大麥有著明顯的促生作用及對水稻稻瘟病菌具有拮抗作用，可以抑制水稻稻瘟病菌的發(fā)生。

背景技術(shù)：

內(nèi)生固氮菌是一類具有固氮能力的微生物，它的主要宿主是非豆科作物。人們在研究內(nèi)生固氮菌時發(fā)現(xiàn)某些菌類能提供植物高達70%的氮量。發(fā)掘內(nèi)生固氮菌的資源已成為非豆科作物高效利用生物固氮戰(zhàn)略的主攻方向之一。長期以來，為了確保農(nóng)產(chǎn)品獲得高產(chǎn)，人們大量使用化學(xué)肥料和農(nóng)藥，這樣既造成了土壤結(jié)構(gòu)的破壞及環(huán)境的污染，又不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。通過微生物的作用將空氣中游離的氮轉(zhuǎn)為氨，供植物吸收利用，從而促進作物的生長。

從福建農(nóng)林大學(xué)菌草所基地巨菌草根中篩選到具有高固氮酶活性的脫氯艾德昂菌菌株，通過將空氣中游離的氮轉(zhuǎn)為氨，供植物吸收利用，從而促進作物生長具有重要的意義。水稻稻瘟病是危害水稻最為嚴重的三大病害之一，可引起大幅度減產(chǎn)，嚴重時減產(chǎn)40%~50%，甚至顆粒無收。該菌株具有拮抗稻瘟病病菌，從而抑制水稻稻瘟病的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一株脫氯艾德昂菌及其應(yīng)用，提供具有高效固氮酶活性、生長速度快、對環(huán)境適應(yīng)性強的內(nèi)生固氮菌株。通過菌株將空氣中游離的氮轉(zhuǎn)為氨，供作物吸收利用，從而能夠顯著促進大麥等作物生長的菌株。該菌株還具有抑制水稻稻瘟病病菌的作用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明通過采用選擇性培養(yǎng)基在厭氧和好氧培養(yǎng)條件下，利用CCM與NFB兩種選擇性無氮培養(yǎng)基從福建農(nóng)林大學(xué)菌草所基地巨菌草根中進行內(nèi)生固氮菌的分離純化。將分離純化到的內(nèi)生固氮菌株進行活化后，用乙炔還原法和¹⁵N₂同位素標(biāo)記，固氮酶活性為351.21nmol.mL^-1h^-1，15N測定豐度為26.55%，發(fā)現(xiàn)該菌株能夠?qū)⒖諝庵杏坞x的氮轉(zhuǎn)為氨，可作為促生劑對大麥具有明顯的促生長用。該菌株還具有抑制水稻稻瘟病病菌的作用。

本發(fā)明所述的巨菌草固氮菌為艾德昂菌(Ideonella sp. ) FZJG233，已于2016年01月21日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏號為 CGMCC No.12059。地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號 中國科學(xué)院微生物研究所。

本發(fā)明脫氯艾德昂菌具有如下形態(tài)和生理、生化特性：

a、菌體形態(tài)特性

該脫氯艾德昂菌為革蘭氏陽性菌，細胞呈桿狀，大小為(0.6-0.8)×(1.1-1.6) ∽μm。

b、菌落形態(tài)特性

LB瓊脂平板上生長速度較快，菌落圓形（28.5 ℃，生長48小時），表面光滑呈粘液狀，邊緣整齊，乳白色，菌落直徑4-9毫米。最適生長溫度是25-37℃及最佳生長pH值7.0。

c、生理生化特性

以糊精、 D-麥芽糖、D-海藻糖、D-纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖、水蘇糖、棉籽糖、蜜二糖、β-甲酰-D-葡糖苷、D-水楊苷、N-乙酰-D-葡糖胺、α-D-葡糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇

D-葡糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、D-絲氨酸、醋竹桃霉素、利福霉SV 、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-組胺、林肯霉素、硫酸四癸鈉、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖醛酸內(nèi)酯、D-葡糖酸、D-葡糖醛酸、葡糖醛酰胺、粘液酸、奎寧酸、糖質(zhì)酸、萬古霉素、四唑紫、四唑藍、L-乳酸、檸檬酸、L-蘋果酸為碳源的代謝為陽性；以D-絲氨酸、α-酮-戊二酸、亞碲酸鉀、α-羥基-丁酸、α-酮-丁酸、丙酸、甲酸、溴酸鈉 為的碳源的代謝為陰性；pH生長可耐pH5-pH6；耐NaCl的濃度可達8%；明膠液化為陽性；觸酶反應(yīng)為陽性；水解淀粉為陽性；革蘭氏染色為陽性；溶解無機磷的能力為陽性；對稻瘟病菌具有一定的拮抗力。

該菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明具有高效固氮酶活性菌株FZJG233的分子分類地位的確定：

采用細菌16S rRNA基因通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）進行擴增，將PCR產(chǎn)物直接進行序列測定，將獲得的16S rDNA序列輸入GenBank進行比對，初步確定本發(fā)明的菌株FZJG233在分類學(xué)中的種、屬的位置。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的菌株FZJG233，與脫氯艾德昂菌(Ideonella dechloratans )模式菌株NR0261081相似性為99%。16S rRNA基因序列分析，本發(fā)明的脫氯艾德昂菌(Ideonella dechloratans.)應(yīng)歸屬于脫氯艾德昂菌(Ideonella dechloratans)。

本發(fā)明菌種的分離純化方法如下：

將生長于福建農(nóng)林大學(xué)菌草所基地巨菌草的根用蒸餾水洗凈，剪下長度3-5cm根置于滅菌的培養(yǎng)皿中，用3%的雙氧水(H₂O₂)浸泡4min（以除去根、莖、葉表面的腐爛物質(zhì)），無菌水洗滌一次，再用70%乙醇浸泡5min，再用0.1%的HgCl₂浸泡3min，無菌水洗滌7次，每次5-10 min，并將最后一次洗滌液涂布于固體培養(yǎng)基，以檢測消毒是否徹底。將表面消毒完全的根用滅菌剪刀剪碎，分別用滅菌鑷子夾入到3支裝有NFB半固體培養(yǎng)基的試管中，膠塞密封后，至于28℃的細菌培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。待試管中長出菌體后，向管內(nèi)注入1/10體積10%乙炔氣體（終濃度為1%），24 h后，測定固氮酶活性（乙炔還原法）。將具有固氮酶活性的菌株從半固體管中接至相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，平板劃線分離，28℃，濕度為85％條件下，進行厭氧及好氧培養(yǎng)。再挑取單菌落分別接種至半固體培養(yǎng)基試管中，以檢測固氮酶活性，再涂平板直到獲得純的菌株，最后通過鏡檢，進一步觀察其形態(tài)及確定純化與否。純化后的菌株于15%的甘油中-20℃保存。

NFB培養(yǎng)基構(gòu)成: malic acid(蘋果酸) 5.0 g/L，K₂HPO4 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCl₂ 0.02 g/L，0.5% bromthymol blue 2.0 mL/L(先溶解在0.2 N KOH溶液中)，vitamin solution(維生素液) 1.0 mL/L，micronutrient solution(微量元素液) 2.0 mL/L，1.64% Fe-EDTA solution 4.0 mL/L，KOH 4.5 g/L，pH=6.8。其中vitamin solution(維生素液)組成為：biotin(生物素)100.0 mg/L，pyridoxol-HCl(鹽酸吡哆醇，維生素B6) 200.0 mg/L; micronutrient solution(微量元素液)組成為：CuSO₄0.4g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.12 g/L，H₂BO₃ 1.4 g/L, Na₂MoO₄·2H₂O 1.0 g/L，MnSO₄ 1.5 g/L(固體培養(yǎng)基中加入1.7wt.%的瓊脂，半固體培養(yǎng)基中加入0.15-0.25 wt.%的瓊脂)。

本發(fā)明的菌種可作為促生劑以促進大麥及禾本科作物生長。如可將分離純化得到的單菌落采用LB液體培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)48小時，菌液OD600值達0.6時濃度為6×10⁸cfu /mL 的菌液,以接種同樣體積的清水的為對照，每盆大麥澆灌菌液15ml，隔1d后菌液再灌根一次， 15天后與未接種的對照相比，大麥的葉長、根長、鮮重、根重都達到了明顯差異，對大麥有明顯的促生作用。

制備濃度為6×10⁸cfu/mL的菌液的制備過程為：取5mL 培養(yǎng)24h 后的內(nèi)生菌菌液在12000r/min，10min 的條件下離心，用去離子水清洗后再離心，然后將收集的菌體懸浮于0.03M MgSO4 溶液中，并稀釋至所測OD600 為0.6，即得對應(yīng)濃度為6×10⁸cfu/mL的菌液。

本發(fā)明的菌種可作為抑菌劑抑制水稻稻瘟病菌的發(fā)生。

取10μl 過夜培養(yǎng)的內(nèi)生菌菌液滴于PDA培養(yǎng)基的中部，切取0.3 cm×0.3cm 大小培養(yǎng)3-5d 的稻瘟病原菌菌塊于PDA 培養(yǎng)基邊緣一側(cè)，28℃培養(yǎng)1-2d 后，每個培養(yǎng)皿3 種稻瘟病菌，進行對峙培養(yǎng)，每個重復(fù)3 次。培養(yǎng)3-5d 后進行結(jié)果觀察，內(nèi)生菌FZJG233對水稻稻瘟病病原菌具有強拮抗作用。

（三）接種及抑菌效果

本發(fā)明為一株具有高效固氮酶活性的脫氯艾德昂菌。它來源于福建農(nóng)林大學(xué)菌草所基地巨菌草根部，能夠固定空氣中的氮氣，對大麥具有明顯的促生長作用。

本發(fā)明的菌種可作為抑菌劑抑制水稻稻瘟病菌的發(fā)生。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明提供具有高效固氮酶活性、生長速度快、對環(huán)境適應(yīng)性強的內(nèi)生固氮菌株。通過菌株將空氣中游離的氮轉(zhuǎn)為氨，供作物吸收利用，從而能夠顯著促進大麥等作物生長的菌株。該菌株還具有抑制水稻稻瘟病病菌的作用。

附圖說明

圖1 接種脫氯艾德昂菌(Ideonella sp. )FZJG233促進大麥生長，

CK為未接種脫氯艾德昂菌菌株大麥苗，F(xiàn)ZJG415為接種脫氯艾德昂菌菌株FZJG233。

圖2脫氯艾德昂菌(Ideonella sp. )FZJG233抑菌的產(chǎn)生。

具體實施方式

通過下面給出的本發(fā)明的具體接種例可以進一步清楚地理解本發(fā)明。應(yīng)理解此接種例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

菌株的分離鑒定的過程如下：將采集的生長于福建農(nóng)林大學(xué)菌草所基地巨菌草的新鮮根樣本用蒸餾水洗凈，然后剪下根、莖、葉并分別置于已滅菌的三個培養(yǎng)皿中，用3%的雙氧水(H₂O₂)浸泡4min以除去根、莖、葉表面的腐爛物質(zhì)，無菌水洗滌一次，再用0.1%的升汞(HgCl₂)浸泡5min，無菌水中振動洗滌5次，每次5-8min。將表面消毒完全的根、莖、葉用已滅菌手術(shù)刀切碎，分別接種到三支裝有5ml NFB半固體培養(yǎng)基的試管中，膠塞密封后，置于28℃的人工培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。整個操作均在無菌條件下完成。待長出菌體后，向管內(nèi)注入1/10體積10%乙炔氣體（終濃度為1％），在相同條件下再培養(yǎng)24 h，用乙炔還原法測定其固氮酶活性。將具有高固氮酶活性的菌株從半固體管中接至相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，平板劃線分離，28℃，濕度為85％條件下，進行厭氧及好氧培養(yǎng)。再挑取單菌落分別接種至半固體培養(yǎng)基試管中，檢測固氮酶活性，再涂平板直到獲得純的菌株，最后通過鏡檢，進一步觀察其形態(tài)，并確定已純化。

采用細菌16S rRNA基因通用引物27F （5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）進行擴增，將PCR產(chǎn)物直接進行序列測定，將獲得的16S rDNA序列輸入GenBank進行比對，初步確定本發(fā)明的菌株FZJG233在分類學(xué)中的種、屬的位置。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的菌株FZJG233，與脫氯艾德昂菌(Ideonella dechloratans )模式菌株NR0261081相似性為99%。16S rRNA基因序列分析，本發(fā)明的脫氯艾德昂菌(Ideonella dechloratans.)應(yīng)歸屬于脫氯艾德昂菌(Ideonella dechloratans)。

實施例2

將活化得到的單菌落采用LB液體培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液OD₆₀₀值為0.6時，制備濃度為6×10⁸cfu/mL的菌液，以接種同樣體積的清水的為對照，每盆大麥澆灌菌液15ml，隔1d后菌液再灌根一次，15天后與未接種的對照相比，大麥的葉長、根長、鮮重、根重都達到了顯著差異，對大麥有明顯的促生作用。其中葉長增加了26.1%，根增長了21.2%，根重增加了48.2.2%，鮮重增加了100.2.%，干重增加了63.6.%（表1），促大麥生長效果見圖1。

表1 菌株FZJG233接種水稻后的促生效果

實施例3

本發(fā)明的菌種可作為抑菌劑抑制水稻稻瘟病菌的發(fā)生。

取10μl 過夜培養(yǎng)的內(nèi)生菌菌液滴于PDA培養(yǎng)基的中部，切取0.3cm×0.3cm 大小培養(yǎng)3-5d 的稻瘟病原菌菌塊于PDA 培養(yǎng)基邊緣一側(cè)，28℃培養(yǎng)1-2d 后，每個培養(yǎng)皿3 種稻瘟病菌，進行對峙培養(yǎng)，每個重復(fù)3 次。培養(yǎng)3-5d 后進行結(jié)果觀察，內(nèi)生菌FZJG233對水稻稻瘟病病原菌具有拮抗作用（圖2）。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建農(nóng)林大學(xué)

<120> 一株脫氯艾德昂菌及其應(yīng)用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgctggcggc atgccttaca catgcaagtc gaacggtaac gcggggcaac ctggcgacga 60

gtggcgaacg ggtgagtaat gcatcggaac gtgcccagta gtgggggata gcccggcgaa 120

agccggatta ataccgcata cgacctgagg gtgaaagggg gggatcgcaa gacctctcgc 180

tattggagcg gccgatgtca gattaggtag ttggtggggt aaaggcctac caagccgacg 240

atctgtagct ggtctgagag gacgaccagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300

ctacgggagg cagcagtggg gaattttgga caatgggcgc aagcctgatc cagccatgcc 360

gcgtgcggga agaaggcctt cgggttgtaa accgcttttg tcagggaaga aatcttctgg 420

gttaatacct cgggaggatg acggtacctg aagaataagc accggctaac tacgtgccag 480

cagccgcggt aatacgtagg gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgtgcg 540

caggcggttt tgtaagacag aggtgaaatc cccgggctca acctgggaac tgcctttgtg 600

actgcaaggc ttgagtgcgg cagaggggga tggaattccg cgtgtagcag tgaaatgcgt 660

agatatgcgg aggaacaccg atggcgaagg caatcccctg ggcctgcact gacgctcatg 720

cacgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc ctaaacgatg 780

tcaactggtt gttgggaagg ttccttctca gtaacgtagc taacgcgtga agttgaccgc 840

ctggggagta cggccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg 900

tggatgatgt ggtttaattc gatgcaacgc gaaaaacctt acctaccctt gacatggcag 960

gaatcctgaa gagatttggg agtgctcgaa agagaacctg cacacaggtg ctgcatggcc 1020

gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgtgggta agtcccgcac gagcgcaacc cttgtcatta 1080

gttgctacga aagggcactc taatgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140

gacgtcaggt cctcatggcc cttatgggta gggctacaca cgtcatacaa tggccggtac 1200

agagggctgc caacccgcga gggggagcca atcccagaaa accggtcgta gtccggatcg 1260

cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc agcttgccgc 1320

ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag cgggttctgc 1380

cagaagtagt tagcctaacc gcaaggaggg cgattaccac ggcagggttc gtgactgggg 1440

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtttgat cctggctca 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19