本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體涉及一種腫瘤相關(guān)基因NRAS基因突變檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：NRAS基因是RAS癌基因家族的成員，定位于1號染色體，基因全長85kb，哺乳動物RAS基因家族包括c-Hras1、c-K-ras2及N-ras基因。ras基因家族編碼含188-189個氨基酸殘基，分子量為21KD的蛋白即P21蛋白，其氨基酸序列高度保守，僅有C末端40個氨基酸的差異。RAS蛋白具有GTP/GDP結(jié)合的能力及GTP酶活性，它們的正常功能為G蛋白類似的調(diào)節(jié)蛋白，具有從膜結(jié)合受體到腺苷酸環(huán)化過程的信號傳導(dǎo)作用，參與細(xì)胞周期的正常調(diào)控。RAS基因活化主要是通過（1）編碼區(qū)內(nèi)的點突變；（2）插入激活；突變激活RAS基因家族主要是以點突變?yōu)橹?。突變的RAS蛋白失去內(nèi)在的GTP酶活性使ras蛋白維持于活化狀態(tài)，不斷激活靶分子，引起信號傳導(dǎo)的持續(xù)效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞大量增殖，從而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。目前研究表明，N-ras基因突變在ras基因突變中出現(xiàn)的頻率最高，以第12、13、61或146密碼子突變最為常見，其常見突變位點有Codon12:G12A,G12C,G12D,G12R,G12S,G12V；Codon13:G13A,G13C,G13D,G13R,G13S,G13V；Codon61:Q61E,Q61H,Q61K,Q61L,Q61P,Q61R；Condon146：A146K。N-ras突變主要發(fā)生于骨髓增生異常綜合癥（MDS)、黑色素瘤、肝癌、急性髓系白血?。ˋML）等。國外研究發(fā)現(xiàn)RAS基因突變在MDS檢出率可達(dá)20%-50%不等，ras基因突變與MDS預(yù)后的關(guān)系密切相關(guān)，這種預(yù)后關(guān)系現(xiàn)在研究傾向與該基因突變與MDS進(jìn)展為AML密切相關(guān)，基因突變導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定，導(dǎo)致預(yù)后差及生存期短。PaduaRA,GuinnBA10等通過對75名MDS患者進(jìn)行10年隨訪研究發(fā)現(xiàn)ras基因突變率為36%，攜帶ras基因突變者向急性白血病轉(zhuǎn)化的風(fēng)險較陰性者顯著提高。FernandezT等采用聚合酶鏈反應(yīng)-寡核苷酸探針雜交技術(shù)分析了巴西人群50例MDS患者發(fā)現(xiàn)21例患者存在N-ras基因點突變（42%），其中9例發(fā)展為急性白血病，對N-ras基因點突變和染色體異常相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)8號染色體三體可能和N-ras基因點突變相關(guān)，這部分病人在隨訪過程中均進(jìn)展為急性髓系白血病。FenauxP等認(rèn)為10%的MDS患者在診斷初即可表現(xiàn)為N-ras基因突變陽性，30%-40%的患者隨著疾病進(jìn)展出現(xiàn)N-ras基因突變。N-ras基因在惡性黑色素瘤中的突變率為13%-25%，NRAS基因與黑色素瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)性，隨著黑色素瘤細(xì)胞的增殖，細(xì)胞內(nèi)NRASmRNA和蛋白表達(dá)量均顯著提高。研究證明攜帶N-ras或V600BRAF基因突變的晚期黑色素瘤患者可以從BRAF抑制劑治療中獲益。然而，對于BRAF野生型腫瘤患者（包括攜帶NRAS變異基因的患者）來說就不存在靶向治療。意大利國立腫瘤研究機構(gòu)的PaoloAAscierto等針對上述問題進(jìn)行了相關(guān)研究，他們的Ⅱ期臨床試驗研究發(fā)現(xiàn)，對于N-ras基因變異的黑色素瘤患者，一種小分子MEK1/2抑制劑——MEK162是第一個有效的靶向治療藥物，且可能為幾乎無有效治療方法的癌癥患者提供一種新的治療選擇。NRAS基因突變的檢測主要有Sanger測序法、ARMS、RT-PCR等。其中RT-PCR技術(shù)采用等位基因特異性擴(kuò)增法對樣本的基因突變進(jìn)行區(qū)分，該方法成本較低，但檢測率較高，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果；ARMS技術(shù)是目前國內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，但只能檢測已知的位點，且要將樣本分成多個管進(jìn)行實驗才能實現(xiàn)分型，對樣本量要求高；而Sanger測序法是DNA序列分析的經(jīng)典方法，最直接的、可檢測已知和未知突變的一種方法。由于該方法可直接讀取DNA的序列，因此被認(rèn)為是基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，其主要優(yōu)點是測序長度較長，可發(fā)現(xiàn)新的變異位點，包括一些新的少見的突變形式及突變的確切類型，如點突變、片段缺失。所以探索一種Sanger測序法檢測NRAS基因的技術(shù)具有重要的臨床意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決上述問題，提供一種NRAS基因突變檢測試劑盒，可直接利用含人體某組織部位的石蠟包埋樣本通過Sanger測序法檢測出樣本中NRAS基因主要突變位點型別，檢測位點包括NRAS基因2、3和4三個外顯子的主要突變位點，包括但不限于2號外顯子上c.34G>A，p.G12S突變位點；3號外顯子上c.181C>A，p.Q61K突變位點；4號外顯子上c.436G>A，p.A146T突變位點。本發(fā)明的NRAS基因突變檢測試劑盒具體包括：（1）用于擴(kuò)增樣本中NRAS基因Exon2、3和4三個外顯子的特異性引物，具體序列如下:（2）用于測序PCR的測序引物，分別用于對NRAS基因2、3和4三個外顯子進(jìn)行測序分析，具體序列如下：外顯子名稱序列號Reverse5’-3’2SEQ-N2SEQIDNo.7TAGATGTGGCTCGCCAATTAAC3SEQ-N3SEQIDNo.8TGCATTCCCTGTGGTTTTTAAT4SEQ-N4SEQIDNo.9CCCAGCCTAATCTTGTTTTTCT（3）3個裝有NRAS野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒按1:1質(zhì)量比例混合的陽性質(zhì)控品管和1個裝有PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管；其中突變型質(zhì)粒分別是2號外顯子上c.34G>A，p.G12S突變位點；3號外顯子上c.181C>A，p.Q61K突變位點；4號外顯子c.436G>A，p.A146T突變位點；PCR反應(yīng)預(yù)混液由以下組份組成：組份體積（μl）10PCRbuffer2.55Qsolution525mMMgCl21.525mMdNTPs0.4H2O10.35其中10×PCRbuffer中含有500mMKCl，100mMTris-HCl(pH8.3)，100mM(NH4)2SO4，和15mMMgCl2；5×Qsolution中含有1MTricine[pH8.7(withKOH)]，8%(v/v)Glycerol和5%(v/v)DMSO；25mMdNTPs中含有25mMdATPs、25mMdTTPs、25mMdCTPs和25mMdGTPs。本試劑盒主是根據(jù)NRAS基因2、3和4三個外顯子的保守序列分別設(shè)計NRAS基因三個外顯子的特異性引物，分別將Exon2、3和4三個外顯子使用PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增，純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明的各種引物長度在20-25個堿基之間，無特殊修飾。反應(yīng)液預(yù)混液采用獨特的配方及比例。不同外顯子的PCR擴(kuò)增條件一致，且能在樣本濃度較低時檢測到目的基因，結(jié)果無非特異性擴(kuò)增。具體操作流程包括：（1）引物設(shè)計：利用引物設(shè)計軟件，如PrimerPremier5，從NRAS基因DNA序列中挑選特定的序列，然后根據(jù)堿基互補特點，設(shè)計NRAS基因2、3和4三個外顯子的特異性引物，用于擴(kuò)增樣本中DNA。測序引物的設(shè)計與用于擴(kuò)增樣本中DNA的特異性引物的設(shè)計類似，不過測序引物只需要一段即可，引物序列分別是SEQIDNOs：1-9。長度在20-25個堿基左右（2）PCR擴(kuò)增：利用試劑盒中含特定序列的引物PCR擴(kuò)增臨床樣本中的DNA。（3）瓊脂糖凝膠電泳及膠回收：將擴(kuò)增得到的目的基因NRAS基因2、3和4三個外顯子片段回收用于測序。附圖說明以下是附圖的說明，以便于理解上述發(fā)明的目的和具體特征。圖1為NRAS基因的Exon2、3和4三個外顯子的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖1中各標(biāo)號的具體表示如下：2：NRAS基因第2號外顯子；3：NRAS基因第3號外顯子；4：NRAS基因第4號外顯子；M：DNAmaker，從上到下大小依次為2000、1000、750、500、250和100。圖2-1為NRAS基因的Exon2外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為野生型。圖2-2為NRAS基因的Exon2外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為突變體。圖2-3為NRAS基因的Exon3外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為野生型。圖2-4為NRAS基因的Exon3外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為突變體。圖2-5為NRAS基因的Exon4外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為野生型。圖2-6為NRAS基因的Exon4外顯子的測序結(jié)果截圖，測序結(jié)果為突變體。具體實施方式1、引物設(shè)計根據(jù)NRAS基因在結(jié)直腸癌等疾病中的突變情況及個體化治療后產(chǎn)生的耐藥機制，利用引物設(shè)計軟件，如PrimerPremier5，從NRAS基因DNA序列中挑選特定的序列，然后根據(jù)堿基互補特點，設(shè)計NRAS基因Exon2、3和4三個外顯子的特異性引物，用于擴(kuò)增樣本中DNA。引物序列分別是SEQIDNos：1-6。測序引物的設(shè)計與用于擴(kuò)增樣本中DNA的特異性引物的設(shè)計類似，不過測序引物只需要一段即可，引物序列分別是SEQIDNos：7-9。長度在20-25個堿基。2、PCR擴(kuò)增2.1、質(zhì)控品準(zhǔn)備陽性質(zhì)控品為NRAS野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒按1:1質(zhì)量比例混合的混合物，陰性質(zhì)控品為無菌水。使用前室溫融化，旋渦振蕩10秒，瞬時離心10秒。2.2、試劑配制提前將試劑取出，室溫融化，旋渦振蕩10秒，瞬時離心10秒。確定反應(yīng)數(shù)N，N=待檢樣本數(shù)（n）×3+質(zhì)控品數(shù)+1。計算加到反映混合物中的各個試劑的量，計算如下：組分PCRmix3（即PCR反應(yīng)預(yù)混液）Taq酶體積（μl）19.75×N0.25×N取一個滅菌離心管配制上述反應(yīng)體系，試劑全部加入后旋渦振蕩10秒，瞬時離心。然后將上述混合液按20μl/管分裝至PCR反應(yīng)管中。2.3、加樣將NRAS陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和樣本DNA分別取2.5μl加入到PCR反應(yīng)管中，其中樣本要稀釋至20ng/μl；然后再將相應(yīng)的引物加入到對應(yīng)的PCR反應(yīng)管中，每個樣本需要引物各加1.25μl，同時作好標(biāo)記，蓋緊管蓋后，瞬時離心15秒，將管壁上的液體全部甩至管底，消除氣泡，可重復(fù)離心至氣泡完全消除。然后立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。2.4、PCR擴(kuò)增配置完成后，將PCR管放入PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序如下：3、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳及回收由于PCR產(chǎn)物長度較短，配制2%（w/w）的瓊脂糖凝膠；電泳條件為120V，20min。電泳完成后，取出凝膠，使用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，并記錄擴(kuò)增條帶情況。如果PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果良好，即可回收目的片段用于測序?；厥盏玫降漠a(chǎn)物即可用于測序。序列表<110>廣州凱普醫(yī)藥科技有限公司<120>NRAS基因突變檢測試劑盒<160>9<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx2-F<400>1tagatgtggctcgccaattaac22<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx2-R<400>2gaatatgggtaaagatgatccgac24<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx3-F<400>3tgcattccctgtggtttttaat22<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx3-R<400>4cctttcagagaaaataatgctcct24<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx4-F<400>5cccagcctaatcttgtttttct22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>NRASEx4-R<400>6cacaaatgctgaaagctgtacc22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-N2<400>7tagatgtggctcgccaattaac22<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-N3<400>8tgcattccctgtggtttttaat22<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-N4<400>9cccagcctaatcttgtttttct22當(dāng)前第1頁1 2 3