本發(fā)明屬于生物制劑領(lǐng)域，尤其涉及一種活性低分子量海洋硫酸多糖的制備方法。

背景技術(shù)：

天然海洋硫酸多糖聚合度高，粘度大，導(dǎo)致人體吸收性差，生物活性低。然而，將天然海洋硫酸多糖降解成低分子海洋硫酸多糖后，則具有抗凝血、抗癌、抗病毒等多種生物活性，可用于生物醫(yī)藥、保健食品等產(chǎn)品開發(fā)。例如，水解后的巖藻聚糖(390-2200kDa)比天然巖藻聚糖(5100kDa)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗癌活性(Chen et al.,2008)；王瑩等(2013)將低分子量巖藻聚糖作用于小鼠氧化損傷的動(dòng)物模型，其抗氧化能力顯著高于未降解的巖藻聚糖。因此，高效降解海洋硫酸多糖是當(dāng)前產(chǎn)業(yè)化開發(fā)海洋硫酸多糖亟待解決的關(guān)鍵技術(shù)難題。

目前，海洋硫酸多糖降解方法主要有化學(xué)降解法、生物降解法和物理降解法。(1)化學(xué)降解法：采用酸、堿水解法及氧化法等化學(xué)降解法制備低分子海洋硫酸多糖是目前國(guó)內(nèi)外普遍采用的方法。這些方法雖然能夠降低海洋硫酸多糖的分子量，但化學(xué)反應(yīng)強(qiáng)烈，其后果是改變了多糖的立體結(jié)構(gòu)，同時(shí)引起硫酸基團(tuán)的部分脫落，最終降低了產(chǎn)品的生物活性甚至活性完全喪失。例如，吳永沛等(2007)在80℃的水浴條件下用0.2mol/L的HCl對(duì)從海帶中提取的巖藻聚糖進(jìn)行降解，4h后產(chǎn)物中便已有49.58％低聚糖片段的分子量低于3kDa，但硫酸根保留率僅為19.80％，且水解時(shí)間越長(zhǎng)，硫酸根脫落的越嚴(yán)重。(2)生物降解法：生物降解法主要是利用酶的高效催化，是當(dāng)前研究最多的方法。比如專利ZL200710008673.1采用酸法和酶法(蛋白酶和果膠酶)制備低分子量巖藻聚糖，得到分子量1000-5000Da的巖藻聚糖的方法；此方法在一定程度上能夠?qū)崿F(xiàn)高分子巖藻聚糖的低聚化，但專一性較差，產(chǎn)率較低，且酸降解的過(guò)程對(duì)硫酸根也存在一定程度的破壞。專利ZL201310572750.1采用β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶水解巖藻聚糖的方法。此方法雖然能夠有效水解巖藻聚糖，但β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的價(jià)格高，導(dǎo)致產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)低分子巖藻聚糖的成本高昂。(3)物理降解法：物理降解法具有無(wú)酸堿或酶等化學(xué)試劑的添加，降解后不需要純化等優(yōu)勢(shì)。例如，采用超聲波法降解馬尾藻巖藻聚糖，可使其分子量迅速下降，降解后多糖中的硫酸基團(tuán)含量基本沒有變化甚至有所升高(陳亞靜等，2012)；然而，超聲降解必須將巖藻聚糖溶解于水中，且有嚴(yán)格的濃度要求，生產(chǎn)效率低。Choi等(2013)采用γ-輻照降解巖藻聚糖可使其分子量降至7kDa，且硫酸基團(tuán)含量基本不變，同時(shí)，降解后的巖藻低聚糖的抗癌活性明顯提高。輻照降解巖藻聚糖雖然高效，但對(duì)安全性要求極高，存在輻射殘留等缺陷，推廣困難。專利ZL2010105373166采用高壓水蒸汽法降解海洋硫酸多糖，實(shí)現(xiàn)了零添加降解硫酸多糖，保證了安全性。然而，同樣受多糖溶解性的限制，多糖水溶的濃度最大為20％，并需要后續(xù)干燥等加工環(huán)節(jié)。

紅外加熱技術(shù)是利用其輻射傳熱形式，由電磁波傳遞能量，使物體內(nèi)部分子和原子發(fā)生“共振"使物體溫度升高，達(dá)到加熱目的。采用紅外降解海洋硫酸多糖，不僅不需要添加任何化學(xué)或生物制劑，減少了后續(xù)純化工藝步驟；以固體粉末狀態(tài)進(jìn)行降解，加工時(shí)間短，無(wú)需后續(xù)的濃縮、干燥等單元操作，具有低成本、綠色環(huán)保的優(yōu)勢(shì)，是產(chǎn)業(yè)化降解海洋硫酸多糖的理想方法。然而，尚未見相關(guān)技術(shù)在制備低分子多糖，特別是在制備低分子海洋硫酸多糖中的應(yīng)用。有鑒于此，本發(fā)明人研究和設(shè)計(jì)了一種紅外降解海洋硫酸多糖的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種高效環(huán)保型的低分子海洋硫酸多糖的生產(chǎn)工藝。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種紅外降解海洋硫酸多糖的方法，包括以下步驟：

將海洋硫酸多糖干粉平鋪在潔凈的不銹鋼托盤上，其厚度為0.1-0.2cm，然后放入裝有2200w紅外燈的干燥箱中，保證紅外燈距離巖藻聚糖粉末的高度為10-30cm，打開紅外干燥箱開關(guān)，加熱2-16h，即得到不同粘度值的低分子海洋硫酸多糖干粉。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述海洋硫酸多糖來(lái)源于海洋褐藻，包括海帶、裙帶菜、羊棲菜、鼠尾藻。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述海洋硫酸多糖來(lái)源于海洋動(dòng)物，包括海參硫酸軟骨素、鯊魚硫酸軟骨素、海參巖藻聚糖或鮑魚硫酸多糖。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述的低分子海洋硫酸多糖具有抗菌活性。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述經(jīng)紅外加熱16h的低分子海洋硫酸多糖經(jīng)溶解后，過(guò)分子截留量為80000Da的超濾膜，分子量<80000Da的海洋硫酸多糖的比例達(dá)到了78.43％。

與現(xiàn)有的降解硫酸多糖的方法相比，本發(fā)明采用紅外加熱法降解海洋硫酸多糖具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)不引入任何化學(xué)及生物制劑，綠色環(huán)保，減少了后續(xù)的純化工藝；(2)以干粉狀態(tài)進(jìn)行降解，不受多糖溶解性限制，生產(chǎn)效率高，減少了溶解、干燥等單元操作；(3)操作簡(jiǎn)便，設(shè)備簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低；(4)具有很好的生物活性，經(jīng)紅外降解16h后得到的低分子海帶巖藻聚糖顯示了良好的抑菌活性，1.0重量％濃度的低分子海帶巖藻聚糖對(duì)大腸桿菌的抑菌率達(dá)到了100％。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明所涉及的紅外降解海帶巖藻聚糖的粘度值變化；

圖2是本發(fā)明所涉及的未降解海帶巖藻聚糖的抑菌效果；

圖3是本發(fā)明所涉及的紅外降解海帶巖藻聚糖的抑菌效果。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：

將100g海帶巖藻聚糖干粉平鋪在潔凈的不銹鋼托盤上，其厚度為0.1cm，然后放入裝有2200w紅外燈的干燥箱中，紅外燈距離海帶巖藻聚糖粉末的高度為10cm，打開紅外干燥箱開關(guān)，加熱2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h，即得到相對(duì)粘度值分別為84.3％、65.2％、61.3％、57.6％、44.8％、36.2％、21.4％的低分子海帶巖藻聚糖干粉。如圖1所示。

實(shí)施例2：

將100g海參巖藻聚糖干粉平鋪在潔凈的不銹鋼托盤上，其厚度為0.15cm，然后放入裝有2200w紅外燈的干燥箱中，紅外燈距離海參巖藻聚糖粉末的高度為20cm，打開紅外干燥箱開關(guān)，加熱2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h，即得到相對(duì)粘度值分別為81.7％、59.2％、55.3％、50.2％、42.1％、33.5％、18.2％的低分子海參巖藻聚糖干粉。

實(shí)施例3：

將100g鯊魚硫酸軟骨素干粉平鋪在潔凈的不銹鋼托盤上，其厚度為0.2cm，然后放入裝有2200w紅外燈的干燥箱中，紅外燈距離鯊魚硫酸軟骨素粉末的高度為30cm，打開紅外干燥箱開關(guān)，加熱2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h，即得到相對(duì)粘度值分別為85.6％、70.1％、65.2％、60.4％、46.3％、39.9％、26.4％的低分子鯊魚硫酸軟骨素干粉。

實(shí)施例4：低分子海帶巖藻聚糖的抗菌活性

本發(fā)明為了驗(yàn)證所制備的低分子海洋硫酸多糖具有生物活性，采用平板涂布法評(píng)價(jià)了所得低分子海洋硫酸多糖的抑菌活性。本實(shí)驗(yàn)所涉及的大腸桿菌(Escherichia coli)菌株(菌種編號(hào)為ACCCNO.01623，保藏日期為2006年5月22日)由中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.實(shí)驗(yàn)方法

a.按實(shí)施例1的方法，制備低分子海帶巖藻聚糖。

b.準(zhǔn)確稱取一定量的低分子海帶巖藻聚糖(步驟a制得)及未經(jīng)降解的海帶巖藻聚糖分別配制濃度為6.0重量％的多糖水溶液，備用。

c.培養(yǎng)基的配制

采用雙層培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌。按質(zhì)量百分比，培養(yǎng)基的配方如下：

底層培養(yǎng)基：蛋白胨1重量％，牛肉提取物0.3重量％，Nacl 0.5重量％，瓊脂1.5重量％，配好后用4.0mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至7.0～7.2，121℃高溫滅25min，得底層培養(yǎng)基。

上層培養(yǎng)基：蛋白胨1重量％，牛肉提取物0.3重量％，Nacl 0.5重量％，瓊脂1重量％，配好后用4.0mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至7.0～7.2，121℃高溫滅25min，得上層培養(yǎng)基。

d.菌懸液的制備

用滅過(guò)菌的接種環(huán)挑取已經(jīng)活化的待測(cè)菌，放入裝有10mL滅過(guò)菌的去離子水的試管中，充分震蕩搖勻，逐步稀釋至細(xì)菌濃度約為10⁶-10⁸cfu/mL。

e.抗菌活性的檢測(cè)

將步驟b配制的海帶巖藻聚糖水溶液分別加到滅菌后的培養(yǎng)基中混合均勻，使其最終濃度為1重量％，之后倒入平板中進(jìn)行冷卻。冷卻后用無(wú)菌吸管吸取稀釋倍數(shù)為10^-4的菌懸液100μL于培養(yǎng)基中，并用無(wú)菌涂布棒將菌懸液在平板上涂抹均勻，平放20min后在37℃條件下恒溫倒置培養(yǎng)24h，培養(yǎng)好后進(jìn)行拍照。其中以培養(yǎng)基中未加巖藻聚糖的作為陰性對(duì)照，加未降解巖藻聚糖的作為空白對(duì)照。采用菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算抑制率。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

表1 1％濃度下不同紅外降解時(shí)間的海帶巖藻聚糖的抗菌活性

本實(shí)施例對(duì)比了紅外降解前后以及不同降解時(shí)間的海帶巖藻聚糖的抗菌活性，結(jié)果表明，未經(jīng)降解的海帶巖藻聚糖對(duì)大腸桿菌沒有抑菌活性，如圖2所示；當(dāng)海帶巖藻聚糖經(jīng)2200w的紅外燈降解2h-16h后，海帶巖藻聚糖顯示了抗菌活性，且隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，抗菌活性越好。當(dāng)降解時(shí)間達(dá)到16h時(shí)，在1.0重量％濃度下，海帶巖藻聚糖對(duì)大腸桿菌的抑菌率達(dá)到了100％，如圖3所示。說(shuō)明經(jīng)本發(fā)明方法降解的海洋硫酸多糖具有生物活性。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。