本發(fā)明屬于棉花育種領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉花新品系的培育方法。
背景技術(shù)：
棉花是錦葵科棉屬植物的種籽纖維，原產(chǎn)于亞熱帶。植株灌木狀，在熱帶地區(qū)栽培可長(zhǎng)到6米高，一般為1到2米?；ǘ淙榘咨_(kāi)花后不久轉(zhuǎn)成深紅色然后凋謝，留下綠色小型的蒴果，稱為棉鈴。棉鈴內(nèi)有棉籽，棉籽上的茸毛從棉籽表皮長(zhǎng)出，塞滿棉鈴內(nèi)部，棉鈴成熟時(shí)裂開(kāi)，露出柔軟的纖維。纖維白色或白中帶黃，長(zhǎng)約2至4厘米，含纖維素約87～90％，水5～8％，其他物質(zhì)4～6％。
棉花苗期蟲(chóng)害較為嚴(yán)重，靠棉花為生的最具破壞性的昆蟲(chóng)物種有玉米果穗螟蛉或棉鈴蟲(chóng)、美洲棉鈴蟲(chóng)、煙青蟲(chóng)等。不同的危害時(shí)間和危害方式，給棉苗生長(zhǎng)帶來(lái)較大影響，也對(duì)田間防治帶來(lái)一定難度。害蟲(chóng)的發(fā)生有的傳播病毒、有的影響棉長(zhǎng)推遲發(fā)育，還有的失去生長(zhǎng)點(diǎn)變成公棉花、或是斷莖造成無(wú)頭棵。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉花新品系的培育方法。
為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉花新品系的培育方法，包括以下步驟：
A.以棉鈴蟲(chóng)蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子HaHR3為靶標(biāo)基因，篩選出HaHR3的干擾片段并構(gòu)建HaHR3的植物表達(dá)干擾載體；
B.將步驟A獲得的HaHR3的植物表達(dá)干擾載體導(dǎo)入湘雜棉19號(hào)的父本中，進(jìn)行卡拉霉素篩選，篩選出陽(yáng)性株進(jìn)行繁殖。
進(jìn)一步，步驟B中，采用花粉管通道法將步驟A獲得的HaHR3的植物表達(dá)干擾載體導(dǎo)入湘雜棉19號(hào)的父本中。
進(jìn)一步，步驟B中，篩選出陽(yáng)性株進(jìn)行南繁。
進(jìn)一步，步驟B所述卡拉霉素篩選的具體過(guò)程為：在棉花四葉期后到現(xiàn)蕾期前，用硫酸卡拉霉素溶液，涂抹于棉株頂端完全展開(kāi)的葉，3-4天后觀察葉片顏色，變黃表明該株棉花為陰性株，不變黃表明該株棉花為陽(yáng)性株。
進(jìn)一步，所述硫酸卡拉霉素溶液的濃度為3000ppm。
本發(fā)明的有益效果在于：
本申請(qǐng)所述方法得到的棉花新品系的抗蟲(chóng)性好，為農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治和植物保護(hù)技術(shù)提供了新的選項(xiàng)，為利用RNAi來(lái)防治棉鈴蟲(chóng)及其它農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。同時(shí)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請(qǐng)所述方法得到的棉花新品系的由圓錐形突變?yōu)槁褕A形，鈴殼顯著變薄，吐絮由原來(lái)的不暢不好檢花到吐絮暢好撿花。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。
實(shí)施例1
以棉鈴蟲(chóng)蛻皮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子HaHR3為靶標(biāo)基因，篩選出HaHR3的干擾片段并構(gòu)建HaHR3的植物表達(dá)干擾載體，此部分工作內(nèi)容委托植物保護(hù)研究所完成。具體為：1)根據(jù)靶標(biāo)基因HaHR3mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，分別設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增得到靶標(biāo)基因的4個(gè)不同干擾片段，共構(gòu)建了4個(gè)dsRNA原核表達(dá)載體。2)分別將不同的dsRNA原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變菌株HT115，并通過(guò)誘導(dǎo)使靶標(biāo)基因HaHR3不同片段dsRNA得到成功表達(dá)并鑒定。3)以dsRNAs飼喂棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)一周后，生測(cè)觀察到處理組棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)死亡率，dsRNA-Frag.1的平均死亡率為36.22％；其它處理組的死亡率約為～30.00％，均與對(duì)照組存在顯著性差異；熒光定量PCR結(jié)果表明，昆蟲(chóng)取食不同處理組dsRNA48h后，在轉(zhuǎn)錄水平上均能有效沉默靶標(biāo)基因HaHR3。
實(shí)施例2
將實(shí)施例1獲得的HaHR3的植物表達(dá)干擾載體采用花粉管通道法導(dǎo)入湘雜棉19號(hào)的父本中，2013年在湖南省棉花科學(xué)研究所茅灣試驗(yàn)地進(jìn)行卡拉霉素篩選(具體過(guò)程為：在棉花四葉期后到現(xiàn)蕾期前，用濃度為3000ppm的醫(yī)用硫酸卡拉霉素溶液，涂抹于棉株頂端完全展開(kāi)的葉，3-4天后觀察葉片顏色，變黃表明該株棉花為陰性株，不變黃表明該株棉花為陽(yáng)性株)，篩選出26個(gè)陽(yáng)性株，同年對(duì)26個(gè)陽(yáng)性單株進(jìn)行南繁，用卡拉篩選出19個(gè)陽(yáng)性單株；2014年在湖南省棉花科學(xué)研究所茅灣試驗(yàn)地種植19個(gè)陽(yáng)性株系(13N85-1，13N85-2，13N85-3……13N85-19)，同時(shí)與受體材料F15進(jìn)行了抗蟲(chóng)性、農(nóng)藝性狀的比較試驗(yàn)，每個(gè)材料種植1壟(30株)，成熟期調(diào)查單株鈴數(shù)，室內(nèi)考種考查衣分、單鈴重，棉樣送農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心測(cè)定纖維品質(zhì)。
表1 F15及19個(gè)陽(yáng)性單株抗蟲(chóng)性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
與F15相比，棉鈴?fù)庑斡蓤A錐形突變?yōu)槁褕A形，鈴殼顯著變薄；吐絮由原來(lái)的不暢不好檢花到吐絮暢好撿花。F15及19個(gè)陽(yáng)性單株綜合農(nóng)藝形狀實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下表所示：
表2 F15及19個(gè)陽(yáng)性單株綜合農(nóng)藝形狀實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。